Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Özet

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Özet

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

Giriş

Substantia nigra gelen dopaminerjik nöronların kaybı compacta Parkinson Hastalığı (PH), ikinci en yaygın nörodejeneratif bozukluk kardinal motor belirtiler neden pars. Bu mezensefalik nöronal nüfusun ölümü yatan nedeni bilinmemektedir. Kullanılmıştır geliştirilmesi ve nörofizyolojik özellikleri ve mesDA nöron, bir kaç hücre kültürü ve hayvan modeli sistemlerinde hayatta modüle edilmesi için sorumlu biyokimyasal yollar incelenmesi. Sıçan dopaminerjik hücre çizgisi 1RB _{3, 27} (N27), insan dopaminerjik nöroblastoma hücre çizgisi SH-SY5Y, MN9D ve insan mezensefalik hücreleri LUHMES fare dopaminerjik melez hücre hattı olmak üzere ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri, biyokimyasal ve sınırlı mekanik çalışmalar ¹ kullanılmaktadır ^-5. MesDA nöronların spesifik kaybı çalışmada, birkaç nörotoksin bazlı ve genetik modeller ^6-8 geliştirilmiştir. Primer ventral orta beyin kültürlerDopaminerjik nöronlarının nöronal ve sinaptik özellikleri ve bu ortak hastalık patojenezinde rol yolları çalışmak için vazgeçilmez bir araç sağlar.

Burada daha yüksek yaşama şansına sahiptir her embriyo için lamelleri verim artışı ile sonuçlanan değişiklikleri içeren mezensefalik dopaminerjik nöronların izolasyonu için detaylı bir protokol mevcut. Önceden olgun E12.5 fare mezensefalona (sıçan E14.5) kullanımı beka geliştirir. Bu yaşta nöronlar diseksiyonu sırasında sağlam hücreleri bırakır, henüz akson geliştirilen ve böylece önemli ölçüde canlılığını arttırarak stresi en aza indirir değil. Ayrıca, bu protokolün 2. bölümünde açıklandığı gibi ventral orta beyindeki dikkatli diseksiyon, daha beka geliştirir. Embriyo başına lamelleri sayısını artırmak için, alternatif bir kaplama yöntemi, bu protokolün 4. bölümde sunulmuştur. Bu altında 4 lamelleri ile karşılaştırıldığında embriyo başına en fazla 10 lamelleri bir ürün verimine yol açarStandart kaplama koşulları dolayısıyla deney başına hayvan miktarını azaltarak.

Akson ve dentrites kültür sergi akıbet nöronlar, sinaptik bağlantıları oluşturmak ve canlı hücre görüntüleme, İmmünositokimya'da ve elektrofizyolojik çalışmalar için bu kültürlerin uygun hale nöronal ve sinaptik belirteçlerinin varlığını ortaya koymaktadır. Ayrıca, sinir hücresi kültürlerinde kullanılması genetik ve farmakolojik manipülasyonunu daha da kolaylaştırır. In vitro olarak 2 gün itibaren dışa doğru büyümesini geliştirme çalışmaları sağlar. Ayrıca, kültür uzun dönem hayatta kalmaları (en fazla altı hafta) bu nöronların yavaş ilerleyici dejenerasyonu çalışma için uygun hale getirmektedir.

Protokol

NOT: hayvanlar muhafaza ve onaylanan kurumsal kurallar ve tüm hayvan prosedürlere uygun ele Imperial College'ın Hayvan Refahı tarafından edildi ve Etik İnceleme Vücut (AWERB) ve Ev Ofis ve Harvard Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), Federal ve eyalet yönetmeliklerine uygun olarak.

1. Reaktif ve Ekipmanları Kurulum

1. Çözülme, kısım ve -80 ºC mağaza 1 mg / ml laminin çözümü. 1-2 ug / ^cm2 'lik bir kaplama konsantrasyonunda elde edilen 1 ml DMEM / F12 içinde 2 ul çözülür.
   NOT: yavaşça buz üzerinde ve plakaları / lamelleri eklemek hemen soğuk DMEM / F12 çözülür ve çözülme laminin.
2. 4 ° C'de 75 ml% 0.01 425 ml PBS Poly-ornitin L-ve mağaza içinde seyreltin.
   NOT: Çalışma çözümün raf ömrü bir ay kadardır.
3. Bir ye kadar 4 ° C'de% 25 (ağırlık / hacim) PBS içinde BSA, pH 7.4, ve mağaza çözülürar.
4. (HBSS)% 50 FBS devre dışı bırakma ortamı hazırlayın.
5. (+) - - Glikoz (ağırlık / hacim),% 0.25 BSA (ağırlık / hacim), 50 U / ml penisilin ve streptomisin, 1 x N2 ek,% 5 (hacim / hacim) FBS,% 0.36 ilave edilmesi ile tam bir ortam hazırlama DMEM / F12 ve mağaza 4 ºC'de.
   NOT: raf ömrü 10 gün kadardır.
6. En az 30 dakika boyunca% 70 (hacim / hacim) kaynayan etanol içinde yer lamelleri yağ ve otoklavın kalıntılarını gidermek için.
7. Talep 24 oyuklu plakalarda lamelleri ve her bir oyuğa 500 ul Poli-L-ornitin solüsyonunu ilave edin. Oda sıcaklığında doku kültürü başlık altında 1 saat inkübe ve daha sonra 500 ul su ile 3 kez yıkanır. Her plaka için 500 ul, laminin solüsyonu eklenir ve 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde, O / N inkübe edin.
   NOT: yıkamalar 24 saat kültürden sonra hücrelerin ölümü ile poli-L-ornitin en az üç kez yıkama sonuçlarını laminin tedaviden sonra gerekli olsa da.
8. Doğal gaz veya meşale f üzerinde cam pipetler ipuçları parlatmaktopal.
   NOT: Bu adımdan sonra ucu çapı normal boyutunun yaklaşık yarısı olmalıdır.
9. Bir otoklav makas ve otoklav kullanarak, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri kapakları kesilir.

Embriyonik ventral orta beyindeki 2. Diseksiyon

1. Uyuşturmak zamanlanmış-gebe (E12.5) CO ₂ inhalasyon yoluyla barajlar ve daha sonra servikal dislokasyon ile euthanize.
2. % 70 etanol ile karın Sprey ve rahim keseler tüm maruz kadar bir karın kesi yapmak. Forseps vajinal eki kesme ve rahim kaldırmak. 100 mm Petri kabındaki, buzla soğutulmuş HBSS rahim yerleştirin.
3. Forseps (Şekil 1C) kullanarak, rahim ve amniyon kesesi embriyolar çıkarın. Buzla soğutulmuş HBSS yer embriyolar.
   NOT: Şekil 1D dikdörtgen embriyonik ventral orta beyindeki yerini gösterir.
4. Bir diseksiyon mikroskobu (10x büyütme) altında embriyolar yerleştirin ve mezensefalik teşrih, berzah ve mezensefalik-diensefalik sınır bölgesinde beyin kesme bioscissor ve forseps kullanarak kemer (Şekil 1E, kesi hatları için 1A Şekil bakınız).
5. Tüm Ortabeyin dışarı aldıktan sonra, mediodorsal orta beyin (Şekil 1F) bir kesim yapmak.
6. İki forseps (Şekil 1 H) kullanarak, meninksler çıkarın.
   NOT: KRİTİK ADIM: Bu adım, optimum verim ve nöronal hayatta kalmak için gereklidir. Kültür şartları, beyin hücreleri için uygun olduğu için, çevreleyen dokudan hücrelerin en kaplamadan sonra ölür ve bu dokudan apoptotik sinyal kültürlerinin bütünlüğüne zarar verebilir.
7. Bir sterilize tıraş bıçağı (Şekil 1 H, I) kullanılarak, kelebek şekli gözlemlemek ve her kanat yaklaşık yarısını kesmek için Petri kabı orta beyin doku düzeltin.
   NOT: Şekil 1J izole ventral Ortabeyin göstermektedir.
8. Transferi15 ml konik tüp buz-soğuk HBSS içine ventral orta beyindeki parça ve bir sonraki embriyo devam edin.
   NOT: 2,1-2,8 fazla 1 saat almamalıdır adımlar. Buz üzerinde bu zaman dilimi dışında embriyolar tutulması önemli ölçüde hücre canlılığını azaltır.

Ventral Orta beyin hücrelerinin 3. Ayrılma

1. Laminer akış kaputun altında ventral orta beyindeki parçalarını aktarın. HBSS çıkarın ve (ventral orta beyindeki kadar 12 adet yeterli hacim) konik tüp içine önceden ısıtılmış, 1 ml (37 ° C),% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. 5-10 dakika süreyle 37 ° C'de doku inkübe edin.
2. Kaputun altında tripsin-EDTA çıkarın ve doku 1 ml de-aktivasyon orta (serum tripsin devre dışı bırakır) ekleyin.
3. Devreden Ortamı çıkarın ve iki kez tam bir ortam 1 ml doku yıkayın.
   Not: ayrışmış hücreleri atmadan önlemek için, boru tüm orta çıkarılması ve doku pipetleme kaçının.
4. 1ml tam orta ve trit ekleBir yangın cilalı cam pipet ile doku ürat. Kabarcıkların oluşumunu önlemek ve tek hücre süspansiyonu elde edilinceye kadar triturating devam edin.
   NOT: Genellikle 8-10 tam ayrışması için gerekli olan kısıtlı ucu geçer.
5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri ve ortam maddesinin ayrılması.
6. Yeniden askıya yavaş yavaş pipetleme tam orta 1 ml pelet ve aşağı yukarı dört kez.

4. Kaplama Ventral Orta beyin Hücreler

1. 90 ul Trypan mavi çözeltisi ile hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın ve bir hemositometre ile hücre sayısı.
   Not: Hücrelerin canlılığı, aynı zamanda, bu aşamada kontrol edilebilir.
2. Kapaklar üzerine her seferinde bir forseps, birini kullanarak, 100 mm Petri tabaklarda steril mikrosantrifüj tüpü kapaklar yerleştirin ve Poli-L-ornitin / laminin kaplanmış lamelleri aktarın.
   NOT: lamelleri yıkamayın ve bu uneve neden olabilir çünkü, laminin kurumasını önlemekN kültürleri ve hücre hayatta kalma azalma.
3. (Hacim harcanmadan, lamel yüzeyini kaplamak için uygun olan) tam orta eklenerek 1 ul başına 1500 hücre hacmini ayarlamak ve her bir lamel üzerine hücre süspansiyonu 100 ul (150,000 hücrelerin toplam) ekleyin. Nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde Petri kapları kapatın ve 1 saat süre ile inkübe (37 ° C,% 5 _CO2).
   Not: KRİTİK ADIM: Bu adım, hücre eki ve canlılığını geliştirmek için ve her embriyo için lamelleri sayısının arttırılması için gereklidir. Seçenek olarak ise, hücreler direkt olarak oyuklara (ihtiva lamelleri), ancak hücre sayısı (yerine 150,000) oyuk başına 350,000 artırılmalıdır aktarılabilir. Doğrudan transferi nedeniyle (yanında veya lamelleri altında) plakaları takmak hücrelerin, yaklaşık 3-4 lamelleri verir iken, diğer bir deyişle, bu yöntemi kullanırken, 8-10 lamelleri, elde edilebilir. Ortalama viabiliBu yöntemi kullanarak, kültürlerin Ty, yaklaşık% 90 idi.

5. Kültür Büyüme ve Bakım

1. Inkübasyondan 1 saat sonra, dikkatli bir şekilde 400 ul önceden ısıtılmış (37 ° C kadar) tam bir ortam ihtiva eden 24 oyuklu plakalar içinde ortam dahil olmak üzere lamelleri transferi (toplam hacim: 500 ul). 37 ºC hücreleri O / N inkübe.
2. Kuyular inkübasyonundan sonra, 24 saat içinde yavaşça, her bir oyuğa 500 ul komple ortam ekleyin.
   Not: ilk birkaç saat dopaminerjik nöronların hayatta kalma ve bu noktadan sonra önemli ölçüde değişmez hayatta kalan hücrelerin sayısı en kritik aşamadır.
3. İlk iki hafta için veya orta sarı olana kadar kültürlere ek ortam eklemeyin. Iki haftadan daha uzun veya taze tam önceden ısıtılmış medya (genellikle her iki hafta) sarı, medyanın değişim yarısı (500 ul) orta renk değişiklikleri için kültürleme edin.
   NOT: içinde dopaminerjik nöronlarkültürler bu koşullar altında daha 6 hafta boyunca hayatta olurdu.

Sonuçlar

Tirozin hidroksilaz (TH) karşı İmmünohistokimya kültürdeki hücre 0.5-1 arasında,% dopaminerjik olduğunu göstermektedir. Tirozin hidroksilaz (TH) ve mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2) antikorları (Şekil 3) kullanılarak, nöronal projeksiyonları kaplama sonra 2 saat içinde ortaya çıkar ve ilk gün, akson ve dendritler ayırt (Şekil 2). nöronlar fazla altı hafta boyunca hayatta ve kapsamlı akıbet göstermektedir. daha önce gösterildiği gibi kültürler nöron-...

Tartışmalar

Orta beyin dopaminerjik nöronları, merkezi sinir sisteminde dopamin ana kaynağıdır. Üç gruba ayrılır, substantia nigra pars compacta (SNpc), ventral tegmental alan (VTA) ve retrorubral alanı (RRF), ^{10, 11.} SNpc ve VTA'da nöronlar gibi duygu, motivasyon ve motor davranışlarının kontrolü gibi işlevleri dahil, mezokortikal mezolimbik ve nigro-striatum büyük dopaminerjik yollar, yol. SNpc ve nigrostriatal sistemi fonksiyonel bozulma nöronların ölümü, ikinci en önemli nörodejeneratif ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12	Invitrogen	11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid	Invitrogen	24020-117
Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS)	Invitrogen	16140
N2 Supplement (100X), liquid	Invitrogen	17502-048
D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water	Sigma	G8769
Bovine serum albumin BSA	Sigma	A9430
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Sigma	L2020
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15070
Trypsin (0.05% (wt/vol)	Invitrogen	25300
Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested	Sigma	A9418
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P3813
Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody	Pel-Freez Biologicals	P60101-0
Poly-L-ornithine, 0.01% solution	Sigma	P4957
Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody	Millipore	MAB3418
Anti-Synapsin-1 antibody	Millipore	AB1543P
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21206
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21207
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11015
Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11016
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG   antibody	Molecular Probes	A-21203
Trypan blue solution (0.4% (wt/vol))	Biowhittaker	17-942E
Stereo Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
Inverted phase contrast microscope	Carl Zeiss	Axiovert 40 C
Dumont Forceps	Fine Scientific Tools	May-45
Cover Slip Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11251-33
Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11245-30
Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm	Fine Scientific Tools	10052-11
Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm	Fine Scientific Tools	91460-11
Fiber optic halogen illuminator	Nikon	MKII
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes	Fisherbrand	13-678-20C
Hemocytometer	Proscitech	SVZ2NIOU
0.2 µm sterile filter units	Nalgene	NL-CE-156-4020
100x20 mm Petri dishes	BD Biosciences	351005
Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm	Bellco Glass	1943-10012