JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Аннотация

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

Введение

Потеря дофаминергических нейронов из черного вещества Парс компактов приводит к симптомам кардинал моторных болезни Паркинсона (БП), второй наиболее распространенной нейродегенеративное заболевание. Основная причина гибели этого мезенцефалической нейронов населения, не известно. Для изучения биохимических путей, ответственных за разработку и модуляции нейрофизиологические свойства и выживание Mesda нейронов, несколько клеточной культуры и животных модельных систем были использованы. Иммортализованные клеточные линии, в том числе линии клеток 1RB крыса дофаминергической 3 Н. 27 (N27), в человеческий дофаминергической линии клеток нейробластомы SH-SY5Y, мыши дофаминергической линии гибридных клеток MN9D и человек теменной LUHMES клетки были использованы для биохимических и ограниченных механистических исследований 1 -5. Для изучения конкретной потери Mesda нейронов, несколько нейротоксин основе и генетические модели были разработаны 6-8. Основные брюшной среднего мозга культур, Является необходимым инструментом для изучения нейронов и синапсов свойства дофаминергических нейронов и путей, вовлеченных в патогенез этого общего беспорядка.

Здесь мы представляем подробный протокол для выделения среднего мозга дофаминергических нейронов, которая содержит изменения, приводящие к высокой живучести и увеличению выхода покровные в зачаточном состоянии. Использование преждевременного среднего мозга E12.5 мыши (E14.5 у крыс) повышает живучесть. В этом возрасте нейроны не разработали аксоны еще, что покидает клетки, неповрежденные во время вскрытия и сводит к минимуму стресс, тем самым, значительно повышая жизнеспособность. Кроме того, тщательное вскрытие брюшной мозга, как описано в разделе 2 настоящего Протокола, еще больше повышает живучесть. Для увеличения числа покровные в зародыше, альтернативный способ покрытия представлены в разделе 4 настоящего Протокола. Это приводит к выходу до 10 покровные в эмбрионе, по сравнению с 4 по покровныеСтандартные условия металлизации, таким образом, уменьшая количество животных в эксперименте.

Нейроны в культуре выставочная вырост аксонов и dentrites, образуют синаптические соединения и выявить наличие нейронов и синапсов маркеров делает эти культуры подходит для живого изображения клеток, иммуноцитохимических и электрофизиологических исследований. Кроме того, использование нейронных культур способствует генетической и фармакологической манипуляции. Вырост нейритов от 2 дня в пробирке позволяет исследованиях развития. Кроме того, долгосрочное выживание культур (до шести недель) делает их пригодными для исследования медленной, прогрессирующей дегенерацией этих нейронов.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Животных содержали и обрабатываются в соответствии с ведомственным руководящим принципам и всех процедур животных были утверждены благосостояния животных в Имперском колледже и Этическая экспертиза тела (AWERB) и Home Office и Гарвардский университет Уходу за животными и использованию комитета (IACUC), в соответствии с федеральными и местными нормами.

1. Реагент и настройка оборудования

  1. Оттепель, аликвоту и магазин 1 решение мг / мл Ламинин при -80 ° С. Растворить 2 мкл в 1 мл DMEM / F12, в результате чего концентрации покрытия 1-2 мкг / см 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оттепель Ламинин медленно на льду и растворить в холодной DMEM / F12 и сразу же добавить его в пластинами / покровные.
  2. Развести 75 мл 0,01% поли-L-орнитина в 425 мл PBS и хранить при температуре 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Срок годности рабочего раствора до одного месяца.
  3. Растворите 25% (вес / объем) BSA в PBS, рН 7,4, и хранят при температуре 4 ° С на срок до одного уеAR.
  4. Подготовка 50% FBS (в HBSS) деактивации СМИ.
  5. Подготовка полной среды путем добавления 50 ед / мл пенициллина и стрептомицина, 1 N2 добавки, 5% (об / об) ФБС, 0,36% D - (+) - глюкозы (вес / объем), 0,25% БСА (вес / объем), чтобы DMEM / F12 и хранить при 4 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Срок годности до 10 дней.
  6. Место покровные в кипящей 70% (об / об) этанола в течение по крайней мере 30 минут, чтобы удалить все следы жира и автоклав.
  7. Место покровные в 24-луночных планшетах и ​​добавить 500 мкл поли-L-орнитин раствор ли в каждую лунку. Инкубируют 1 час под капот культуры ткани при комнатной температуре, а затем, промыть 3 раза 500 мкл воды. Добавить 500 мкл раствора ламинин к каждой пластине и инкубировать O / N в увлажненной инкубаторе для тканевых культур при 37 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пока никаких моет не нужны после лечения ламининовым, мыть поли-L-орнитин менее чем в три раза приводит к смерти клеток через 24 ч после культивирования.
  8. Польский советы стеклянных пипеток более природного газа горелки или Fхромой.
    Примечание: После этой стадии диаметр наконечника должен быть около половины своего нормального размера.
  9. Вырезать колпачки 1,5 мл микропробирок, используя в автоклаве ножницы и автоклав.

2. Препарирование эмбрионального Брюшной мозга

  1. Наркотизировать приурочен беременных (E12.5), сооружаемых CO 2 ингаляции, а затем усыпить путем смещения шейных позвонков.
  2. Спрей живота с 70% этанола и сделать брюшной разрез до тех пор, маточные мешки не все подвержены. Использование щипцов сократить влагалища привязанность и удаления матки. Поместите матки в ледяной HBSS, в 100 мм чашки Петри.
  3. Удалить эмбрионов из матки и амниотической, с помощью пинцета (рис 1в). Место эмбрионов в пресной ледяной HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: прямоугольник на рисунке 1D показывает местоположение эмбрионального брюшной мозга.
  4. Поместите эмбрионы Под микроскопом рассечение (10x) и анализировать среднего мозгаарки, сокращая мозг на перешейке и теменной-диэнцефальных граничной области, используя bioscissor и щипцы (рис 1E, пожалуйста, обратитесь к рисунку 1А для линий разреза).
  5. После изъятия весь средний мозг, сделать разрез в mediodorsal мозга (рис 1F).
  6. Удалить мозговые оболочки, с использованием двух щипцов (рис 1H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важным шагом: Этот шаг необходим для оптимального нейронов урожайности и выживания. Поскольку условия культивирования являются оптимальными для клеток головного мозга, большинство клеток от окружающей ткани умирают после посева и апоптоза сигнал от этой ткани может привести к повреждению целостности культур.
  7. Свести мозга ткани на чашку Петри наблюдать форму бабочки и сократить примерно половину каждого крыла, используя стерилизованный нож для бритья (рис 1Н, I).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1J изображает изолированный вентральной средний мозг.
  8. Перевестичасть вентральной мозга в ледяную HBSS в 15 мл коническую трубку и перейти к следующему эмбриона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.1-2.8 не должна занимать более 1 ч. Хранение эмбрионов за этот период времени на льду значительно снижает жизнеспособность клеток.

3. Диссоциация Брюшной мозга клеток

  1. Передача части брюшной мозга под капотом ламинарного потока. Снимите HBSS и добавить 1 мл подогретого (37 ° C) 0,05% трипсин-ЭДТА в конической трубе (объемы достаточно до 12 штук брюшной мозга). Инкубируйте ткани на 37 ° С в течение 5-10 мин.
  2. Удалить трипсин-ЭДТА под капотом и добавить 1 мл среды де-активации (сыворотка будет отключить трипсин) в ткани.
  3. Снимите деактивации среды и промыть ткань в 1 мл полной среды в два раза.
    Примечание: Не все удаления среды из трубки и пипетки ткани, чтобы предотвратить отбрасывание диссоциированных клеток.
  4. Добавить 1 мл полной среды и Тритуратов ткани с огневой полировкой стеклянной пипетки. Избегайте образования пузырьков и продолжить растирания до суспензии отдельных клеток не достигается.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно, 8-10 проходит через ограниченное наконечника требуются для полной диссоциации.
  5. Центрифуга клетки при 400 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и удалить носитель.
  6. Повторное приостановить осадок в 1 мл полной среды, медленно пипетки вверх и вниз на срок до четырех раз.

4. Покрытие Брюшной мозга Клетки

  1. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 90 мкл раствора трипанового синего и подсчитывают число клеток с помощью гемоцитометра.
    Примечание: Жизнеспособность клеток может быть также проверена на данном этапе.
  2. Поместите стерилизовать крышки трубки микроцентрифужных в 100 мм чашки Петри и передачи / покровные Ламинин покрытые поли-L-орнитин, с помощью пинцета, по одному на верхней части крышки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не мойте покровные и избежать высушивания ламинином, так как это может привести к uneveп культур и снижение выживаемости клеток.
  3. Настройка громкости в 1500 клеток на 1 мкл добавлением полной среды и добавить 100 мкл (всего 150000 клеток) клеточной суспензии в верхней части каждого покровное (объем является оптимальным, чтобы покрыть поверхность покровного стекла без утечки). Закройте чашки Петри и инкубируют их в течение 1 часа в увлажненной инкубаторе тканевых культур (37 ° C, 5% CO 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важным шагом: Этот шаг необходим для повышения привязанность и жизнеспособности клеток и увеличение количества покровных в зачаточном состоянии. С другой стороны, клетки могут быть перенесены непосредственно в лунки, содержащие (покровные), но количество клеток должно быть увеличено до 350000 на лунку (вместо 150000). Другими словами, с помощью этого метода, 8-10 покровные могут быть приобретены, в то время как прямая передача дает около 3-4 покровные из-за клеток, которые прикрепляются к пластинам (рядом или под покровные). Средняя viabiliти культур, используя этот метод был около 90%.

5. Культура роста и поддержания

  1. После 1 ч инкубации, тщательно передачи покровные в том числе среды в 24-луночных планшетах, содержащий 400 мкл предварительно нагретой (до 37 ° С) в полной среде (общий объем: 500 мкл). Инкубируйте клетки O / N на 37 ° C.
  2. В 24 ч после инкубации в лунки осторожно добавить 500 мкл полной среды в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первые несколько часов является наиболее важным этапом для выживания дофаминергических нейронов и количества выживших клеток существенно не изменится после этой точки.
  3. Не следует добавлять дополнительное СМИ к культурам в течение первых двух недель или до среда становится желтым. Если культивирования в течение более чем двух недель или средних цвет меняется на желтый, обмен половина средств массовой информации (500 мкл) со свежими полных подогретого СМИ (как правило, каждые две недели).
    ПРИМЕЧАНИЕ: дофаминергических нейронов в пределахкультуры были бы выжить в течение более чем 6 недель в этих условиях.

Результаты

Иммуногистохимическое против тирозин гидроксилазы (TH) показывает, что между 0,5-1% клеток в культуре дофаминергических. Нервные прогнозы появляются в течение 2 ч после посева и в первый день, аксоны и дендриты различимы (рис 2), используя Тирозингидроксилаза (TH) и ассоциированный ?...

Обсуждение

Дофаминергических нейронов в мозге, являются основным источником допамина в центральной нервной системе. Они делятся на три группы, черного вещества Парс компактов (SNPC), вентральной области покрышки (VTA) и retrorubral поле (СБР) 10, 11. Нейроны в SNPC и ВТА привести к основными путями дофамин?...

Раскрытие информации

No conflict of interest declared.

Благодарности

This work was performed using the Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London startup funds to K.N.A.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12Invitrogen11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquidInvitrogen24020-117
Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS)Invitrogen16140
N2 Supplement (100X), liquidInvitrogen17502-048
D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in waterSigmaG8769
Bovine serum albumin BSASigmaA9430
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membraneSigmaL2020
Penicillin/streptomycinInvitrogen15070
Trypsin (0.05% (wt/vol)Invitrogen25300
Bovine serum albumin (BSA) cell culture testedSigma A9418
Phosphate-buffered saline (PBS)SigmaP3813
Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibodyPel-Freez BiologicalsP60101-0 
Poly-L-ornithine, 0.01% solutionSigmaP4957
Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibodyMilliporeMAB3418
Anti-Synapsin-1 antibodyMilliporeAB1543P
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG   antibodyMolecular ProbesA-21206
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG   antibodyMolecular ProbesA-21207
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG   antibodyMolecular ProbesA-11015
Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG   antibodyMolecular ProbesA-11016
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG   antibodyMolecular ProbesA-21203
Trypan blue solution (0.4% (wt/vol))Biowhittaker17-942E
Stereo MicroscopeCarl ZeissStemi 2000-C
Inverted phase contrast microscopeCarl ZeissAxiovert 40 C
Dumont ForcepsFine Scientific ToolsMay-45
Cover Slip Forceps – DumoxelFine Scientific Tools11251-33
Two Dumont #45 Forceps – DumoxelFine Scientific Tools11245-30
Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cmFine Scientific Tools10052-11
Student Iris Scissors - Straight 11.5 cmFine Scientific Tools91460-11
Fiber optic halogen illuminatorNikonMKII
Disposable Borosilicate Glass Pasteur PipettesFisherbrand13-678-20C
HemocytometerProscitechSVZ2NIOU
0.2 µm sterile filter unitsNalgeneNL-CE-156-4020
100x20 mm Petri dishesBD Biosciences351005
Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mmBellco Glass1943-10012 

Ссылки

  1. Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
  2. Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
  3. Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
  4. Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
  5. Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
  6. Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
  7. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
  8. Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
  9. Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
  10. Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
  11. Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
  12. Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
  13. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
  16. Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson's disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
  17. Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience96

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены