בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Summary

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson’s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Abstract

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson’s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

Introduction

הפסד של נוירונים דופאמין מnigra substantia pars compacta מוביל לתסמינים מוטוריים העיקרי של מחלת פרקינסון (PD), ההפרעה ניוונית של מערכת עצבים הנפוצה ביותר השנייה. הסיבה הבסיסית של פטירתו של אוכלוסייה העצבית mesencephalic זה אינה ידועה. כדי לחקור את התהליכים הביוכימיים אחראים על הפיתוח וויסות נכסים והישרדות של תאי עצב mesDA, כמה תרבית תאים ומערכות מודל החיה neurophysiological היה בשימוש. שורות תאים הנציחו, כולל 1RB דופאמין עכברוש קו תא _{3 27} (N27), שורת תאי נוירובלסטומה דופאמין אדם SH-SY5Y, שורת התאים היברידיים דופאמין העכבר MN9D וmesencephalic אדם LUHMES תאים היו בשימוש במשך מחקרים מכניסטית ביוכימיים ומוגבלים ^{1 -5.} לצורך המחקר של האובדן הספציפי של נוירונים mesDA, כמה עצבים מבוססי ומודלים גנטיים פותחו ^6-8. תרבויות המוח התיכון הגחון ראשיות, מספק כלי הכרחי ללימוד התכונות עצביות והסינפטי של נוירונים דופאמין והמסלולים מעורבים בפתוגנזה של הפרעה שכיחה זו.

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד של נוירונים דופאמין mesencephalic, המכיל שינויים וכתוצאה מכך שרידות גבוהות יותר ותשואה מוגברת של coverslips לעובר. שימוש בmesencephalon טרום בוגרים עכבר E12.5 (E14.5 בחולדה) משפר שרידות. בגיל זה הנוירונים לא פיתחו האקסונים עדיין, מה שמשאיר תאים שלמים במהלך נתיחה וממזער את הלחץ ובכך להגדיל באופן משמעותי את הכדאיות. בנוסף, לנתיחה זהירה של המוח התיכון הגחון, כפי שתוארו בסעיף 2 לפרוטוקול זה, משפרת עוד יותר את השרידות. כדי להגדיל את המספרים של coverslips לעובר, שיטת ציפוי חלופית מוצגת בסעיף 4 לפרוטוקול זה. זה מוביל לתשואה של עד 10 coverslips לכל עובר לעומת 4 coverslips תחתתנאי ציפוי סטנדרטיים ובכך להקטין את כמות בעלי חיים לכל ניסוי.

הנוירונים בתולדת תערוכת תרבות של אקסונים וdentrites, יוצרים קשרים סינפטיים ולחשוף את הנוכחות של סמנים עצביים והסינפטי עושים תרבויות אלה מתאימים להדמיה לחיות תא, immunocytochemical ומחקרי אלקטרו. יתר על כן, השימוש בתרבויות עצביות מאפשרת מניפולציה גנטית ותרופתית. תולדה של neurites מיום 2 במבחנה מאפשרת למחקרים התפתחותיים. יתר על כן, ההישרדות לטווח הארוך של תרבויות (עד שישה שבועות) הופכת אותם מתאימה למחקר של הניוון האיטי, ההדרגתי של תאי העצב האלה.

Protocol

הערה: בעלי החיים נשמרו ומטופל בעמידה בהנחיות מוסדיות ונהלי כל החיה אושרו על ידי צער בעלי החיים של אימפריאל קולג 'ובגוף סקירה אתית (AWERB) והמשרד לבית ולאוניברסיטה הרווארד מוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC), בעמידה בתקנות פדרליות ואת המדינה.

1. מגיב והתקנת הציוד

1. הפשרה, aliquot ופתרון חנות 1 מ"ג / מיליליטר Laminin ב -80 ºC. לפזר 2 μl ב 1 מיליליטר DMEM / F12, וכתוצאה מכך ריכוז ציפוי של 1-2 מיקרוגרם / ² סנטימטר.
   הערה: הפשירי Laminin לאט על קרח ולפזר בDMEM / F12 הקר ומייד להוסיף אותו לצלחות / coverslips.
2. לדלל 75 מיליליטר של 0.01% פולי-L-ornithine ב425 מיליליטר PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: חיי המדף של הפתרון הוא לעבוד עד חודש.
3. לפזר 25% BSA ב PBS (wt / כרך), pH 7.4, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד year.
4. הכן 50% FBS (בHBSS) תקשורת שחרור משרות.
5. הכן בינוני מלא על ידי הוספת 50 U / ml פניצילין וסטרפטומיצין, תוספת 1x N2, 5% (כרך / כרך) FBS, 0.36% D - (+) - גלוקוז (wt / כרך), BSA 0.25% (wt / כרך) ל DMEM / F12 ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: חיי המדף הוא עד 10 ימים.
6. coverslips מקום ברותח אתנול 70% (כרך / כרך) במשך לפחות 30 דקות כדי להסיר כל עקבות של שומן וחיטוי.
7. coverslips המקום בצלחות 24 גם ולהוסיף פתרון 500 μl פולי-L-ornithine היטב כל אחד. דגירה שעה 1 מתחת למכסת המנוע בתרבית הרקמה בRT ולאחר מכן, לשטוף 3 פעמים עם 500 מים μl. הוסף פתרון laminin 500 μl לכל צלחת ודגירת O / N בתרבית רקמת חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: למרות שאין שוטף נחוץ לאחר טיפול laminin, שטיפה פחות משלוש פעמים תוצאות poly-L-ornithine במוות של התאים 24 שעות לאחר culturing.
8. פולני הטיפים של טפטפות זכוכית על גז טבעי או f לפידצולע.
   הערה: לאחר שלב זה הקוטר של הקצה צריך להיות כמחצית מגודלו הרגיל.
9. חותך את הכובעים של 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge, באמצעות מספריים וחיטוי autoclaved.

2. Dissection של עוברי הגחון מוח תיכון

1. הסכרים לְהַרְדִים בעתו בהריון (E12.5) משאיפת CO ₂ ולאחר מכן להרדים נקע בצוואר רחם.
2. לרסס את הבטן עם אתנול 70% ולעשות חתך בבטן עד שקי רחם כל חשופים. שימוש במלקחיים לחתוך את הקובץ המצורף בנרתיק ולהסיר רחם. מניחים את הרחם בHBSS קר כקרח, בצלחת פטרי 100 מ"מ.
3. הסר עוברים מן הרחם והשק מי שפיר, באמצעות מלקחיים (איור 1 ג). עוברי מקום בHBSS קר כקרח טרי.
   הערה: המלבן ב1D איור מציין את מיקומו של המוח התיכון הגחון העוברי.
4. מניחים את העוברים תחת מיקרוסקופ לנתיחה (הגדלה 10x) ולנתח את mesencephalicקשת על ידי חיתוך במוח במצר ובאזור גבול mesencephalic-diencephalic, באמצעות bioscissor ומלקחיים (איור 1E, עיין באיור 1 א לקווים של חתך).
5. לאחר שלקח את כל המוח התיכון, לעשות חתך במוח התיכון mediodorsal (איור 1F).
6. הסר קרומי המוח, תוך שימוש בשני מלקחיים (איור 1H).
   הערה: שלב קריטי: צעד זה הוא חיוני לתשואה עצבית אופטימלית והישרדות. מאז תנאי התרבות הם אופטימליים לתאי מוח, רוב התאים מהרקמות המקיפות למות לאחר ציפוי והאות אפופטוטיים מהרקמה זו עלולה לגרום נזק לשלמות של התרבויות.
7. שטח את רקמת המוח התיכון בצלחת פטרי להתבונן בצורת הפרפר ולחתוך כמחצית מכל כנף, באמצעות סכין גילוח מעוקר (איור 1H, I).
   הערה: איור 1J מתאר את המוח התיכון הגחון המבודד.
8. העבר אתחתיכת המוח התיכון הגחון לתוך HBSS קר כקרח בצינור חרוטי 15 מיליליטר ולהמשיך בעובר הבא.
   הערה: שלבי 2.1-2.8 לא צריכים לקחת יותר משעה 1. שמירה על העוברים מעבר למסגרת זמן זו על קרח יורדת כדאיות תא באופן משמעותי.

3. דיסוציאציה של תאי המוח תיכונים הגחון

1. העבר את החתיכות של המוח התיכון הגחון מתחת לזרימה למינרית. הסר את HBSS ולהוסיף 1 מיליליטר מחומם מראש (37 ºC) 0.05% טריפסין-EDTA לתוך צינור חרוטי (כרכים מספיק לתקופה של עד 12 חתיכות של המוח התיכון הגחון). דגירה הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
2. הסר טריפסין-EDTA מתחת למכסה המנוע ולהוסיף בינוני דה-הפעלת 1 מיליליטר (הסרום יהיה לבטל טריפסין) לרקמות.
3. הסר את מדיום שחרור משרות ולשטוף את הרקמה ב 1 מיליליטר בינוני מלא פעמיים.
   הערה: יש להימנע מהסרה כל המדיום מהצינור וpipetting הרקמות, כדי למנוע השלכת התאים ניתקו.
4. הוסף בינוני מלא 1ml וטריטurate הרקמה עם טפטפת זכוכית מלוטשת אש. למנוע היווצרות של בועות ולהמשיך triturating עד השעיה תא בודדת מושגת.
   הערה: בדרך כלל, 8-10 עוברים בקצה המוגבל נדרשים לניתוק מוחלט.
5. צנטריפוגה התאים ב 400 XG במשך 5 דקות בRT ולהסיר את המדיום.
6. מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר בינוני מלא על ידי pipetting לאט מעלה ומטה עד ארבע פעמים.

4. תאי ציפוי הגחון המוח תיכונים

1. מערבבים 10 μl של ההשעיה התא עם פתרון כחול 90 μl Trypan ולספור את מספר התאים עם hemocytometer.
   הערה: ליכולת הקיום של התאים גם ניתן לבדוק בשלב זה.
2. הנח כובעי צינור microcentrifuge מעוקרים ב100 מ"מ צלחות פטרי ולהעביר את coverslips פולי-L-ornithine / Laminin המצופה, באמצעות מלקחיים, אחד בכל פעם בחלק העליון של הכובעים.
   הערה: אין לשטוף את coverslips ולמנוע התייבשות laminin, שכן הדבר עלול לגרום לuneveתרבויות n וירידה בשרידות של התאים.
3. כוון את עוצמת הקול ל1,500 תאים לכל 1 μl על ידי הוספה בינונית מלא ולהוסיף 100 μl (כולל של 150,000 תאים) של ההשעיה התא על גבי כל coverslip (נפח אופטימלי כדי לכסות את פני השטח של coverslip ללא שפיכה). סגור את צלחות פטרי דגירה אותם במשך שעה 1 בתרבית רקמת חממת humidified (37 ° C, 5% CO _2).
   הערה: שלב קריטי: צעד זה נדרש לשיפור ההתקשרות ויכולת הקיום של התאים ולהגדלת מספר coverslips לעובר. לחלופין, ניתן להעביר את התאים ישירות לתוך הבארות (coverslips מכיל) אבל מספר התאים צריך להיות מוגבר ל350,000 לכל טוב (במקום 150,000). במילים אחרות, שימוש בשיטה זו, ניתן לרכוש 8-10 coverslips, תוך העברה ישירה מניבה כ 3-4 coverslips בגלל התאים, אשר לצרף לצלחות (לצד או מתחת לcoverslips). Viabili הממוצעty של התרבויות, שימוש בשיטה זו היה כ -90%.

5. תרבות צמיחה ותחזוקה

1. אחרי שעה 1 של דגירה, להעביר בזהירות את coverslips כולל הבינוני לתוך צלחות 24 גם, המכיל בינוני מחומם מראש (עד 37 מעלות צלזיוס) מלא 400 μl (נפח כולל: 500 μl). דגירה התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
2. תוך 24 שעות לאחר הדגירה של הבארות, בעדינות להוסיף בינוני שלם 500 μl לכל אחד.
   הערה: כמה השעות הראשונות היא השלב הקריטי ביותר להישרדות של נוירונים דופאמין ואת מספר התאים ששרדו אינו משנה באופן משמעותי מעבר לנקודה זו.
3. אל תוסיף מדיה נוספת לתרבויות בשבועיים הראשונים או עד הבינוני הופך להיות צהוב. אם culturing במשך יותר משבועיים או בינוניים שינויי צבע למחצית חליפין של התקשורת (μl 500) הצהוב, עם תקשורת מלאה טרי מחוממת מראש (בדרך כלל כל שבועיים).
   הערה: נוירונים דופאמין בתרבויות תשרודנה במשך יותר מ -6 שבועות בתנאים אלה.

תוצאות

אימונוהיסטוכימיה נגד hydroxylase טירוזין (ה ') עולה כי בין 0.5-1% מהתאים בתרבית הם דופאמין. תחזיות עצביות מופיעות בתוך 2 שעות לאחר ציפוי ועל ידי ביום הראשון, אקסונים ודנדריטים ניתן להבחין (איור 2), באמצעות טירוזין hydroxylase (TH) ונוגדני microtubule הקשורים חלבון 2 (MAP2) (איור ...

Discussion

נוירונים דופאמין במוח תיכון הם המקור העיקרי של דופמין במערכת העצבים המרכזית. הם חולקו לשלוש קבוצות, compacta סעיפי nigra substantia (SNpc), אזור הגחון tegmental (VTA) ושדה retrorubral (RRF) ^{10, 11.} הנוירונים בSNpc וVTA להצמיח מסלולים עיקריים דופאמין, mesocortical, mesolimbic וNigro-striatal, מעורבים בפונקציות כגון...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12	Invitrogen	11330
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid	Invitrogen	24020-117
Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS)	Invitrogen	16140
N2 Supplement (100X), liquid	Invitrogen	17502-048
D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water	Sigma	G8769
Bovine serum albumin BSA	Sigma	A9430
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Sigma	L2020
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15070
Trypsin (0.05% (wt/vol)	Invitrogen	25300
Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested	Sigma	A9418
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P3813
Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody	Pel-Freez Biologicals	P60101-0
Poly-L-ornithine, 0.01% solution	Sigma	P4957
Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody	Millipore	MAB3418
Anti-Synapsin-1 antibody	Millipore	AB1543P
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21206
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG   antibody	Molecular Probes	A-21207
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11015
Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG   antibody	Molecular Probes	A-11016
Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG   antibody	Molecular Probes	A-21203
Trypan blue solution (0.4% (wt/vol))	Biowhittaker	17-942E
Stereo Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
Inverted phase contrast microscope	Carl Zeiss	Axiovert 40 C
Dumont Forceps	Fine Scientific Tools	May-45
Cover Slip Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11251-33
Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11245-30
Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm	Fine Scientific Tools	10052-11
Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm	Fine Scientific Tools	91460-11
Fiber optic halogen illuminator	Nikon	MKII
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes	Fisherbrand	13-678-20C
Hemocytometer	Proscitech	SVZ2NIOU
0.2 µm sterile filter units	Nalgene	NL-CE-156-4020
100x20 mm Petri dishes	BD Biosciences	351005
Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm	Bellco Glass	1943-10012