基于海拉细胞自由表达系统中的表达<em&gt;疟原虫</em&gt;棒状体蛋白

摘要

基于细胞系统疟疾蛋白的表达仍然具有挑战性。我们证明两步并一步IVT（ 体外翻译）无细胞表达系统从HeLa细胞表达的重组疟疾蛋白质棒状体。我们使用的Ni树脂基于亲和性的纯化系统纯化棒状体蛋白质。

摘要

疟疾导致显著的全球发病率和死亡率。没有常规疫苗是当前可用。其中一个主要的原因，缺乏疫苗是确定合适的候选疫苗的挑战。疟疾蛋白使用原核和真核基于细胞的表达系统很差糖基化，通常不溶性且经受不当折叠导致降低的免疫原性表达。小麦胚芽，兔网织红细胞裂解物和大肠杆菌裂解物无细胞表达系统目前用于疟疾蛋白的表达。然而，表达时间和不适当的糖基化蛋白质的长度仍然是一项挑战。我们使用的HeLa基于无细胞表达系统，被称为" 在体外人的分类细胞表达系统"表明在体外恶性疟原虫蛋白质的表达。 2.基于海拉细胞自由表达系统表达转录在75分钟和3微升transcrib的编的mRNA足以翻译的蛋白质在90分钟。的1步表达系统是一个转录和翻译偶联表达系统;转录和共翻译发生在3小时。该方法也可以通过提供额外的能量扩展6小时。在2步表达系统，表达被第一转录，然后添加至翻译组合用于蛋白质表达。我们描述了如何表达疟疾蛋白;疏水PF3D7_0114100毛雷尔的唇腭裂 - 2跨膜（PFMC-2TM）的蛋白质，亲水PF3D7_0925900蛋白质和含蛋白质PF3D7_1361800犰狳重复使用的HeLa细胞基于自由表达系统。的蛋白质表达于微体积采用2步和1-步骤表达的策略。亲和纯化方法纯化25μl的使用也被描述的体外人细胞表达系统表达的蛋白质。蛋白质产量是由布拉德福德测定法测定和表达和纯化的蛋白质可以通过蛋​​白质印迹分析来证实。表达的重组蛋白可用于免疫接种，免疫测定和蛋白质测序。

引言

在疟疾研究，使用原核或真核细胞的系统免疫原性蛋白的表达仍然是一个挑战。 疟原虫的基因组的和未知的翻译后机制^14,7，的AT丰富有助于与获得正确折叠的和免疫原性蛋白产生抗体和疫苗研究的困难。原核系统如大肠杆菌已被用于重组蛋白质表达。原核系统是低成本，有效，产生重组蛋白的高产率 并有多个克隆载体。 E.主机大肠杆菌细胞很容易变换和细胞生长迅速。然而，原核系统有例如缺乏氨基酸取代，翻译后修饰，污染，异构产品和重组蛋白的积累的包涵体²⁴内危险的限制。

在一个研究由Mehlin 等人（2006年），1000的开放阅读框（ORF）表达。约7％的表达的蛋白质的可溶于^14。所观察到的不溶性是由于基因的偏压性质和密码子的高频率理想地使用由疟原虫富含AT的基因组^14。克服该问题的另一种策略已开发通过使用质粒或含有的tRNA识别稀有密码子或匹配频率^3中的密码子的宿主细胞。即使在执行这些优化后，蛋白质的非常小的部分被表示为可溶的，活性和免疫原性^14。无细胞表达系统包含了所有必需的转录和翻译元件，如核糖体，起始因子，延伸因子（翻译因子），tRNA和氨酰基tRNA合成酶。转录和翻译反应被耦合在一步法^11,29。该transcription反应在一个试管中进行前mRNA的适当量的孵育翻译机器在不同的管^11,29。虽然这些方法是成功的疟原虫属蛋白的表达，一个主要缺点是时间为蛋白质的表达，这是约22小时²⁹的长度。此外，耗材列入成本高的协议^29，细胞裂解液的劳动密集型筹备和不一致成分制剂，使这些系统无法实现的。研究人员对无细胞表达系统发展的主要焦点取决于多种因素，如快速的遗传修饰，具有较高的浓度和直线前进裂解液制剂¹快产量。

真核系统例如酵母，哺乳动物细胞系，杆状病毒介导的表达系统， 四膜虫thermophilia，粘菌和寄生表达系统ス通道作为利什曼已经用于重组蛋白质表达^7。真核系统中共享的亲缘关系，因此也共享特性，如糖基化，酰化，二硫键的形成，分子伴侣相互作用，蛋白水解和亚细胞区室。在真核生物中蛋白分泌事件预防的积累和降低毒性表达系统^13。利用酵母系统是优选的，因为它们是适合于在大规模蛋白质表达和获得高的产率^4。两个P.疟原虫蛋白PfCP-29和Pvs25用酵母系统⁴产生。然而，在大多数的蛋白质的合成的主要缺点是不规则N和O-糖基化模式，不当折叠和从它们的天然形式⁴蛋白的截断。

使用哺乳动物细胞合成重组蛋白质的是劳动密集型的并且它expen西伯来维持稳定的重组细胞系^4。因此，哺乳动物细胞被限制为蛋白信号，蛋白质相互作用和寄生虫-宿主相互作用的分析，而且还用于测试DNA疫苗^4。人类DNA和mRNA 体外蛋白表达的无细胞系统本文中所描述的HeLa细胞来源的哺乳动物为基础的系统表达的蛋白质中3小时。蛋白表达使用pT7CFE1-CHIS表达载体已C-末端标签促进鉴定和纯化。的HeLa细胞为基础的系统中补充有翻译起始因子和翻译调节器，从而提高翻译系统的效率。蛋白质可迅速转化，筛选，验证和在各种免疫学和结构应用¹⁵处理以供使用。

目前用于变种的表达的真核细胞表达系统，例如小麦胚芽，兔网织红细胞白条真核蛋白，包括恶性蛋白质^11,29。另外，E。大肠杆菌基于无细胞系统也用于真核蛋白表达^11。 表1通过比较系统的功能，以及易于使用的系统用于蛋白质表达的总结了在不同的分类细胞表达系统。相较于其他人无细胞系统必须执行后并共翻译修饰的能力，并且是不太昂贵。密码子优化是可能的，并且所有的反应可以在3小时来进行。的HeLa细胞系统是一种理想的翻译系统蛋白质合成在实验室设置。

在其它细胞系统人类自由细胞表达系统的一个主要优点是，从不同的器官和组织来源的多种不同的细胞系的可用性。几个品种无细胞系统可根据不同的细胞系进行设计。提取物从哺乳动物细胞衍生s具有更高的效率来合成大量的蛋白质，比任何其他的分类细胞表达系统。这些无细胞表达系统也可用于诊断和蛋白质表征的应用，如微阵列^30。流行的HeLa细胞系是最广泛地用于进行蛋白³³的表达。在HeLa细胞系内质网不发达，导致缺乏翻译后糖基化修饰的活性^33。然而，该系统被认为是有利的疟原虫蛋白合成疟原虫也缺乏糖基化交翻译修改^29。 HeLa细胞游离转录 - 翻​​译协议是容易执行的，廉价和蛋白质可表示在90分钟，准备用于纯化和进一步的下游应用。

研究方案

1.准备寄生虫细胞培养，收集寄生虫微丸

1. 加入10克的RPMI-1640粉末，66毫克硫酸庆大霉素的，2克碳酸氢钠，5.9克HEPES缓冲液，50毫克次黄嘌呤和3.8g的葡萄糖在1L制备的RPMI-1640-HEPES培养基的无菌卫生署₂ O.混合使用表磁力搅拌器，直到1升蒸馏水中所有的粉末溶解。执行使用0.22微米的过滤介质微过滤。存储介质中的无菌瓶中。
2. 未感染的洗净（鲜）型使用RPMI A +红细胞。制备红细胞的5％血细胞比容（0.5毫升洗涤新鲜红细胞的9.5毫升10％的RPMI +人血清）。
3. 让15％的人血清+ RPMI（15毫升的人血清和85ml的RPMI）发起寄生虫的培养。使10％的人血清和RPMI（10毫升人血清和90ml的RPMI），以继续寄生虫培养中的红血细胞。
4. 文化P.恶性疟原虫 （3D7和FCR-3株）型A +人红细胞在5％血细胞比容和20％原虫在培养皿或75 cm ³的培养瓶。根据Trager和詹森烛缸²⁶的方法， 在体外保持养殖。交替，保持培养物在孵化器在37℃保持9.5％的CO ₂和3.4％的N ₂气。文化P.疟原虫的RPMI 1640-HEPES培养基补充有10％的人血清。
5. 同步P.疟原虫培养通过添加65％的Percoll（65毫升Percoll密度+35毫升的RPMI-1640的没有人类血清）的培养物浓缩物^27。
6. 离心培养物浓缩物以Percoll密度在2500×g离心5分钟，这导致3层。仔细，用移液管隔离无菌条件²⁷下的中间层转移到单独的管裂殖。
7. 洗所述分离培养物，用10％人血清+ RPMI-1640两次通过在7500×g离心离心5分钟以除去过量的Percoll。迪在无菌条件²⁷下每次SCARD上清液。
8. 继续培养同步P.疟原虫裂殖在10％人血清+ RPMI-1640 ^27。
9. 通过处理疟原虫 -感染的红细胞用10mM的Tris pH值8.8，并在15000×g离心离心15分钟²³收集裂殖。在-70℃以下加入5微升蛋白酶抑制剂（抑肽酶）的粒料商店寄生虫粒料。使用寄生虫粒料用于蛋白质提取，基因组DNA分离和RNA分离。

2.准备质粒载体

1. 隔离P.基因组DNA从约20％寄生虫血症的培养物制备疟原虫裂殖粒料。
2. 添加600微升的10mM的Tris-HCl的pH值7.6，50毫摩尔EDTA pH为8.0，0.1％SDS和1mg / ml蛋白酶K，来粒料在微量​​离心管中，用1ml注射器附接至＆G针均质沉淀。交替填充注射器配合颗粒混合物和排空到一个离心管中的20倍。含孵育匀浆管O / N在50℃水浴。
3. 加入600微升P +的C（300微升酚和300微升氯仿）均质颗粒氯仿（P + C）提取 - 执行苯酚。帽筒颠倒管端至端紧紧地摇晃混合物剧烈。使用微量到一个新的离心管在14000×g离心2分钟，并离心管收集上层水溶液。重复此步骤两次。
4. 从步骤2.1.2添加600微升氯仿到水层中，在新管中。涡管10秒和离心机在14000×g离心2分钟。测量上层的水层用微量并将其转移到一个新的离心管中。
5. 加入0.1体积的5M乙酸钠pH5.5的和1体积的异丙醇（如果水层为300微升加入30微升的5M乙酸钠pH5.5加上330微升异丙醇）到水捻呃从步骤2.1.3。孵育管中，在室温进行15分钟。
6. 离心反应管在14000×g离心10分钟以沉淀DNA沉淀。弃上清，洗涤沉淀用100μl的70％乙醇（70微升乙醇和30微升的dh _{2 O），}以从DNA除去过量的盐。存储在DNA的50微升的dh _{2 O}在-20℃。
7. 设计正向和使用软件反向引物或手动为P.扩增疟原虫基因PF3D7_1361800，PF3D7_0925900，PF3D7_1436300和PF3D7_0114100先前在蛋白质组研究^16,18用适当的限制性位点，以允许该基因序列插入表达质粒pT7CFE1-CHIS的多克隆位点的克隆鉴定为示于表2。
8. 请加入50微升的反应混合物; 5微升隔离P的疟原虫的基因组DNA，5微升的10x缓冲液，MgCl ₂的的各5μl，1.5微升正向引物，1.5微升反向引物，0.5微升的T7 DNA聚合酶和31.5微升的dh _{2 O，}并执行聚合酶链反应（PCR），在94℃下进行8分钟变性，50℃进行1分30秒为延伸和72℃9分的退火和复性，用于放大在表1所示的基因。
9. 分离PCR产物在1％琼脂糖凝胶（1克琼脂糖和100ml的Tris乙酸EDTA（TAE）缓冲液中^）32。
10. 从琼脂糖凝胶上切的PCR扩增的DNA条带，将含有DNA的凝胶切片中的DNA凝胶提取旋转柱并冻结在-20℃下5分钟。加入100微升异丙醇，以冷冻凝胶切片和离心机在14000×g离心5分钟。
11. 测量水流量通过从步骤2.5过滤在收集管中，使用微量并且转移至新管。加入0.1体积的5M乙酸钠和离心机在14000×g离心5分钟。弃去上清液，加入卫生署₂的10微升O操作THËDNA沉淀。
12. 通过加入3微升质粒和5μl的PCR基因产物向每个管消化在两个独立的管中的pT7CFE1-CHIS表达载体和纯化的DNA片段（从2.6）。添加到每个管中，1微升的特定限制性内切酶，2微升反应缓冲液和14微升的dh ₂ O的
13. 加入3微升消化的质粒，5微升消化的DNA片段，2微升10×连接酶缓冲液，1微升连接酶和9微升的dh _{2 O为}在一个离心管中。孵育12°CO / N。
14. 加入0.1体积的3M乙酸钠，pH为5.5和2倍体积的乙醇​​（如果你的结扎管体积是20微升加入2微升3M乙酸钠+ 44微升乙醇）于管从步骤2.14。拌匀，并孵化在-20℃下15分钟。
15. 离心反应管在14000×g离心15分钟。小心取出用微型吸管上清，而不会干扰颗粒。
16. 加入100微升70％乙醇牛逼Ø从步骤2.10沉淀。离心反应管在14000×g离心5分钟。取出并弃去上清液。添加10微升不含核酸酶的水至DNA沉淀。

3.蛋白表达利用体外哺乳动物细胞表达自由制度

1. 通过测量2微升重组pT7CFE1-CHIS质粒DNA，4微升的5×转录缓冲液，4μl的NTP混合物，2微升T7 RNA聚合酶和8微升无核酸酶水两步骤制备20微升转录混合物的人类使用 DNA模板体外蛋白质的表达。混合组件在一个离心管中，并在水浴中孵育75分钟，在30℃。
2. 取2微升的转录混合物，并把它添加到23微升含12.5微升的HeLa细胞裂解物，2.5微升辅助蛋白，1微升的盐溶液A，0.5微升氨基酸-Met，0.5微升的氨基酸翻译混合物​​的-Leu，181，L RNA酶抑制剂，1.25微升能源结构和3.75微升无核酸酶水。
3. 孵育来自步骤3.2的翻译混合物​​在30℃下90分钟。商店翻译产物在-20℃下。
4. 通过加入3微升重组pT7CFE1-CHIS质粒DNA，2微升无核酸酶水，5微升反应混合物，12.5微升的HeLa细胞裂解液和2.5微升辅助蛋白的1步制备25μl的转录和翻译混合物​​的人类再加IVT蛋白表达的DNA模板。
5. 孵育来自步骤3.4的90分钟至6小时，将反应混合物在30℃。存储的翻译产物在-20 C。

4.纯化表达的重组蛋白的

1. 添加75微升1×纯化缓冲至25微升翻译产物，使100微升纯化的混合物。
2. 加入100微升镍螯合树脂，以100微升净化mixt的中URE。洗镍树脂两次通过加入300微升的dh _{2 O}和300微升的结合缓冲液中。重悬树脂和离心机在14000×g离心1分钟，以去除过量的乙醇。
3. 从步骤加入100微升纯化混合物的4.2至100μl镍螯合树脂并在室温60分钟孵育的混合物。
4. 在14000 XG 1 min离心混合物并收集上清到一个新的管标记为"流过"。
5. 洗涤树脂用100μl1×洗涤缓冲液（20 mM咪唑，250mM的的NaH ₂ PO ₄在pH 8，2.5M NaCl和卫生署₂ O）。离心在14000×g离心1分钟，并在新的管中标记为"洗涤"收集上清液。重复步骤4.5的两倍。
6. 加入100微升1×洗脱缓冲液（100mM咪唑，250mM的的Na ₂ PO ₄在pH 8.0，2.5M NaCl和卫生署₂ O）与该树脂并孵育15分钟。离心在14000×g离心1分钟。做洗脱步骤两次。每时间收集上清到新的离心管和标签为"洗脱"。
7. 洗脱后，如在步骤4.5中所述两次洗涤树脂。商店流经，洗涤和洗脱样品在-20℃或更低。树脂必须储存在4℃。使用30微升各样品进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。

5.考马斯（布拉德福德）蛋白质含量³⁴

1. 与浓度制备标准的牛血清白蛋白（BSA）溶液20微克/毫升（混合10微升BSA（2毫克/毫升）和90微升的dh _{2 O}的），40微克/毫升（混合20微升BSA（2毫克/ ml）和80微升的dh ₂ O）的60微克/毫升（混合30微升BSA（2毫克/毫升）和70微升的dh ₂ O）的80微克/毫升（混合40微升的BSA（2毫克/ ml）和60微升的dh ₂ O），100微克/毫升（混合50微升BSA（2毫克/毫升）和50微升的dh ₂ O）的，160微克/毫升（混合80微升BSA（2毫克/毫升）和20微升卫生署₂ O）和200微克/毫升（100微升BSA（2毫克/毫升）。
2. 措施5微升流过，洗涤和洗脱物样品从步骤4.7。加入95微升的dh ₂ O的
3. 添加5毫升考马斯亮蓝试剂从步骤5.1和5.2的混合物。覆盖用封口膜，涡旋10的管子秒然后孵育20分钟，在RT。
4. 使用分光光度计，测量光密度（OD）在650nm的蛋白管从步骤5.3波长。积浓度与 OD值，以确定该蛋白浓度^34。

6.免疫印迹

1. 加入5微升裂殖提取物P.疟原虫 ，2微升大肠杆菌表达的重组RHOP-3蛋白^31，5微升的重组蛋白的方法，用2-步骤和1-步骤在体外人表达系统和10μl的蛋白产物纯化用亲和法来分离管表达。
2. 添加含巯基乙醇电泳样品缓冲液中向每个管的20微升的最终体积，以使增溶的蛋白质样品。煮沸管2分钟。
3. 加载溶解蛋白质样品到10％SDS-PAGE凝胶分离蛋白质。
4. 通过电泳在半干印迹腔室转移从SDS-PAGE凝胶到硝化纤维素纸（NCP）的分离的蛋白在每凝胶35毫安电流2小时。
5. 块的NCP以下转印用2％脱脂牛奶。
6. 孵育阻断的NCP用稀释1以下多克隆抗体:100在2％牛奶进行蛋白质印迹;兔抗体＃676 ²¹特异性P.疟原虫裂殖子棒状体，鼠抗体^20项具体为P.疟原虫和P.疟原虫裂殖子棒状体，抗血清＃685具体为P.疟原虫寄生泡蛋白，血清（丝氨酸丰富的抗原^）22和抗体特异性的毛雷尔217; S裂蛋白PFMC-2TM ^28。
7. 孵育的NCP也以1:100稀释的正常小鼠和兔血清和从SP2骨髓瘤细胞耗尽培养上清液（SCS）作为阴性对照。
8. 国家联络点孵育在与4ºCO / N抗体和控制。
9. 洗涤的NCP 4倍带印迹缓冲液孵育的NCP用缀合辣根过氧化物酶（HRP）物种特异性的二抗稀释1:1000在2％的牛奶。
10. 国家联络点洗净用4倍缓冲印迹。洗孵育国家联络点与显色液A + B（溶液A:加入50ml 1X印迹缓冲液和30微升H ₂ O _2;溶液B:加入10毫升甲醇和30毫克的3-氯萘酚）30分在黑暗中。色度分析Western blot结果。

结果

通过反应性的特异性抗体表达的重组蛋白的验证是在确认表达的蛋白质的正确折叠的重要的第一步。重组疟疾蛋白采用一步法和两步体外培养的人无细胞表达系统表达。重组蛋白是纯化的镍螯合亲和方法。然后，我们使用抗血清在SDS-PAGE分离的重组蛋白的Western印迹整个裂殖子棒状体。

图1示出PY17X_1139200，PY17X_1402200，PY17X_1366000，PY17X_0830000和PF3D7_1436300在1％琼脂糖?...

讨论

使用两个步骤在体外人细胞表达系统和纯化蛋白的成功表达的重要步骤是:1）成功的扩增和基因引入pT7CFE-CHIS质粒载体的克隆; 2）转录的RNA在^30℃;蛋白3）翻译在30℃在RNA酶抑制剂的存在; 4）开发使用涂覆有镍和5树脂珠）上免疫印迹分析的结果使用多克隆和单克隆抗体的亲和纯化方案。用于使用一个步骤的IVT偶联蛋白翻译系统蛋白质的成功表达的重要步骤是:1）成功的扩增和基因引入pT7CFE-CHI...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-step in vitro human cell free expression system	Thermo Fisher	88856	Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system	Thermo fischer	88860	Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system	Invitrogen	K850-01	Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin	Invitrogen	R801-01	Store at 4oC.
A+ Human Blood	Interstate Blood Bank		Store at 4 °C.