מערכות ביטוי חופשי הנייד מבוסס הלה לביטוי של<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry חלבונים

Summary

ביטוי של חלבוני מלריה במערכות תא מבוסס נותר מאתגר. אנו מדגימים שתי מערכות ביטוי תא חופשי צעד וIVT צעד אחד (בתרגום חוץ גופית) לביטוי חלבוני rhoptry רקומביננטי מלריה מתאי הלה. אנו משתמשים במערכת לטיהור מבוססת זיקת Ni-שרף לטהר את חלבוני rhoptry.

Abstract

המלריה גורמת לתחלואה ותמותה משמעותיות גלובליות. אין חיסון שגרתי זמין כעת. אחת הסיבות העיקריות לחוסר חיסון הוא האתגר של זיהוי מועמדי חיסון מתאימים. חלבוני מלריה הביעו באמצעות מערכות ביטוי תא מבוססות פרוקריוטים ואוקריוטים גרועים הם glycosylated, בדרך כלל לא מסיסות ולעבור קיפול לא נכון המובילים לחיסוני מופחתים. מערכות הביטוי חופשיות תא lysate נבט חיטה, lysate reticulocyte הארנב וcoli Escherichia כיום משמשות לביטוי של חלבוני מלריה. עם זאת, משך זמן ביטוי וglycosylation לא תקינה של חלבונים עדיין אתגר. אנו מדגימים ביטוי של חלבוני Plasmodium במבחנה באמצעות מערכות ביטוי חופשי תא מבוסס הלה, המכונות "מערכות במבחנה אנושיות תא חופשי ביטוי". מערכות ביטוי 2 הלה התא מבוסס חופשיות לתמלל mRNA ב -75 דקות ו -3 μl של transcribאד mRNA מספיק כדי לתרגם חלבונים ב -90 דק '. מערכת הביטוי 1-הצעד היא מערכת ביטוי בשילוב תרגום שעתוק ו; השעתוק ותרגום שיתוף מתרחש בשעה 3. התהליך גם יכול להתארך למשך 6 שעות על ידי אספקת אנרגיה נוספת. במערכת הביטוי 2-הצעד, mRNA הוא עיבד ראשון ולאחר מכן הוסיף לתערובת התרגום לביטוי חלבון. אנו מתארים איך לבטא את חלבוני מלריה; השסוע של PF3D7_0114100 מאוורר הידרופובי - חלבון 2 הטרנסממברני (PfMC-2TM), חלבון PF3D7_0925900 הידרופילי וחוזר ארמדיל המכיל חלבון PF3D7_1361800, באמצעות מערכת הביטוי חופשי תא מבוסס הלה. החלבונים באים לידי ביטוי בכמויות מייקר העסקת אסטרטגיות ביטוי 2-צעד והצעד 1. שיטת טיהור זיקה לטהר 25 μl של חלבונים הביעו באמצעות מערכת חופש הביטוי במבחנה התא אנושי גם מתוארת. תשואת חלבון נקבעה על ידי assay של רדפורד והביעוניתן לאשר חלבונים מטוהרים על ידי ניתוח מערבי סופג. חלבונים רקומביננטי לידי ביטוי יכולים לשמש לחיסונים, immunoassays ורצף חלבון.

Introduction

במחקר מלריה, ביטוי של חלבונים חיסוניים באמצעות מערכות תא פרוקריוטים או אוקריוטים מבוססים עדיין מהווה אתגר. עושר AT של הגנום Plasmodium ומנגנונים שלאחר translational ידועים ^14,7, תורם לקשיים הקשורים בקבלת חלבונים מקופלים וחיסוניים כראוי ללימודי ייצור נוגדנים וחיסון. מערכות פרוקריוטים כגון coli Escherichia שימשו לביטוי חלבון רקומביננטי. מערכות פרוקריוטים הן בעלות נמוכה, יעילות, לייצר תשואות גבוהות של חלבון רקומביננטי ויש לי וקטורי שיבוט מרובים. לארח E. תאי coli הם קל להפוך ותאים לצמוח במהירות. עם זאת, יש לי מערכות פרוקריוטים מגבלות כגון חוסר תחלופה אמינו חומצה, שינוי שלאחר translational, סיכון לזיהום, מוצרים הטרוגניים והצטברות של חלבונים רקומביננטי בתוך גוף הכללה ^24.

במחקר על ידי אל Mehlin et. (2006), 1000 מסגרות פתוחות קריאה (ORF) באו לידי ביטוי. כ -7% מהחלבונים הביעו היו ¹⁴ מסיסים. Insolubility נצפה הוא בשל האופי המגמתי של גנים והתדירות הגבוהה של קודונים המשמשות באופן אידיאלי על ידי Plasmodium AT הגנום עשיר ^14. אסטרטגיה חלופית להתגבר על בעיה זו פותחה על ידי שימוש בפלסמידים או תאי מארח מכילים tRNAs שיכיר קודונים או קודונים התואמים את התדרים ³ נדירים. גם לאחר ביצוע אופטימיזציות אלה, מנות קטנות מאוד של החלבונים באות לידי ביטוי כמסיס, פעיל וחיסוני ^14. מערכות ביטוי התא ללא מכילות את כל הרכיבים דרושים לשעתוק ותרגום כגון ריבוזומים, גורמי ייזום, גורמי התארכות (גורמי תרגומים), tRNA וsynthetases aminoacyl-tRNA. שני תגובות השעתוק ותרגום הם מצמידים ^ב11,29 הליך צעד אחד. Transcriתגובת ption מתבצעת בצינור לפני הכמות המתאימה של mRNA היא מודגרות עם מכונות תרגום ^ב11,29 צינור שונה. למרות ששיטות אלה בהצלחה בPlasmodium sp. ביטוי חלבון, חסרון עיקרי הוא משך זמן לביטוי חלבונים, שהם כ -22 שעות ^29. בנוסף, העלות הגבוהה של ציוד להכללה בפרוטוקולים ^29, הכנות עתירות העבודה של lysate התא וחוסר עקביות בהכנות רכיב, להפוך את המערכות אלה אינן ניתנות להשגה. המוקד העיקרי של חוקרים לפיתוחה של מערכת ביטוי חופשית תא תלוי בגורמים כגון הנדסה גנטית מהירה, תשואות מהירות עם ריכוזים גבוהים והכנות lysate ישר קדימה ^1.

מערכות אוקריוטים כגון שמרים, שורות תאי יונקים, מערכת ביטוי בתיווך baculovirus, thermophilia Tetrahymena, discoideum Dictyostelium ומערכות ביטוי טפילים suפרק כשושנת יריחו שימש לביטוי חלבון רקומביננטי ^7. מערכות אוקריוטים לשתף יחסי פילוגנטי ולכן גם חולקות מאפיינים כגון glycosylation, acylation, אג"ח disulphide היווצרות, אינטראקציה מלווה, proteolysis ומידור תת-תאי. אירועי הפרשת חלבון באאוקריוטים למנוע הצטברות ומקטין רעילות למערכות ביטוי ^13. השימוש בשמרי מערכות עדיפים כפי שהם מתאימים לביטוי חלבון בקנה מידה גדולה ולהשגת תשואות גבוהות ^4. שני פ חלבוני falciparum PfCP-29 וPvs25 הופקו באמצעות מערכת השמרים ^4. עם זאת, חסרון עיקרי בסינתזה של רוב החלבונים היה דפוסי N ו- O-glycosylation לא סדירים, קיפול וחיתוך של חלבונים מהצורה הטבעית שלהם ⁴ לא תקינים.

השימוש בתאי יונקים לסינתזה של חלבונים רקומביננטי הוא עתיר עבודה והוא expensive לשמור שורות תאי רקומביננטי יציבים ^4. לכן, תאי יונקים היו מוגבלים לניתוח איתות חלבון, אינטראקציות חלבון ואינטראקציות טפילות-מארח וגם לבדיקה חיסוני DNA ^4. ה- DNA האנושי ומערכת ה- mRNA במבחנה ביטוי חלבון תא ללא מתואר במסמך זה מערכת תאים שמקורם הלה מבוסס יונקים המבטאת חלבונים ב 3 שעות. חלבונים הביעו באמצעות וקטור ביטוי pT7CFE1-cHis יש תג C-המסוף מאפשר זיהוי וטיהור. המערכת מבוססת הלה הוא השלים עם גורמי חניכת תרגום ותרגום רגולטור, ובכך משפרת את היעילות של מערכת התרגום. חלבונים יכולים להיות מתורגמים במהירות, הוקרנו, מאומת ומעובד לשימוש ביישומים חיסוניים ומבניים שונים ^15.

מערכות ביטוי אוקריוטים תא ללא כגון נבט חיטה וreticulocyte הארנב משמשות כיום לביטוי של varחלבוני אוקריוטים ious כוללים חלבוני Plasmodium ^11,29. בנוסף, ה מערכות תא ללא מבוססות coli גם מועסקות לביטוי חלבון אוקריוטים ^11. טבלת 1 מסכמת מערכות ביטוי תא חופשי שונות על ידי השוואת תכונות של המערכות, כמו גם את קלות שימוש במערכות לביטוי חלבונים. יש מערכת התא ללא אדם בהשוואה לאחרים את היכולת לבצע שינויי פוסט ושיתוף translational ופחות יקר. אופטימיזציה קודון היא אפשרית וניתן לבצע את כל התגובות בשעה 3. מערכת הלה היא מערכת תרגום אידיאלית לסינתזת חלבון במעבדת ההגדרה.

יתרון עיקרי של מערכות ביטוי אנושיות תא חופשי על פני מערכות אחרות תא ללא הוא הזמינות של כמה שורות תאים שונות הנגזרות מאיברים ורקמות שונים. כמה סוגים של מערכות תא ללא יכולים להיות מתוכננים בהתאם לקו התא. התמציתיש לי של מקורם בתאי יונקים יעילות גבוהה יותר לסנתז חלבונים גדולים יותר מכל מערכות ביטוי תא חופשי אחרות. גם מערכות ביטוי תא חופשי אלה יכולים לשמש ביישומי אפיון אבחון וחלבון כגון מערכי מיקרו ^30. שורות תאי הלה הפופולריות הן בשימוש נרחב ביותר לבצע את הביטוי של חלבונים ^33. Reticulum endoplasmic בשורות תאי הלה אינו מפותח, שהוביל להיעדרות של פעילות שינוי glycosylation לאחר translational ^33. עם זאת, הוא האמין במערכת זו כדי להיות יתרון עבור סינתזת חלבון Plasmodium כPlasmodium גם חסר שינוי תרגום ההודעה glycosylation ^29. פרוטוקול תמלול בתרגום החופשי תא הלה הוא קל לביצוע, לא יקר ויכולים לבוא לידי ביטוי חלבונים בדקות 90, מוכן לטיהור ויישומים נוספים במורד הזרם.

Protocol

1. הכנה של תרביות תאים טפיל, אוסף של טפיל פלטות

1. הכן תקשורת RPMI-1640-HEPES על ידי הוספת 10 גרם של האבקה RPMI-1640, 66 מ"ג של סולפט gentamycin, סודיום ביקרבונט 2 גרם, חיץ HEPES 5.9 גר ', 50 hypoxanthine מ"ג ו -3.8 G דקסטרוז בL 1 סטרילי DH ₂ O. מערבבים בעזרת בוחש מגנטי שולחן עד שכל האבקה מתמוססת במים מזוקקים 1 ליטר. בצע סינון מיקרו של תקשורת באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. אחסן את התקשורת בבקבוקים סטריליים.
2. לשטוף נגוע (טרי) הקלד + אריתרוציטים באמצעות RPMI. הכן 5 המטוקריט% מאריתרוציטים (0.5 מיליליטר של אריתרוציטים טריים שטפו ב9.5 מיליליטר 10% + סרום אנושי RPMI).
3. הפוך 15% בסרום אנושי + RPMI (15 מיליליטר של סרום אדם ו -85 מיליליטר של RPMI) ליזום הטיפוח של טפילים. הפוך 10% בסרום אנושי וRPMI (10 מיליליטר של סרום אדם ו -90 מיליליטר של RPMI) להמשיך culturing של טפילים בתאי דם אדומים.
4. תרבות פ falciparum (3D7 וFCR-3 זנים) בסוג+ אדם אריתרוציטים בשעה 5 המטוקריט% וparasitemia 20% בצלחת פטרי או בקבוק תרבות 75 סנטימטר ^3. לשמור על התרבות במבחנה על פי השיטה של טרגר וג'נסן צנצנת נר ^26. לחלופין, לשמור על תרבויות בחממה על 37 מעלות צלזיוס שמירת גז CO ₂ ו -3.4% -9.5% N _2. תרבות פ falciparum בRPMI 1640-HEPES תקשורת בתוספת 10% בסרום אנושי.
5. לסנכרן פ תרבות falciparum ידי הוספת Percoll 65% (65 מיליליטר של Percoll + 35 מיליליטר של RPMI-1640 ללא סרום אנושי) לתרבות להתרכז ^27.
6. צנטריפוגה להתרכז התרבות עם Percoll ב 2500 XG דקות 5 שתוצאת 3 שכבות. בזהירות, בעזרת פיפטה העברה לבודד schizonts מהעברת השכבה האמצעית לתוך צינור נפרד בתנאים אספטיים ^27.
7. שטוף את התרבויות המבודדות עם 10% בסרום אנושי + RPMI-1640 פעמיים כדי להסיר Percoll העודף על ידי צנטריפוגה ב 7500 XG במשך 5 דקות. דיscard supernatant כל זמן בתנאים אספטיים ^27.
8. המשך culturing פ המסונכרן schizonts falciparum בסרום 10% אדם + ²⁷ RPMI-1640.
9. לאסוף schizonts ידי טיפול Plasmodium אריתרוציטים -infected עם 10 מ"מ טריס pH 8.8 וצנטריפוגה ב15000 XG במשך 15 דקות ^23. כדורי טפיל חנות ב -70 ° C הבאים תוספת של 5 μl של מעכב פרוטאז (aprotinin) לכדורים. השתמש כדורי טפיל להפקת חלבון, בידוד הדנ"א הגנומי ובידוד RNA.

2. הכנת פלסמיד וקטור

1. לבודד הדנ"א הגנומי מפ כדורי schizont falciparum מוכנים מתרבויות של parasitemia כ -20%.
2. להוסיף 600 μl של 10mm טריס- HCl של pH 7.6, 50 מ"מ EDTA pH 8.0, SDS 0.1% ו1 מ"ג / מיליליטר proteinase K, לכדורים בצינור microcentrifuge, homogenize גלולה באמצעות מזרק 1 מיליליטר מצורף מחט 26 G. חלופי מילוי המזרקעם תערובת גלולה ופי 20 לרוקן לתוך צינור microcentrifuge. דגירה O homogenate צינור המכיל / N באמבט המים C ° 50.
3. בצע פנול - כלורופורם חילוץ (P + C) על ידי הוספת 600 μl של P + C (300 μl של פנול וμl 300 של כלורופורם) לגלולה הומוגני. צינור כובע בחוזקה ולנער את התערובת במרץ על ידי היפוך קצה לקצה צינור. צינור צנטריפוגה ב 14,000 XG למשך 2 דקות ולאסוף פתרון ימי עליון באמצעות micropipette לתוך צינור microcentrifuge חדש. חזור על פעולה זו פעמיים.
4. להוסיף 600 μl של כלורופורם לשכבה המימית בצינור החדש מצעד 2.1.2. מערבולת הצינור במשך 10 שניות ו צנטריפוגות ב 14,000 XG למשך 2 דקות. מדוד את השכבה המימית העליונה עם micropipette ולהעביר אותו לצינור microcentrifuge חדש.
5. להוסיף 0.1 כרך של pH אצטט 5 M נתרן 5.5 וכרך 1 של isopropanol (אם שכבה מימית היא 300 μl להוסיף 30 μl של pH אצטט 5 M נתרן 5.5 330 + μl של isopropanol) להניח מימייםאה מצעד 2.1.3. דגירה הצינור ב RT במשך 15 דקות.
6. צנטריפוגה צינור על 14,000 XG במשך 10 דקות כדי לזרז גלולה DNA. בטל supernatant ולשטוף גלולה עם 70% אתנול 100 μl (70 μl של אתנול ו -30 μl של DH ₂ O) כדי להסיר עודף מלח מה- DNA. DNA החנות ב -50 μl של DH ₂ O ב -20 ° C.
7. עיצוב קדימה ולהפוך פריימרים באמצעות תוכנה או באופן ידני להגברה של פ גני falciparum PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 וPF3D7_0114100 זוהו בעבר במחקרי proteome ^16,18 עם אתרי הגבלה מתאימים להתיר שיבוט של רצפי גנים לאתרי שיבוט המרובים של פלסמיד ביטוי pT7CFE1-CHis כפי שמוצגים בטבלה 2.
8. הפוך תערובת תגובת 50 μl על ידי הוספה; 5 μl של פ המבודד הדנ"א הגנומי falciparum, 5 μl של 10x חיץ, 5μl של MgCl _2, 1.5 μl של פריימר קדימה, 1.5 μl שלפריימר ההפוך, 0.5 μl של פולימראז T7 DNA ו31.5 μl של DH ₂ O ולבצע תגובת השרשרת של פולימראז (PCR) בשעה 94 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות לdenaturation, 50 מעלות צלזיוס במשך דקות שניות 30 1 להארכה ו -72 מעלות צלזיוס במשך 9 דקות לחישול וrenaturation להגברת גנים שמוצגים בטבלה 1.
9. מוצרי ה- PCR נפרדים על 1% agarose ג'ל (1 גרם של agarose ושל EDTA אצטט טריס 100 מיליליטר (טה) חיץ) ^32.
10. חותך את להקות ה- DNA PCR מוגברות מagarose ג'ל, מניח את פרוסות ג'ל המכילות DNA בטור ספין חילוץ ג'ל DNA ולהקפיא ב -20 ° C במשך 5 דקות. הוסף לisopropanol 100 μl לפרוסות ג'ל הקפואות וצנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות.
11. למדוד מסוננת בצינור האיסוף מהשלב 2.5 הזרימה דרך מימית, באמצעות micropipette ולהעביר לצינור חדש. להוסיף 0.1 כרך של נתרן אצטט 5 M וצנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant ולהוסיף 10 μl של DH ₂ O הגלולה DNA דואר.
12. לעכל את וקטור pT7CFE1-CHis ביטוי ושברי DNA המטוהר (מ -2.6) בשני צינורות נפרדים על ידי הוספת 3 μl של פלסמיד ו -5 μl של מוצרי גן PCR לכל צינור. הוסף לכל צינור, 1 μl של אנזימי הגבלה ספציפיים, 2 μl של חיץ תגובה ו -14 μl של DH ₂ O.
13. הוסף 3 μl של פלסמיד מתעכל, 5 μl של קטעי DNA מתעכלים, 2 μl של 10x חיץ האנזים, μl 1 של האנזים ו -9 μl של DH ₂ O בצינור microcentrifuge. לדגור על 12 מעלות CO / N.
14. להוסיף 0.1 כרך של 3 אצטט M נתרן ב- pH 5.5 ו -2 כרכים של אתנול (אם צינורות קשירת הנפח שלך הוא 20 μl להוסיף 2 μl של 3 אצטט M נתרן + 44 μl של אתנול) לצינור מצעד 2.14. מערבבים היטב דגירה ב -20 ° C במשך 15 דקות.
15. צנטריפוגה צינור על 14,000 XG במשך 15 דקות. מוציא בזהירות את supernatant באמצעות פיפטה מיקרו מבלי להפריע גלולה.
16. להוסיף 70% אתנול לא 100 μlo גלולה מצעד 2.10. צנטריפוגה צינור על 14,000 XG במשך 5 דקות. להסיר ולסלק supernatant. הוסף 10 μl מים nuclease חינם לגלולת DNA.

3. ביטוי חלבון שימוש במערכת ביטוי חינם תאים אנושיים חוץ גופית

1. הכן 20 μl של תערובת שעתוק על ידי מדידת 2 μl של pT7CFE1-CHis פלסמיד דנ"א רקומביננטי, 4 μl של חיץ שעתוק 5x, 4 μl של תערובת NTP, 2 μl של T7 RNA פולימראז ו -8 μl מים nuclease חינם עבור 2-צעד אדם בביטוי חלבון חוץ גופית באמצעות תבניות DNA. מערבבים את המרכיבים בצינור microcentrifuge ו דגירה של 75 דקות ב 30 מעלות צלזיוס באמבט מים.
2. קח 2 μl של תערובת השעתוק ולהוסיף אותו לתערובת של 23 μl תרגום המכילה 12.5 μl של lysate תא הלה, 2.5 μl של חלבוני אבזר, 1 μl של תמיסת מלח, 0.5 μl של חומצות אמינו -Met, 0.5 μl של חומצות אמינו -Leu, 181; L של מעכב RNAse, 1.25 μl של תמהיל אנרגיה ו3.75 μl מים nuclease חינם.
3. דגירה את תערובת התרגום מהשלב 3.2 על 30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. חנות מתורגמת מוצרים ב -20 ° C.
4. הכן 25 μl של שעתוק ותרגום תערובת על ידי הוספת 3 μl של pT7CFE1-CHis פלסמיד דנ"א רקומביננטי, 2 μl מים nuclease חינם, 5 μl של תערובת תגובה, 12.5 μl של lysate הלה ו -2.5 μl של חלבוני אבזר ל1-צעד ביטוי אנושי יחד חלבון IVT לתבניות DNA.
5. דגירה תערובת התגובה מצעד 3.4 למשך 90 דקות עד 6 שעות על 30 מעלות צלזיוס. אחסן את מוצרי התרגום ב -20 מעלות צלזיוס.

4. טיהור של חלבונים רקומביננטי לידי ביטוי

1. להוסיף 75 μl של חיץ טיהור 1x 25 μl של מוצר תרגום לעשות תערובת טיהור 100 μl.
2. להוסיף שרף chelating ניקל 100 μl לטיהור של mixt 100 μlיור. לשטוף Ni-שרף פעמיים על ידי הוספת 300 μl של DH ₂ O ו -300 μl של החיץ המחייב. מחדש להשעות שרף וצנטריפוגות ב 14,000 XG דקות 1 כדי להסיר אתנול עודף.
3. להוסיף תערובת של טיהור 100 μl מצעד 4.2-100 μl של שרף chelating ניקל ודגירה את התערובת למשך 60 דקות ב RT.
4. צנטריפוגה את התערובת על 14,000 XG דקות 1 ולאסוף supernatant לתוך צינור טרי שכותרתו "לזרום דרך".
5. שרף לשטוף עם של חיץ לשטוף 1x 100 μl (imidazole 20 מ"מ, O מ"מ לאא ₂ PO ₄ ב- pH 8, 2.5 M NaCl וDH ₂ 250). צנטריפוגה ב 14,000 XG דקות 1 ולאסוף supernatant בצינור הטרי שכותרתו "לשטוף". חזור על שלב 4.5 פעמיים.
6. להוסיף למאגר elution 1x 100 μl (100 מ"מ Imidazole, 250 מ"מ Na ₂ PO ₄ ב- pH 8.0, 2.5M NaCl וDH ₂ O) לשרף והדגירה במשך 15 דקות. צנטריפוגה ב 14,000 XG דקות 1. האם צעד elution פעמיים. כלזמן לאסוף supernatant לתוך צינורות טריים microcentrifuge ותווית כ" eluate ".
7. לאחר elution, לשטוף שרף פעמיים כמתואר בשלב 4.5. חנות לזרום דרך, מתרחץ ודגימות elution ב -20 ° C או נמוך יותר. שרף חייב להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס. השתמש 30 μl של כל דגימה לSDS-PAGE וניתוח immunoblotting.

Coomassie חלבון 5. (רדפורד) Assay ³⁴

1. הכן את פתרונות אלבומין בסרום שור הסטנדרטי (BSA) עם הריכוז 20 מיקרוגרם / מיליליטר (10 לערבב μl של BSA (2 מ"ג / מיליליטר) ו -90 μl של DH ₂ O), 40 מיקרוגרם / מיליליטר (20 לערבב μl של BSA (2 מ"ג / מיליליטר) ו -80 μl של DH ₂ O), 60 מיקרוגרם / מיליליטר (30 לערבב μl של BSA (2 מ"ג / מיליליטר) ו -70 μl של DH ₂ O), 80 מיקרוגרם / מיליליטר (40 לערבב μl של BSA (2 מ"ג / מיליליטר) ו -60 μl של DH ₂ O), 100 מיליליטר / ק"ג (לערבב 50 μl של BSA (2 מ"ג / מיליליטר) ו -50 μl של DH ₂ O), 160 מיקרוגרם / מיליליטר (80 לערבב μl של BSA (2 מ"ג / מיליליטר) ו -20 μl של DH₂ O) ו -200 מיקרוגרם / מיליליטר (של BSA 100 μl (2 מ"ג / מיליליטר).
2. מדד 5 μl של זרימה דרך, מתרחץ ודגימות eluate מצעד 4.7. להוסיף 95 μl של DH ₂ O.
3. הוסף 5 מיליליטר של מגיב הכחול Coomassie לתערובות מצעדים 5.1 ו -5.2. לכסות את הצינורות עם parafilm ומערבולת למשך 10 שניות ואז דגירה של 20 דקות ב RT.
4. באמצעות ספקטרופוטומטר, למדוד צפיפות אופטית (OD) באורך הגל של 650 ננומטר לצינורות חלבון מצעד 5.3. ריכוז עלילה לעומת קריאת OD כדי לקבוע את ריכוז החלבון ^34.

6. מערבי סופג

1. הוסף 5 μl של תמציות schizont מפ falciparum, 2 μl של Escherichia coli הביע Rhop-3 חלבונים רקומביננטי ^31, 5 μl של חלבונים רקומביננטי לידי ביטוי באמצעות 2-צעד וצעד 1 במערכות ביטוי אנושיות מבחנה 10 μl של מוצרי חלבון מטוהרים בשיטת זיקה להפריד צינורות.
2. להוסיף mercaptoethanol מכיל מאגר מדגם אלקטרופורזה על צינור אחד עבור נפח סופי של 20 μl לעשות דגימות חלבון solubilized. מרתיחים צינורות במשך 2 דקות.
3. לטעון דגימות חלבון solubilized על ג'לי SDS-PAGE 10% להפריד חלבונים.
4. העבר את החלבונים הופרדו מג'לי SDS-עמוד לנייר nitrocellulose (NCP) על ידי electrophoresing ב 35 mA הנוכחי לג'ל בתא מערבי סופג חצי יבש לשעה 2.
5. בלוק NCPs בעקבות העברה עם 2% חלב ללא שומן.
6. דגירה חסומה NCPs עם נוגדני polyclonal הבאים בדילול 1: 100 ב 2% חלב לבצע מערבי סופג; נוגדן ארנב # 676 ²¹ ספציפי לפ rhoptries merozoite falciparum, נוגדנים ספציפיים לעכבר ²⁰ פ yoelii ופ rhoptries berghei merozoite, antisera # 685 ספציפי לפ חלבון vacuole parasitophorous falciparum, סרה (אנטיגן סרין העשיר) ²² ונוגדנים ספציפיים למאוורר217; s חלבון שסוע PfMC-2TM ^28.
7. גם דגירה NCPs ב 1: 100 פקדי עכבר וסרום הארנבת וsupernatant התרבות בילתה (SCS) מתאי מיאלומה SP2 רגילים מדוללים שליליים.
8. דגירה NCPs עם נוגדנים ובקרות על 4 המעלות צלזיוס O / N.
9. לשטוף NCPs 4x עם כתם חיץ דגירה NCPs עם נוגדנים ספציפיים משניים מינים מצומדת לperoxidase חזרת (HRP) בדילול 1: 1000 ב 2% חלב.
10. לשטוף NCPs 4x עם חיץ כתם. דגירה שטפה NCPs עם פתרון פיתוח הצבע + B (פתרון: להוסיף 50 מ"ל של 1x כתם חיץ ו -30 μl של H ₂ O _2; פתרון B: להוסיף 10 מיליליטר של מתנול ו -30 מ"ג של 3-כלורו-naphtol) במשך 30 דקות בחושך. לנתח את תוצאות כתם מערביות colorimetrically.

תוצאות

אימות של החלבונים רקומביננטי לידי ביטוי בתגובתיות עם נוגדנים ספציפיים היא צעד ראשון חשוב במאשר את הקיפול הנכון של החלבונים הביעו. חלבוני מלריה רקומביננטי באו לידי ביטוי באמצעות צעד אחד ושני צעד במערכות ביטוי מבחנה תא אנושי חופשיות. החלבונים רקומביננטי הם שיטת זיקת ...

Discussion

הצעדים החשובים לביטוי מוצלח של חלבונים באמצעות שני צעד במערכת המבחנה תא אנושי חופשית ביטוי וטיהור הם: 1) הגברה ושיבוט של גנים לתוך וקטור פלסמיד pT7CFE-CHis מוצלחות; 2) לתעתוק RNA ליום 30 בC ^o; 3) תרגום של חלבון על 30 מעלות צלזיוס בנוכחות מעכב RNAse; 4) פיתוח פרוטוקול טיהור הזיקה ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-step in vitro human cell free expression system	Thermo Fisher	88856	Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system	Thermo fischer	88860	Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system	Invitrogen	K850-01	Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin	Invitrogen	R801-01	Store at 4oC.
A+ Human Blood	Interstate Blood Bank		Store at 4 °C.