İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteinler

Özet

Hücre temelli sistemlerde sıtma proteinlerin sentezlenmesi zor kalır. Biz HeLa hücrelerinden sıtma rekombinant proteinleri ifade rhoptry için iki adım ve (in vitro çeviri) bir adım IVT hücresi serbest ifade sistemlerini göstermektedir. Biz rhoptry proteinleri saflaştırmak için bir Ni-afinite reçinesi bazlı saflaştırma sistemini kullanır.

Özet

Sıtma önemli küresel morbidite ve mortaliteye neden. Hiçbir rutin aşı mevcut değildir. Bir aşının olmaması için en önemli nedenlerinden biri, uygun aşı adayları belirleme mücadeledir. Sıtma proteinleri prokaryotik ve ökaryotik hücre tabanlı ifade sistemleri zayıf düşürülmüş immünojenikliği giden uygunsuz katlama, genellikle çözünmez glıkosıle ve tabi olan kullanarak dile getirdi. buğday tohumu, tavşan retikülosit lizat ve Escherichia coli lisat hücresiz sentezleme sistemleri şu anda sıtma protein ekspresyonu için kullanılmaktadır. Ancak, ifade, zaman ve proteinlerin yanlış glikolizasyonu uzunluğu hala bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu "in vitro insan hücre serbest sentezleme sistemleri" olarak adlandırılan HeLa göre hücresiz sentezleme sistemleri kullanılarak in vitro Plasmodium proteinlerin sentezlenmesini göstermektedir. 2 HeLa tabanlı cep özgür ifade sistemleri 75 dakika ve transcrib 3 ul mRNA uyarlamaked mRNA, 90 dakika proteinleri çevirmek yeterlidir. 1 adım sentezleme sistemi, bir transkripsiyon ve translasyon bağlanmış sentezleme sistemidir; transkripsiyonu ve eş için 3 saat içinde oluşur. süreci de ek enerji sağlayarak 6 saat süreyle uzatılabilir. 2 adımlı sentezleme sisteminde, mRNA, ilk transkripsiyonu ve daha sonra protein ekspresyonu için yapıldı karışımına ilave edildi. Biz sıtma proteinleri ifade açıklanmıştır; bir hidrofobik PF3D7_0114100 Maurer'in Yarık - 2 transmembran (KMYKK-2TM) proteini, bir hidrofilik PF3D7_0925900 proteini ve HeLa göre hücresiz sentezleme sistemi kullanılarak protein PF3D7_1361800 ihtiva eden bir armadillonun tekrarlar. Proteinler 2-adım ve 1 adım ifadesi stratejilerini kullanan mikro hacimlerde ifade edilir. Bir afinite saflaştırma yöntemi de tarif edilir ve in vitro insan hücre serbest sentezleme sistemi kullanılarak ifade edilen proteinlerin 25 ul saflaştırmak için. Protein verimi Bradford tahliliyle belirlenir ve ekspreseve saflaştırılmış proteinler Western lekesi analizi ile teyit edilebilir. Sentezlenen rekombinant proteinler, aşılar, bağışıklık ve protein dizilemesi için kullanılabilir.

Giriş

Sıtma araştırmada, prokaryotik ya da ökaryotik hücre bazlı sistemler kullanılarak imünojenik protein ekspresyonu, bir sorun olmaya devam etmektedir. Plasmodium genomu ve bilinmeyen post-translasyonel mekanizmalar ^14,7, AT zenginliği, antikor üretimi ve aşı çalışmaları için uygun bir şekilde katlanmış ve immünojenik proteinlerini elde etmekle bağlantılı güçlükler katkıda bulunur. Escherichia coli gibi prokaryotik sistemlerde rekombinan protein ekspresyonu için kullanılmaktadır. Prokaryotik sistemleri, etkili, düşük maliyetli olan rekombinant proteinin yüksek verimlerinin üretilmesi ve birden çok klonlama vektörleri. E. Ev Sahipliği E. coli hücrelerini dönüştürmek için kolay ve hızlı bir şekilde hücreler büyür. Bununla birlikte, prokaryotik sistemler gibi amino asit ikamesi, post-translasyonel modifikasyon, inklüzyon gövdelerinin ²⁴ içinde kirlenme heterojen ürünlerin ve rekombinant proteinlerin birikmesi riski eksikliği gibi sınırlılıklara sahiptir.

IçindeMehlin ve arkadaşları tarafından çalışma. (2006), 1000, açık okuma çerçeveleri (ORF) olarak ifade edildi. Ifade edilen proteinlerin yaklaşık% 7 çözünen ¹⁴ idi. gözlenen çözünmeme genlerinin önyargılı doğası ve zengin genom ¹⁴ AT Plasmodium tarafından ideal kullanılan kodonların yüksek frekans kaynaklanmaktadır. Bu problemin üstesinden gelmek için bir alternatif strateji, plazmidler veya nadir kodonları ya da frekansları ³ eşleşen kodonları tanıyan tRNAs ihtiva eden konakçı hücreler kullanılarak geliştirilmiştir. Hatta bu en iyi duruma gerçekleştirdikten sonra, proteinler, çok küçük bölümleri, çözülebilir aktif ¹⁴ imünojenik olarak ifade edilmiştir. hücresiz sentezleme sistemleri, ribozom, başlatma faktörleri, uzatma faktörleri (çevirileri faktörler), tRNA ve aminoasil-tRNA sentetaz olarak transkripsiyonu ve translasyonu için gerekli olan tüm bileşenleri içerir. Hem transkripsiyon ve translasyon reaksiyonları tek aşamalı prosedür ^11,29 içinde birleştirilir. transcrimRNA uygun bir miktar farklı boru ^11,29 çeviri makine ile inkübe edilmeden önce ption Reaksiyon tüpü içinde gerçekleştirilir. Bu yöntemler, Plasmodium sp., Protein ekspresyonu başarılı olsa da, önemli bir dezavantajı, yaklaşık 22 saat ²⁹ olan protein ekspresyonu için zaman dilimidir. Buna ek olarak, protokoller ²⁹ eklenmek üzere malzeme yüksek maliyet, bileşen hazırlıkları emek-yoğun hücre lizatının hazırlıkları ve tutarsızlıklar, bu sistemler ulaşılamaz olun. Bir hücre özgür ifade sisteminin geliştirilmesi için araştırmacıların ana odak bu hızlı genetik modifikasyon, yüksek konsantrasyonlarda ve yalındır lisatı hazırlıkları ¹ hızlı verim gibi faktörlere bağlıdır.

Maya, memeli hücre çizgileri, bakulovirüs dolayımlı sentezleme sistemi, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum ve parazitik ekspresyon sistemleri su olarak ökaryotik sistemlerdeLeishmania olarak kanal yeniden birleştirici protein ekspresyonu ⁷ kullanılmaktadır. Ökaryotik sistemler filogenetik ilişkiyi paylaşmak ve bu nedenle de bu tür glikosilasyon, asilleme, disülfür bağı oluşumu, hastabakıcı etkileşimi, proteoliz ve alt hücresel bölümlendirme gibi özelliklere paylaşabilirsiniz. Ökaryotlarda protein salgılanması olayları birikmesini önlemek ve ifade sistemleri ¹³ toksisite azalır. bunlar, büyük ölçekli protein ekspresyonu için ve yüksek verim ⁴ elde etmek için uygun olan maya sistemlerinin kullanılması tercih edilir. İki P. falsiparum proteinleri PfCP-29 ve Pvs25 maya sistemi ⁴ kullanılarak elde edilmiştir. Bununla birlikte, proteinlerin çoğu sentezinde önemli bir dezavantajı, düzensiz N ve O-glikosilasyon modelleri, uygun olmayan katlama ve doğal biçiminde ⁴ proteinlerin kesme oldu.

Rekombinant proteinlerin sentezi için memeli hücrelerinin kullanımı, emek yoğun ve masraflı olup bustabil yeniden birleştirici hücre çizgileri ⁴ muhafaza etmek sive. Bu nedenle, memeli hücreleri, protein sinyalizasyon, protein etkileşimleri ve parazit konakçı etkileşimleri analiz için sınırlı kalmıştır ve DNA aşıları ⁴ test etmek için. Burada tarif edilen insan DNA'sı ve mRNA in vitro protein ekspresyonu, hücre içermeyen sistemi 3 saat proteinleri eksprese eden bir HeLa hücre-türevli, memeli-bazlı bir sistemdir. Proteinler kimlik ve saf hale getirilmesini kolaylaştıran bir C-terminali etiket pT7CFE1-CHIS ekspresyon vektörü olan kullanılarak ifade edilir. HeLa tabanlı sistem, böylece çeviri sisteminin etkinliğinin artırılması, çeviri başlatma faktörleri ve çeviri regülatörü ile takviye edilmiştir. Proteinler hızla çevrilmiştir filtrelenmiş, belirlenmiş ve çeşitli immünolojik ve yapısal uygulamalar ¹⁵ kullanılmak üzere işlenebilir.

Buğday tohumu ve tavşan retikülosit gibi ökaryotik hücre içermeyen sentezleme sistemleri şu anda var ekspresyonu için kullanılanPlasmodium proteinleri de dahil olmak üzere ^11,29 ious ökaryotik proteinler. Buna ek olarak, E. E. coli göre hücre içermeyen sistemler de ökaryotik protein ekspresyonu için kullanılmaktadır ^11. Tablo 1, sistemin özelliklerinin yanı sıra, protein ekspresyonu için sistemler kullanılarak kolaylığı karşılaştırarak farklı hücre serbest sentezleme sistemleri özetlemektedir. diğerlerine kıyasla insan hücresi serbest sistemi sonrası ve co-translasyonel modifikasyonlar yapmak yeteneğine sahiptir ve daha az pahalıdır. Kodon optimizasyonu da mümkündür ve bütün reaksiyonlar, 3 saat içinde uygulanabilir. HeLa sistem laboratuvar ortamında protein sentezi için ideal bir çeviri sistemidir.

Diğer hücre barındırmayan sistemler üzerinde insan hücre serbest sentezleme sistemlerinin önemli bir avantajı, farklı organ ve dokularda türetilen birkaç farklı hücre hatları mevcudiyetidir. Hücresiz sistemlerin pek çok çeşidi, hücre hattı ile ilgili olarak dizayn edilebilir. özütMemeli hücrelerinden türetilen ler başka hücre özgür ifade sistemlerine göre büyük proteinleri sentezlemek için yüksek verimliliğe sahiptir. Bu hücresiz sentezleme sistemleri, aynı zamanda, mikro dizileri ³⁰ gibi teşhis ve protein karakterizasyon uygulamalarında kullanılabilir. Popüler HeLa hücre hatları, en yaygın olarak protein ³³ ekspresyonunu gerçekleştirmek için kullanılır. HeLa hücre hatları, endoplazmik retikulum post-translasyonel glikosilasyon modifikasyon aktivitesi ³³ yokluğuna yol az gelişmiştir. Bununla birlikte, bu sistem, aynı zamanda, Plasmodium glikosilasyon sonrası değişikliği bir ²⁹ yoksun olarak Plasmodium protein sentezi için yararlı olduğuna inanılmaktadır. HeLa hücre serbest transkripsiyon için protokol, ucuz, kolay uygulanabilir ve proteinlerin saflaştırılması ve daha sonraki alt akış uygulamaları için hazır, 90 dakika içinde ifade edilebilir.

Protokol

Parazit Hücre Kültürleri 1. Hazırlık, Parazit Peletleri Koleksiyonu

1. 1 L RPMI-1640 tozun 10 g, gentamisin sülfat, 66 mg, 2 g sodyum bikarbonat, 5.9 g HEPES tamponu, 50 mg hipoksantin ve 3.8 g dekstroz eklenerek RPMI-1640-HEPES ortamları hazırlamak steril dH ₂ O 1 L damıtılmış su içinde her türlü toz çözünene kadar Tablo manyetik karıştırıcı ile karıştırın. 0.22 mikron filtre kullanarak medya mikro filtrasyon gerçekleştirin. Steril şişelerde medyayı saklayın.
2. Bulaşmamış (taze) yıkayın RPMI kullanarak A + eritrositleri yazın. Eritrositlerin% 5 hematokrit (9.5 mi,% 10 RPMI + insan serumu içinde yıkandı, taze eritrositlerin 0.5 ml) hazırlayın.
3. % 15 insan serumu + RPMI (insan serumu ve 15 ml RPMI 85 mi) parazitlerin ekimi başlatmak için yapın. % 10 insan serumu ve RPMI (insan serumu ve 10 ml RPMI 90 mi), kırmızı kan hücreleri parazitlerin kültürlenmesini devam edin.
4. Kültür P. falsiparum (3D7 ve FCR-3 suşları) tip% 5 ve% 20 hematokrit parazitemya petri veya 75 cm ³ kültür şişesi A + insan eritrosit. Trager ve Jensen mum kavanozu ²⁶ yöntemine göre, in vitro olarak kültür muhafaza edin. Alternatif olarak, kültürler% 9.5 _CO2 ve% 3.4 _N2 gazı muhafaza 37 ° C'de inkübatör içinde korumaktadır. Kültür P. falciparum'un RPMI 1640-HEPES ortam,% 10 insan serumu ile takviye edilmiştir.
5. P. senkronize % 65 Percoll kültürüne (Percoll + insan serum olmadan RPMI-1640 içinde 35 mi, 65 ml) ilave edilerek falciparum kültürü ²⁷ konsantre edilir.
6. 3 kat sonuçlanan 5 dakika 2500 xg'de Percoll'un kültür konsantresini santrifüjleyin. Dikkatle, bir transfer pipet kullanarak aseptik koşullarda ²⁷ altında ayrı bir tüp içine orta tabaka transferi schizontsun izole.
7. 5 dakika boyunca 7500 x g'de santrifüjleme ile, fazla Percoll temizlemek için iki kez% 10 insan serumu + RPMI-1640 ile izole edilmiş kültürleri yıkayın. DiSüpernatan, aseptik koşullar altında ²⁷ her scard.
8. Senkronize P. kültürleme Devam % 10 insan serumu + ²⁷ RPMI-1640 falciparum şizont.
9. 10 mM Tris pH 8.8 ile Plasmodium enfekte olan eritrositlerin tedavisi ve 15 dakika ²³ 15000 xg'de santrifüjleme ile schizontsun toplayın. Peletlere proteaz inhibitörü (aprotinin) içinde 5 ul ilave edildikten sonra -70 ° C'de saklayın, parazit topakları. Protein ekstre etme, genomik DNA izolasyonu ve RNA izolasyonu için parazit topakları kullanın.

2. plazmid vektörünün hazırlanması

1. P. genomik DNA izole yaklaşık% 20 parazitemya kültürlerinden hazırlanabilir falsiparum şizont peletler.
2. Bir mikrosantrifüj tüpü içinde peletlere pH 7.6 olan 10 mM Tris-HCI, 50 mM EDTA, pH 8.0,% 0.1 SDS ve 1 mg / ml proteinaz K, 600 ul ekle 26 G iğne takılı bir 1 ml şırınga ile pelet homojenleştirin. Şırınga doldurma AlternatifPelet karışımı bir mikrosantrifüj tüpü içine boşalma 20 kez. Bir 50 ° C su banyosu içinde tüp içeren homojenat O / N inkübe edin.
3. P + C, 600 ul (300 ul fenol ve kloroform 300 ul) homojenize edilmiş pelet eklenerek, kloroform (P + C) çıkarma - fenol gerçekleştirin. Cap tüpü sıkıca ve tüp uçtan uca ters çevirerek kuvvetlice karışımı sallayın. 2 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin ve tüp yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine bir mikropipet kullanılarak, üst sulu çözelti toplar. İki kez bu adımı yineleyin.
4. Aşama 2.1.2 yeni bir tüp içinde, sulu tabaka kloroform 600 ul ekle. 2 dakika için 14,000 x g'de 10 saniye ve santrifüj tüpü vorteksleyin. Bir mikropipet ile üst sulu tabaka ölçün ve yeni bir mikrosantrifüj tüp transfer.
5. Sulu, yumurtlama (sulu katman, 300 ul 5 M sodyum asetat pH izopropanol 5.5 + 330 ul, 30 ul ise), 5 M sodyum asetat pH 5.5 ve 0.1 hacim izopropanol ile 1 hacim eklemeadım 2.1.3 den er. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin tüpü.
6. DNA pelet çökeltmek için 10 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin tüpü. Süpernatant atılır ve DNA fazla tuzu çıkarmak için% 70 etanol içinde 100 ul (etanol içinde 70 ul ve dH ₂ O 30 ul) ile pelet yıkayın. -20 ° C'de dH ₂ O 50 ul saklayın DNA arasında değişir.
7. P. yükseltilmesi için elle ileri Tasarım ve yazılımı kullanarak ters primerleri veya Tablo 2'de gösterildiği gibi, falsiparum genleri PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 ve PF3D7_0114100 önce proteome çalışmaları sentezleme plasmidi pT7CFE1-CHIS'in çoklu klonlama sitelerinin gen dizilerinin klonlanması izin vermek için uygun sınırlama siteleri ile ^16,18 tespit etmesidir.
8. Ilave bir 50 ul reaksiyon karışımı yapmak; Izole edilmiş P. 5 ul falsiparum genomik DNA'sı, 10x tampon 5 ul, _MgCl2 5ul, ileri primer, 1.5 ul, 1.5 ulters primer, T7 DNA polimerazı 0.5 ul dH ₂ O 31.5 ul ve denatürasyon için 8 dakika boyunca 94 ° C 'de, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yerine, uzatma 1 dakika 30 saniye için 50 ° C, 9 72 ° C Tablo 1 'de gösterilen genlerin amplifiye edilmesi için tavlama ve renatürasyon için min.
9. % 1 agaroz jeli (agaroz 1 g Tris asetat EDTA, 100 ml (TAE) tamponu) ³² ile ayrı ayrı PCR ürünleri.
10. Agaroz jelinden PCR ile çoğaltılan DNA bantları kesin bir DNA jel özütleme spin kolon DNA ihtiva eden jel dilimleri yerleştirmek ve 5 dakika boyunca -20 ° C'de dondurun. 5 dakika için 14,000 x g'de donmuş jel dilimlerinin ve santrifüj izopropanol 100 ul ekle.
11. Mikropipet kullanılarak sulu akış yoluyla adım 2.5 arasında bir toplama tüpü içinde, süzüldü ölçülür ve yeni bir tüpe aktarılır. 5 dakika için 14,000 x g'de 5 M sodyum asetat ve santrifüj 0.1 hacim ekleyin. Süpernatantı atın ve inci dH ₂ O 10 ulE DNA pelleti.
12. Plazmid 3 ul ve her bir tüpe, PCR gen ürünlerinin 5 ul ekleyerek iki ayrı tüplerde pT7CFE1-CHIS ekspresyon vektörü ve (2.6) ile birlikte saflaştınlmış DNA fragmanlarının Digest. Her bir tüpe belirli bir kısıtlama enzimleri 1 ul reaksiyon tampon maddesi, 2 ul ve dH ₂ O 14 ul ekle
13. Sindirilmiş plasmid 3 ul, sindirilmiş DNA fragmanlarının 5 ul 10x ligaz tampon maddesi, 2 ul, ligaz 1 ul bir mikrosantrifüj tüpü içinde dH ₂ O 9 ul ekle. 12 ° CO / N inkübe.
14. PH 5.5 ve 2 hacim etanol ile 3 M sodyum asetat ve 0.1 hacim ekleme adımında 2.14 tüpe (daki bağlama borular hacmi ise 20 ul 3 M sodyum asetat, etanol içinde, + 44 ul 2 ul). İyice karıştırın ve 15 dakika boyunca -20 ° C'de inkübe edin.
15. 15 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin tüpü. Dikkatle pelet bozmadan mikro pipet kullanarak süpernatant kaldırmak.
16. % 70 etanol, t, 100 ul ekleadım 2.10 den pelet o. 5 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin tüpü. Süpernatantı çıkarın ve atın. DNA pelet nükleaz içermeyen su, 10 ul ekle.

Vitro İnsan Hücre Özgür İfade Sistemde Kullanılması 3. Protein Ekspresyonu

1. Rekombinant pT7CFE1-CHIS plazmid DNA, 2 ul 5x transkripsiyon tamponu 4 ul NTP karışımı 4 ul, T7 RNA Polimeraz 2 ul ve nükleaz içermeyen su 8 ul 2-adım için ölçülerek transkripsiyon karışımından 20 ul hazırlanması DNA şablonları kullanarak Vitro Protein Ekspresyonu İnsan. Mikrosantrifüj tüpü içinde karıştırın ve bir su banyosunda 30 ° C'de 75 dakika inkübe edilir.
2. Transkripsiyon karışımı 2 ul almak ve HeLa hücre lisatı, 12.5 ul, yardımcı proteinler 2.5 ul tuz çözeltisi A 1 ul, amino asitler 0.5 ul Met, amino asitler 0.5 ul ihtiva eden için karışım 23 ul eklemek Leu, 181; RNaz inhibitörü l, enerji karışımları 1.25 ul ve nükleaz içermeyen su 3.75 ul.
3. 90 dakika boyunca 30 ° C 'de aşama 3.2 için karışımı inkübe edin. Mağaza -20 ° C'de ürünleri çevrilmiştir.
4. 1-adım için rekombinant pT7CFE1-CHIS plasmid DNA 3 ul, nükleaz içermeyen su, 2 ul reaksiyon karışımı 5 ul HeLa lizat 12.5 ul ve yardımcı proteinlerinin 2.5 ul ekleyerek transkripsiyon ve çeviri karışımı 25 ul hazırlanması DNA şablonları İnsan Coupled IVT Protein Ekspresyonu.
5. 30 ° C'de 90 dakika ila 6 saat süreyle için adım 3.4 reaksiyon karışımı inkübe edin. Çeviri ürünleri de Mağaza -20 ° C.

Sentezlenen rekombinant proteinler, 4. saflaştırılması

1. Bu saflaştırma karışımına 100 ul yapmak için ürünün 25 ul 1x saflaştırma tamponunda 75 ul ekle.
2. Saflaştırma mikst 100 ul nikel kenetleme reçinesi 100 ul ekleure. Yıkama Ni-reçine iki kez dH ₂ O 300 ul ve bağlayıcı tampon 300 ul ekleyerek. Aşırı etanolü ortadan kaldırmak için 1 dakika için 14,000 x g'de reçine ve santrifüj yeniden askıya.
3. Aşama nikel kenetleme reçinesi 4,2-100 ul saflaştırma karışımına 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 60 dakika süreyle inkübe karışımı.
4. 1 dakika boyunca 14.000 xg'de karışımı Santrifüj ve "akışı" olarak etiketlenmiş Taze bir tüp içine süpernatant toplamak.
5. 1x yıkama tamponu içinde 100 ul (20 mM imidazol, 250, pH 8 mM NaH ₂ PO _4, 2.5 M NaCl ve dH ₂ O) ile yıkayın reçinesi. 1 dakika boyunca 14.000 xg'de Santrifüj ve "yıkama" etiketli taze tüp içinde süpernatant toplamak. Adımı yineleyin 4.5 kez.
6. 1x elüsyon tamponu 100 ul ekle (pH 8.0, 100 mM imidazol, 250 mM _Na-2 PO _4, 2.5 M NaCI ve DH ₂ O) reçineye ve 15 dakika boyunca inkübe edin. 1 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin. İki kez elüsyon adımı yapın. Herzaman "elüat" taze mikrosantrifüj tüpleri ve etiket içine süpernatant toplamak.
7. Aşama 4.5 de tarif edildiği gibi yıkanmasından sonra, iki kez reçine yıkayın. Mağaza -20 ° C veya daha düşük sıcaklıklarda aracılığıyla yıkar ve elüsyon örnekleri akış. Reçine, 4 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir. SDS-PAGE ve immunoblotting analizi için, her numune için 30 ul kullanın.

5. Coomassie (Bradford) Protein Deneyi ³⁴

1. Konsantrasyon, standart sığır serum albümini (BSA) çözelti hazırlayın 20 ug / ml, 40 ug / ml (BSA içinde 20 ul karışımı (BSA (2 mg / ml) ve dH ₂ O 90 ul 10 ul karışımı) (2 mg / ml) ve DH ₂ O), 80 ul, 60 ug / ml ((2 mg BSA (2 mg / ml) ve DH ₂ O), 70 ul, 80 ug / ml (BSA içinde 40 ul karışımı 30 ul karıştırın / ml) ve DH ₂ O), 60 ul, 100 ug / ml (BSA (2 mg / ml) 50 ul ve DH ₂ O) 50 ul, 160 ug / ml (BSA içinde 80 ul mix (2 mg / ml) ve dH 20 ul₂ O) ve 200 ug / ml (BSA, 100 ul (2 mg / ml).
2. Ölçü aşama 4,7 boyunca akış, yıkama ve elüat numune 5 ul. DH ₂ O. 95 ul ekleyin
3. Adım 5.1 ve 5.2 arasında karışımlarına Coomassie mavisi reaktif 5 ml. Sn daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir, 10 için parafilm ve vorteks Tüpleri örtün.
4. Bir spektrofotometre kullanılarak, Aşama 5.3 protein borular 650 nm dalga boyunda optik yoğunluk (OD) ölçün. OD okuma vs Plot konsantrasyonu protein konsantrasyonlarını belirlemek için ^34.

6. Western Blot

1. P. şizont özler 5 ul ekle falciparum, Escherichia coli 2 ul rekombinant rhOP-3 proteinler ³¹ belirtilmiştir, yeniden birleştirici proteinlerin 5 ul tüpleri ayırmak için afinite yöntemi kullanılarak 2-adım ve in vitro insan ekspresyon sistemlerinde 1 adım ve protein ürünleri 10 ul saflaştırılmış kullanılarak ifade edilir.
2. Çözündürülmüş protein örnekleri yapmak için 20 ul bir son hacim için, her bir tüpe elektroforez örnek tamponu ihtiva eden merkaptoetanol ekleyin. 2 dakika süreyle tüpleri kaynatın.
3. Proteinleri ayırmak için% 10 SDS-PAGE jelleri üzerine çözündürülmüş protein örneklerinin yükleyin.
4. 2 saat için bir yarı kuru VVestern blot odasındaki jel başına 35 mA akımda elektroforezlenerek nitroselüloz kağıda (NCP), SDS-PAGE jelleri ayrılmış proteinler aktarın.
5. % 2 yağsız süt ile transferi aşağıdaki Blok NCP'ler.
6. Inkübe 1 seyreltilmiş aşağıdaki poliklonal antikorlarla NCP'ler bloke: batı blotting gerçekleştirmek için% 2 süt 100; tavşan antikoru P. özgü 676. ²¹ falsiparum Merozoit rhoptries, P. ^20, belirli fare antikorları ve P. yoelii P. özgü berghei Merozoit rhoptries antiserumlar # 685 Maurer için spesifik falsiparum parasitophorous vacuole'nin proteini, SERA (serin bakımından zengin antijeni) ²² ve antikorlar217; s yarık protein KMYK-2TM ^28.
7. 1 de NCP'ler inkübe: 100 seyreltilmiş normal fare ve tavşan serumu ve SP2 miyelom hücrelerinin harcanan kültürün üzerinde yüzer (SCS) olarak negatif kontroller.
8. 4 ºC O / N de antikorlar ve kontroller ile NCP'ler kuluçkaya yatmaktadır.
9. Blot ile yıkayın NCP 4x tampon ve yaban turpu peroksidazı (HRP) konjuge edilmiş türler, belirli sekonder antikor ile inkübe NCP suyla 1: 2,% süt 1000.
10. Leke tamponu ile yıkayın NCP 4x. Inkübe renk gelişimi çözeltisi ile yıkandı, NCP A + B (Çözelti A: tampon 1x Blot 50ml ekleyebilir ve _{H2O 2} 30 ul; Çözelti B: 10 ml metanol ve 3-kloro-naftol, 30 mg) eklemek için 30 Karanlıkta min. Kolorimetrik western blot sonuçlarını analiz.

Sonuçlar

Spesifik antikorlar ile reaktivite ile eksprese edilen rekombinant proteinleri Doğrulama ifade edilen proteinlerin düzgün katlanmasını teyit önemli bir ilk adımdır. Rekombinant sıtma proteinler bir adım ve in vitro insan hücre özgür ifade sistemlerinde iki adımı kullanarak ifade edildi. Rekombinant proteinler, saflaştırılmış Ni-kelat yapıcı afinite yöntemdir. Daha sonra, SDS-PAGE, ayrılmış yeniden birleştirici proteinlerin western blotting bütün Merozoit rhoptries karşı antisera kullanıl?...

Tartışmalar

vitro insan hücre barındırmayan sentezleme sistemi ve arıtma iki adımı kullanarak proteinin başarılı bir şekilde ifadesi için önemli adımlardır: 1) başarılı bir yükseltme ve pT7CFE-CHIS plazmid vektörü içine genlerin klonlanması; 2) 30 ^o C RNA transkripsiyonu; RNaz inhibitör varlığında, 30 ° C'de protein 3) yapıldı; 4) poliklonal ve monoklonal antikorlar kullanılarak reçine Ni ve 5 ile kaplı haplar), batı lekesi üzerinde analiz sonuçları kullanılarak afinite bazlı saf...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-step in vitro human cell free expression system	Thermo Fisher	88856	Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system	Thermo fischer	88860	Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system	Invitrogen	K850-01	Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin	Invitrogen	R801-01	Store at 4oC.
A+ Human Blood	Interstate Blood Bank		Store at 4 °C.