性T细胞Transinfection从树突状细胞捕捉细菌

摘要

这里的协议，提出通过该期间抗原呈递发生经由transinfection从预感染树突状细胞（DC）的CD4 ^{+ T细胞}以测量细菌捕获。我们说明如何执行必要的步骤:原代细胞中，DC，DC / T细胞共轭形成感染和细菌的T细胞转染的测量隔离。

摘要

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4⁺ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4⁺ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

引言

当病原体感染其宿主，通常的先天和适应性免疫反应所必需的细菌清除的活化。先天性免疫是防御的第一道防线，防止大多数感染。先天免疫区分以精确的方式元件被间微生物大类保守的（病原体相关分子模式^）1。先天免疫的机制包括物理障碍如皮肤，化学品的障碍（抗菌肽，溶菌酶）和先天的白细胞，包括吞噬细胞（巨噬细胞，中性粒细胞和树突状细胞），肥大细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，和天然杀伤细胞^2。这些细胞识别和消灭病原体，无论是通过接触或通过细胞吞噬功能，其中包括病原体吞噬和杀害攻击他们。该系统不允许终身防守，而相比之下，适应性免疫，从而赋予针对p免疫记忆athogens。适应性免疫系统是防御的第二行，并且能够识别和反应以多种微生物和非微生物物质³的特定抗原。适应性免疫系统的主要组成部分是淋巴细胞，它包括B和T细胞。 B细胞参与了体液应答，分泌抗病原体或外源蛋白质。然而，T细胞代表了细胞介导的免疫力，调节细胞因子分泌或杀死病原体感染的细胞⁴的免疫应答。

抗原呈递细胞（APC），包括树突状细胞或巨噬细胞，先天免疫系统的组分，可以识别吞噬病原体和过程细菌成分成抗原，其由主要组织相容性复合物^（MHC）5-7呈现在细胞表面上。后的APC已吞噬的病原体，它们通常迁移到引流淋巴结，在那里它们以T相互作用细胞。 T淋巴细胞可以通过它们的T细胞受体识别特异性的肽-MHC复合物。免疫突触（IS）发生在负载抗原的APC和淋巴细胞之间的界面中的抗原呈递^8,9。有些细菌可以生存的吞噬功能，并在装甲运兵车系统传播。这种观点认为，受感染的APC作为细菌的水库或"特洛伊木马"，以促进细菌的蔓延^10。装甲运兵车和采取的是在形成过程中发生淋巴细胞之间的亲密接触也可作为一个平台，交换膜，遗传物质和外来体的一部分，可以被劫持用于某些病毒感染的T细胞;这个过程被称为transinfection ^11-13

一些病原性细菌（ 李斯特菌， 沙门氏菌和志贺氏菌 ）能够侵入T淋巴细胞在体内和修改其行为^14-16。我们有最近描述了T淋巴细胞也能抗原呈递¹⁶的过程中捕获的细菌通过从以前感染树突细胞（DC）transinfection。 T细胞细菌捕获由transinfection极其比直接感染更有效（1,000-4,000x）。 T细胞捕获病原体和非病原菌显示比transinfection是由T细胞驱动的过程。引人注目的是，transinfected T（TIT）细胞迅速杀死细菌捕获和这样做的效率比专业的吞噬细胞^16。这些结果，这打破免疫学的教条，表明适应性免疫的细胞可以执行是假想排他性的先天免疫的功能。此外，我们发现，乳头细胞分泌大量的促炎细胞因子和体内的细菌感染保护。

这里，我们提出用于研究细菌transinfection过程中的不同协议小鼠模型。该模型是基于使用^CD4 + T细胞的转基因小鼠OTII，其中承担特异性的TCR的OVA（OVAp）的肽323-339中的^I-17抗体的相互作用是特异性地与细菌感染的骨的上下文marrow-衍生的DC（DC培养上清^）18,19装有OVAp，形成稳定的免疫突触。

T细胞transinfection可以可视化，并使用荧光显微镜进行跟踪。此外，流式细胞仪可用于通过取由细菌表达绿色荧光蛋白^{（GFP）16,20}发出的荧光的优点检测感染的细胞。此外，T细胞transinfection可以通过更灵敏的方法，庆大霉素存活测定法，允许大量事件的测量来定量。庆大霉素是一种不能渗透的真核细胞的抗生素。因此，使用这种抗生素可以胞内细菌的分化幸存抗生素除了FROM外那些被打死^21。

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研究方案

注:实验过程批准了委员会的马德里自治大学的研究伦理和动物福利与健康的马德里自治大学负责人的监督下，按照西班牙和欧洲的准则进行的。小鼠饲养在无特定病原（SPF）的住房，他们用二氧化碳培训并合格的人员（CO _2）吸入法实施安乐死。

1.鼠标骨髓来源的DC分化和感染

注意: 图1总结了该第一步骤。所有过程应进行在从该点上的引擎盖，仅使用无菌培养基，仪器，枪头和培养皿。

1. 小鼠骨髓来源的DC分化
   1. 解剖胫骨和股骨从一个C57 / BL6小鼠²²和转移到的塑料培养皿用10ml RPMI培养基。
   2. 互砍骨骺关闭，用无菌剪刀和揭露骨髓，其中有一个特色鲜明的红色。
   3. 注入的骨的内部与上使用无菌的Petri无菌注射器10 ml的磷酸盐缓冲盐水的（PBS）中含有0.5％牛血清白蛋白（BSA）和5mM乙二胺四乙酸（EDTA）（PBS / BSA / EDTA缓冲液）菜。
   4. 收集细胞悬浮液，并离心在一个管中于600×g离心在冷冻离心机（4℃）。
   5. 将细胞重悬于1毫升铵-氯化物钾（ACK）裂解缓冲液（0.15M的_氯化铵 ，10毫KHCO ₃和0.1mM EDTA）中，为了消除红血细胞温育30秒，室温。
   6. 加入10 mL的RPMI 1640培养基中含10％胎牛血清（FBS），并过滤通过细胞过滤网（70微米）离心以相同的速度（600×g离心），因为团块通过滤波消除之前去除骨碎片和细胞团块。
   7. 细胞计数的d调整至5×10 ^5个细胞/毫升的RPMI 10％FBS（含50μM的β-巯基乙醇，1mM丙酮酸钠），并添加20纳克/毫升的重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（RM-GM-CSF）作为终浓度。
   8. 添加该悬浮液到无菌的，微生物学品质15厘米培养皿，并培养_在 CO 2培养箱中_{（37℃，5％}的CO 2）。
   9. 每三天，降速两个非贴壁细胞和分离的细胞用5mM EDTA的PBS重悬在细胞密度为^5×10 5个细胞/ ml，用含有20纳克/毫升RM-GM-CSF的新鲜培养基中。
2. 的DC和抗原负载成熟
   1. 在9天，重悬细胞在培养基含有20纳克/毫升RM-GM-CSF的^5×10 5细胞/密度毫升。然后加入20纳克/毫升脂多糖（LPS），以允许高的MHC-II表达的细胞上，并培育在非组织培养处理过的无菌的15厘米的培养皿24小时。
   2. 一前一后对LPS刺激的一天，染色一些DC细胞的抗鼠的CD11c，MHCII和Gr-1通过流式细胞仪检查的DC分化。流式细胞DC的分析的一个例子示于图3A和3B。
      1. 孵育树突（5×10 ^5个细胞/样品）用抗小鼠CD16 / CD32的单克隆抗体的终浓度在50μlPBS / BSA / EDTA每个样品缓冲液2.5微克/毫升。之后，加入50微升的抗体的抗MHCII（IA / IE）的CD11c和Gr-1在1偶联有不同荧光:100,1:200和1:500分别在PBS / BSA / EDTA缓冲液。
      2. 最后，洗净树突用PBS / BSA / EDTA缓冲液中，并根据制造商的协议通过流式细胞术分析。
         注意:如果所述细胞是分化良好，细胞准备用于抗原负载。
   3. 洗涤的DCs用RPMI 10％FBS（无抗生素）中，用10微克/毫升OTII OVAp（OVA 323-339孵育它们; ISQAVHAAHAEINEAGR）上，在37ºC在1ml每^5×10 6个树突状最小1小时RMPI 10％FBS培养基的塑料管。作为阴性对照，留下的DC而不OVAp孵化。
3. DC的感染
   1. _在 CO 2培养箱中感染的DC在感染复数为10的细菌（每直流10细菌）1小时（MOI）（37℃，5％CO _2）。
   2. 洗涤直流细胞3×PBS中和1x在RMPI 10％FBS和离心机在450×g离心以洗掉大部分胞外细菌。最后，重悬细胞RMPI 10％FBS的培养基（无抗生素），在^20×10 6个细胞/ ml。

从OTII转基因小鼠2.隔离^CD4 + T淋巴细胞

注意: 图1总结了该第二步骤。淋巴结应当被用来代替脾脏分离^CD4 + T细胞，因为外周血CD4 ^{+淋巴细胞}在淋巴结秒（〜50％）比在脾（〜25％），因此纯化会更有效放大。

1. 让单细胞悬液淋巴结
   1. 删除腹股沟，腋窝，上臂，颈和肠系膜淋巴结²³ OTII转基因小鼠，并转移到一个塑料菜10 RPMI 10％FBS培养基中。
   2. 在使用两个磨砂显微镜载玻片无菌罩研磨淋巴结。放置在一个显微镜载玻片的磨砂侧淋巴结，擦第二张幻灯片，直到机关已接地的磨砂面。
   3. 洗单细胞悬浮液在PBS / BSA / EDTA缓冲液。
   4. 过滤该细胞虽然细胞过滤网（70微米）以除去结缔组织和洗涤用PBS / BSA / EDTA缓冲液。
   5. 将细胞重悬于1毫升ACK裂解缓冲液和为了消除红血细胞下室温温育1分钟。
2. ^CD4 + T细胞的分离
   1. 如步骤2.1.3和计数再次清洗细胞重悬在它们在PBS / BSA / EDTA缓冲液^100×10 6个细胞/ ml。 30分钟250在冰上购买负选择^CD4 + T细胞的:添加生物素化的抗CD8，IgM抗体，B220，CD19，MHC II类（Ⅰ抗体），细胞CD11b，CD11c的和DX5 1。
   2. 在PBS / BSA / EDTA缓冲液中洗涤细胞，并培育的细胞^（100×10 6个细胞/ ml）与链亲和素微珠在推荐在生产商的方案，在冰上15分钟的浓度。
   3. 在PBS / BSA / EDTA缓冲液中洗涤细胞，并筛选它们虽然之前^的 CD4 + T细胞的分离细胞过滤网（30微米）。
   4. 通过使用磁性细胞分离机根据生产商的方案负向选择隔离的CD4 ^{+ T细胞。}
   5. 计数细胞，并调整到4×10 ^6个细胞/毫升的RPMI 10％FBS的培养基（无抗生素）。
   6. 修复并保持在冰上分离的CD4 ^{+ T细胞 （3×10} 5个细胞），以检查纯度，流动流式细胞仪所描述的^24。的^CD4 + T细胞的纯化的实例示于图3C。

3. T细胞Transinfection测量庆大霉素保护测定

注意: 图2总结了协议的这个第三步骤。

1. T细胞Transinfection
   1. 孵育分离的^CD4 + T细胞与受感染DC的细胞（1:1）（所述的DC感染1小时并洗涤以消除游离的细菌）处理30分钟，以允许_在 CO 2培养箱中（37℃，免疫突触的形成，5％ _的 CO 2）。
   2. 添加0.5分离^CD4 + T细胞^（2×10 6个细胞）和0.1感染的^DC（2×10 6个细胞）上的24孔培养板的毫升毫升。作为阴性对照，直接^CD4 + T细胞的0.5 ml的感染在10细菌感染复数为30分钟。
   3. 包括使用从T细胞分离感染的DC额外的控制聚碳酸酯的transwell屏障（有3微米孔径的），阻碍的DC-T物理接触。加入0.1毫升的transwell内的DC和0.5ml ^CD4 + T细胞的入井（24孔板）的下室中。
   4. 最后，完成与RMPI中，直到为0.6毫升每口井，使等量的所有样本。
   5. 免疫突触形成30分钟后，添加庆大霉素100微克/毫升与_在 CO 2培养箱中收集细胞前孵育1小时（37℃，5％CO _2）。
2. 重隔离^的 CD4 + T细胞的
   1. 收集非粘附细胞，重悬它们在PBS / BSA / EDTA缓冲液。大多数的DC仍然附着于塑料培养板。轻轻涡管，以确保细胞分解。保持500微升细胞上清液作为对照，表明庆大霉素一直运作良好。
   2. 从包含DC和T细胞一起在步骤2.2样品再分离^CD4 + T细胞虽然大多数的DC的应安装在该板上。置于冰上对照样品。仅考虑小于2％的污染实验。的transinfection后^CD4 + T细胞纯化的一例示于图3D。
3. 裂解性T细胞和种子它们对细菌培养基琼脂板。
   1. 用PBS洗两次^CD4 + T细胞。
   2. 计数细胞，并重悬它们以^2×10 6个细胞/ PBS中毫升。
   3. 加入500微升0.1％的Triton X-100的在500μl的T细胞以裂解它们以^1×10 6个细胞/ ml，释放细胞内细菌出T细胞。
   4. 使裂解的细胞的3串行十倍稀释和种子将50μl每种稀释液对细菌培养基琼脂平板上。分割板分成4部分和种子裂解的细胞的不同稀释度的每一个部分。代表性的结果示于图4。
      1. 作为对照，还对板在琼脂上的缀合物的储存细胞上清液，以确保庆大霉素运作良好。另外板块感染的DC作为额外的控制。万一低的DC有污染发生（<2％），减去对应于低直流污染菌落形成单位（CFU的）。

4.定量流式细胞术检测T细胞Transinfection

注意: 图2总结了这一步骤。

1. T细胞Transinfection
   1. 感染的BMDCs如在步骤1.3，但使用表达GFP的细菌在这种情况下。
   2. 染色^CD4 + T细胞（分离自淋巴结在步骤2.2）用细胞追踪氯甲基氨基香豆素（CMAC）30分钟，在37ºC根据制造商的协议。
   3. 用RMPI 10％FBS（无抗生素）洗两次标记的CD4 ^{+ T细胞。}
   4. 孵育感染的DC（后1小时培养的细菌）与标记的CD4 ⁺T细胞30分钟，以允许免疫突触的形成，在37ºC包括所有说明步骤3.1.1控制。
2. 感染的CD4 ^{+ T}细胞染色
   1. 直流-T的免疫突触的形成在30分钟后，收集细胞和在PBS / BSA / EDTA清洗。
   2. 之后洗涤两次用PBS / BSA / EDTA缓冲液，分离凝集细胞轻轻涡旋管中。
   3. 固定的样品在0.2ml / PBS含3％PFA中15分钟，在室温的管中。然后把它们洗干净的PBS。
   4. 孵育抗小鼠CD16 / CD32单克隆抗体（2.5微克/毫升）的PBS / BSA / EDTA为50μl/样品15分钟在冰上阻断树突状细胞的Fc受体。
   5. 在50μl/ PBS / BSA / EDTA的样品添加兔抗细菌抗体（10μg/ ml的作为最终浓度）处理30分钟在冰上染色细胞外细菌。
   6. 用PBS / BSA / EDTA洗涤细胞并孵育抗小鼠的CD11c抗体偶联有藻红蛋白（PE）和一个本身抗兔condary抗体偶联有其它荧光像的Alexa-647氟在1:PBS / BSA / EDTA对在冰上30分钟，200在100μl/样品。
   7. 洗涤细胞并通过流式细胞仪分析样品。不要忘记包括使用非荧光的细菌作为阴性对照和样品标记有在实验中使用，以补偿样品和调整仪设置²⁵的流中的每个荧光染料的只是一个transinfected T细胞的样品。代表性的分析结果列于图5。
      注意:如果细菌不表达GFP，以区分细胞内外的细菌，标记胞菌，修复和透化的样品用Triton X-100，在0.5％在PBS中5分钟。随后染色细菌总数（内+外）用不同的荧光染料。

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结果

本文我们描述了如何从感染的骨髓衍生-DC和如何通过两种不同的方法来测量细菌transinfection执行小鼠T细胞细菌transinfection:流式细胞仪和庆大霉素存活测定法图1总结的步骤，以获得细胞。通过骨髓细胞与GM-CSF连续9天的孵化产生的DC。随后，区议会熟化与LPS以增加它的膜MHCII与OVA（OVAp）的特定的肽加载​​它们以后。作为对照，有些区议会没装OVAp。二者的DC（OVAp...

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讨论

T细胞或T淋巴细胞是一种类型的白细胞中发挥在细胞介导的免疫中发挥中心作用，并属于适应性免疫反应^26。 T细胞是难治被感染在体外 ，但一些报道表明，它们可以感染体内 ^14,15。 APC和T细胞的过程中免疫突触的紧密接触作为交换生物^材料 13，包括某些病毒如HIV ¹¹的平台。据最近表明，违背了教条，T细胞，适应性免疫细胞的范例，也能够有效地捕获...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Fisher Scientific	SH3025501
r-GMCSF	Peprotech	315-03
LPS	SIGMA	L2630-10mg
Na Pyruvate	Thermo Scientific	SH3023901
2-ME	Gibco	31350-010
OVAp OTII (323–339)	GenScript
Cell Strainer 70uM	BD	352350
30 uM Syringe Filcons Sterile	BD	340598
AutoMacs Classic	Miltenyi Biotec	130-088-887
Gentamicin	Normon	624601.6
Transwell	Costar	3415
LB	Pronadisa	1231
Agar	Pronadisa	1800
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton X-100
CD8 biot	BD Biosciences	553029
IgM Biot	ImmunoStep	Clone RMM-1
B220 Biot	BD Biosciences	553086
CD19 biot	BD Biosciences	553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)	BD Biosciences	553622
CD11b biot	Immunostep	11BB-01mg
CD11c biot	Immunostep	11CB3-01mg
DX5 biot	BD Biosciences	553856
Gr-1 biot	BD Biosciences	553125
CD16/CD32	ImmunoStep	M16PU-05MG
anti Salmonella	ABD Serotec	8209-4006
CD11cPE	BD Biosciences	553802
CD4-APC	Tonbo Biosciences	20-0041-U100
Gr-1 APC	BD Biosciences	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD Biosciences	553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed	Invitrogen	A-21245
CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin)	Life technologies	C2110
BSA	SIGMA	A7030-100G
Streptavidin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-101
BD FACSCanto II	BD Biosciences