Cellules T Capturez bactéries par Transinfection de cellules dendritiques

Résumé

Voici un protocole est présenté pour mesurer la capture bactérienne par les cellules ^T CD4 + qui se produit lors de la présentation de l'antigène par les cellules dendritiques transinfection de pré-infectées (DC). Nous montrons comment effectuer les mesures nécessaires: l'isolement de cellules primaires, infection de DC, DC / T la formation de conjugués de la cellule, et la mesure des bactérienne transfection de cellules T.

Résumé

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4⁺ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4⁺ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Introduction

Quand un agent pathogène infecte son hôte, il ya généralement une activation des réponses immunitaires innées et adaptatives, nécessaires à la clairance bactérienne. L'immunité innée est la première ligne de défense qui empêche la plupart des infections. L'immunité innée distinguer dans un des éléments précis de façon qui sont conservés parmi les grands groupes de micro-organismes (motifs moléculaires associés à des pathogènes, PAMP) ^1. Les mécanismes de l'immunité innée sont les barrières physiques telles que la peau, les barrières chimiques (des peptides antimicrobiens, lysozyme) et les leucocytes innées, qui incluent les phagocytes (macrophages, les neutrophiles et les cellules dendritiques), les mastocytes, les éosinophiles, les basophiles et les cellules tueuses naturelles ^2. Ces cellules identifier et éliminer les agents pathogènes, soit en les attaquant par contact ou par phagocytose, qui comprend pathogène engloutissant et le meurtre. Ce système ne permet pas de défense à vie, contrairement à l'immunité adaptative, qui confèrent une mémoire immunologique contre pathogens. Le système immunitaire adaptatif est la deuxième ligne de défense et est capable de reconnaître et de réagir à des antigènes spécifiques de multiples microbienne et des substances non-microbiennes ^3. Les principaux composants du système immunitaire adaptatif sont les lymphocytes, qui incluent les cellules B et T. Les cellules B sont impliqués dans la réponse humorale, sécrétant des anticorps contre des agents pathogènes ou de protéines exogènes. Cependant, les cellules T représentent l'immunité à médiation cellulaire, la modulation de la réponse immunitaire ou la sécrétion des cytokines tuer les cellules infectées par des agents pathogènes ^4.

Les cellules présentant l'antigène (CPA), notamment les cellules dendritiques ou les macrophages, les constituants du système immunitaire inné, capables de reconnaître les agents pathogènes de phagocytent et des composants bactériens de processus en antigènes, qui sont présentés à la surface des cellules par le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) ^7.5. Après APC ont phagocyté pathogènes, ils migrent habituellement dans les ganglions lymphatiques, la vidange où ils interagissent avec Tcellules. Les lymphocytes T peuvent reconnaître des complexes peptide-CMH spécifiques par leurs récepteurs de lymphocytes T. La synapse immunologique (SI) a lieu dans l'interface entre un antigène APC-chargé et une présentation de l'antigène des lymphocytes pendant ^8,9. Certaines bactéries peuvent survivre phagocytose et de diffuser systématiquement au sein des APC. Dans cette perspective, les APC infectés servent de réservoirs bactériens ou «chevaux de Troie» qui facilitent la propagation bactérienne ^10. Le contact intime entre les APC et les lymphocytes qui ont lieu au cours de la formation IS fonctionnent également comme une plate-forme pour l'échange d'une partie des membranes, le matériel génétique et les exosomes et peut être détourné pour certains virus pour infecter les cellules T; ce processus est appelé transinfection ^11-13.

Certaines bactéries pathogènes (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica et Shigella flexneri) peuvent envahir les lymphocytes T in vivo et modifier leur comportement ^14-16. Nous avonsrécemment décrits que les lymphocytes T sont également capables de capturer les bactéries par transinfection de cellules dendritiques préalablement infectées (PED) au cours de la présentation de l'antigène ^16. T capter cellule bactérienne par transinfection extrêmement plus efficace (1,000-4,000x) que les infections directes. T pathogène des cellules de capture et des bactéries non pathogènes, indiquant que transinfection est un processus piloté par les cellules T. Il est frappant, transinfected T (TIT) cellules tuées rapidement les bactéries capturées et ont fait plus efficacement que les phagocytes professionnels ^16. Ces résultats, qui cassent un dogme de l'immunologie, montrent que les cellules de l'immunité adaptative peuvent exécuter des fonctions qui étaient prétendument exclusif de l'immunité innée. En outre, nous avons montré que les cellules de Tit sécrètent de grandes quantités de cytokines pro-inflammatoires et protéger contre les infections bactériennes in vivo.

Ici, nous présentons les différents protocoles utilisés pour étudier le processus de transinfection bactérienne dansun modèle de souris. Ce modèle est basé sur l'utilisation de cellules ^T CD4 + à partir de souris transgéniques OTII, qui portent un TCR spécifique de peptide OVA 323-339 de (OVAp) dans le cadre de I-Ab ¹⁷ qui interagissent spécifiquement avec os bactérienne infectée marrow- PED dérivés (BMDCs) ^18,19 chargés de OVAp, formant des synapses immunitaires stables.

T transinfection cellulaire peut être visualisée et suivie par microscopie de fluorescence. En outre, la cytométrie en flux peut être utilisé pour détecter les cellules infectées en tirant parti de la fluorescence émise par des bactéries exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) ^16,20. En outre, T transinfection cellulaire peut être quantifiée par une approche plus sensible, le test de survie gentamicine qui permet la mesure d'un grand nombre d'événements. La gentamicine est un antibiotique qui ne peuvent pas pénétrer dans les cellules eucaryotes. Par conséquent, en utilisant cet antibiotique permet la différenciation des bactéries intracellulaires qui a survécu à l'ajout fr antibiotiqueceux extracellulaires om qui ont été tués ^21.

Protocole

Remarque: Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d'éthique de la recherche de l'Universidad Autónoma de Madrid et menés sous la supervision de l'Universidad Autónoma de Madrid chef de la protection des animaux et de la santé, conformément aux directives européennes et espagnoles. Les souris ont été élevés en exempts d'agents pathogènes (SPF) logements spécifiques et ils ont été euthanasiés par du personnel formé et qualifié à l'aide de dioxyde de carbone _(CO 2) méthode de l'inhalation.

1. souris dérivées de moelle osseuse PED Différenciation et Infection

Remarque: La figure 1 résume cette première étape. Toutes les procédures doivent être effectuées dans la hotte partir de ce point, en utilisant uniquement des médias, des instruments, des embouts de pipette stériles et des boîtes de culture.

1. Souris dérivées de moelle osseuse PED Différenciation
   1. Disséquer les tibias et les fémurs d'un C57 / BL6 souris ^{22 et} transférer dans un plat en plastique avec 10 ml de milieu RPMI.
   2. Couper chaque épiphyse off, avec des ciseaux stériles et d'exposer la moelle osseuse, qui a une couleur rouge vif caractéristique.
   3. Infuser à l'intérieur de l'os avec 10 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (tampon / BSA / EDTA PBS) en utilisant une seringue stérile sur une Petri stérile plat.
   4. Recueillir la suspension de cellules et centrifugation dans un tube à 600 x g dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C).
   5. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de chlorure d'ammonium-potassium-réception (ACK) du tampon de lyse (0,15 M _de NH 4 Cl, 10 mM de _KHCO3 et EDTA 0,1 mM) et on incube pendant 30 secondes à la température ambiante afin d'éliminer les globules rouges.
   6. Ajouter 10 ml de milieu RPMI 1640 avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et filtrer à travers un tamis cellulaire (70 um) pour éliminer les fragments d'os et des amas de cellules avant la centrifugation à la même vitesse (600 x g), parce que des amas ont été éliminés par filtration.
   7. Compter les cellules d'und ajuster à 5 x 10 ⁵ cellules / ml avec du milieu RPMI 10% SVF (contenant 50 uM B-mercaptoéthanol, du pyruvate de sodium 1 mM) et ajouter 20 ng / ml murin de colonies facteur recombinant granulocyte-macrophage stimulante (rm-GM-CSF) en tant que concentration finale.
   8. Ajouter cette suspension à un stérile, la qualité microbiologique, 15 cm boîte de Petri, et de la culture dans un _incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% de CO _2).
   9. Tous les trois jours, ralentissent les deux cellules non adhérentes et les cellules individuelles avec EDTA 5 mM dans du PBS et remettre en suspension à 5 x 10 ⁵ cellules / ml de la densité cellulaire, du milieu frais contenant 20 ng / ml rm-GM-CSF.
2. Maturation des CD et Antigen Chargement
   1. Au jour 9, remettre les cellules à 5 x 10 ⁵ cellules / ml de la densité dans un milieu contenant 20 ng / ml rm-GM-CSF. Ensuite, ajouter 20 ng / ml de lipopolysaccharide (LPS) pour permettre l'expression du CMH-II élevée sur les cellules et incuber dans une culture traitée stérile plat 15 cm Petri non-tissulaire pendant 24 heures.
   2. Après unejour de LPS-stimulation, tacher certaines cellules DC avec des anticorps contre CD11c de la souris, MHCII et Gr-1 pour vérifier la différenciation des PED par cytométrie de flux. Un exemple d'analyse par cytométrie en flux des DC est représenté sur la Figure 3A et 3B.
      1. Incuber les DC (5 x 10 ⁵ cellules / échantillon) avec un anticorps monoclonal anti-souris-CD16 / CD32 à 2,5 ug / ml de concentration finale dans 50 ul de PBS / BSA / EDTA par échantillon. Ensuite, ajouter 50 ul d'anticorps contre MHCII (IA / IE), CD11c et Gr-1 conjugué avec différents fluorochromes à 1: 100, 1: 200 et 1: 500 en / BSA tampon PBS / EDTA respectivement.
      2. Enfin, laver avec DC / BSA tampon PBS / EDTA et analyser par cytométrie de flux selon le protocole du fabricant.
         Remarque: Si les cellules sont bien différenciées, les cellules sont prêtes pour l'antigène chargement.
   3. Wash DC avec du RPMI 10% de FBS (sans antibiotiques) et les incuber avec 10 ng / ml OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) sur un tube en plastique dans 1 ml de IPMB 10% FBS par 5 x 10 ⁶ PED pour un minimum de 1 heure à 37 ºC. Comme témoin négatif, laissez PED sans incubation avec OVAp.
3. Infection des PED
   1. Infect DC à une multiplicité d'infection (MOI) de 10 bactéries par des bactéries (10) à courant continu pendant 1 heure dans _un incubateur à CO2 (37 ° C, 5% CO _2).
   2. Laver les cellules DC 3x dans PBS et 1x en IPMB 10% de FBS et centrifuger à 450 xg afin de laver la plupart des bactéries extracellulaires. Enfin, remettre les cellules en milieu RPMI 10% SVF (sans antibiotiques) à 20 x 10 ⁶ cellules / ml.

2. Isolement des ^lymphocytes T CD4 + à partir de souris transgéniques OTII

Remarque: La figure 1 résume cette seconde étape. Les ganglions lymphatiques doivent être utilisés à la place de la rate pour isoler des cellules ^T CD4 +, car la proportion de lymphocytes ^T CD4 + dans les ganglions lymphatiquess (~ 50%) est plus grande que dans la rate (~ 25%) et donc la purification serait plus efficace.

1. Assurez suspension unicellulaire de ganglions lymphatiques
   1. Retirer le inguinale, axillaire, brachiale, col de l'utérus et les nœuds lymphatiques mésentériques de souris transgéniques ²³ OTII et transférer dans un récipient plat en plastique avec 10 ml de RPMI 10% FBS milieu.
   2. Ganglions lymphatiques Grind sous une hotte stérile en utilisant deux lames de microscope dépoli. Placez les ganglions lymphatiques sur un côté givré d'une lame de microscope, et frotter avec le côté givré de la deuxième diapositive jusqu'à organes ont été broyées.
   3. Laver suspension cellulaire unique dans un tampon PBS / BSA / EDTA.
   4. Filtrer les cellules si un tamis cellulaire (70 um) pour éliminer le tissu conjonctif et laver avec tampon PBS / BSA / EDTA.
   5. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de lyse ACK et incuber pendant 1 min à température ambiante afin d'éliminer les globules rouges.
2. Isolement de ^cellules T CD4 +
   1. Laver à nouveau comme à l'étape 2.1.3 et comptageremettre en suspension les cellules à 100 x 10 à ⁶ cellules / ml dans / BSA tampon PBS / EDTA. Ajouter anticorps biotinylés contre CD8, IgM, B220, CD19, CMH de classe II (I-Ab), CD11b, CD11c et DX5 au 1: 250 pendant 30 min sur de la glace pour la sélection tard négatif de ^cellules T CD4 +.
   2. Laver les cellules dans / BSA tampon PBS / EDTA et on incube les cellules (100 x 10 ⁶ cellules / ml) avec des microbilles de streptavidine à la concentration recommandée dans le protocole du fabricant pendant 15 minutes sur de la glace.
   3. Laver les cellules dans / BSA tampon PBS / EDTA et filtrer si un tamis cellulaire (30 um) avant l'isolement de cellules ^T CD4 +.
   4. Isoler les cellules ^T CD4 + par une sélection négative en utilisant un appareil de séparation magnétique de cellules selon le protocole du fabricant.
   5. Compter les cellules et ajuster 4 x 10 ⁶ cellules / ml avec du RPMI 10% FBS (sans antibiotiques).
   6. Fixer et de garder sur les cellules ^T CD4 + de glace isolé (3 x 10 ⁵ cellules) pour vérifier la pureté par le fluxcytomètre de la manière décrite ^24. Un exemple de cellules T ^CD4 + purification est représenté sur la figure 3C.

3. cellules T Transinfection mesure par dosage protection gentamicine

Remarque: La figure 2 résume cette troisième étape du protocole.

1. T Transinfection cellulaire
   1. Incuber les cellules ^T CD4 + isolées avec des cellules infectées DC (1: 1) (les pays en développement ont été infectées pendant 1 h et lavé pour éliminer les bactéries libres) pendant 30 minutes pour permettre la formation de la synapse dans un _incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% CO _2).
   2. Ajouter 0,5 ml de cellules ^T CD4 + isolées (2 x 10 ⁶ cellules) et 0,1 ml des CD infectées (2 x 10 ⁶ cellules) sur une plaque de culture à 24 puits. Comme contrôle négatif, infecter directement 0,5 ml de cellules ^T CD4 + à une MOI de 10 bactéries pendant 30 min.
   3. Inclure des contrôles supplémentaires qui séparent DC infectées à partir de cellules T à l'aideune barrière polycarbonate Transwell (avec 3 um de taille de pore), ce qui empêche DC-T contact physique. Ajouter 0,1 ml de DC à l'intérieur du transwell et 0,5 ml de ^cellules T CD4 + dans le compartiment inférieur du puits (plaque 24 puits).
   4. Enfin, complet avec support IPMB jusqu'à ce qu'il y est de 0,6 ml dans chaque puits pour faire des volumes égaux dans tous les échantillons.
   5. Après 30 min de la formation des synapses immunitaire, ajouter 100 pg / ml de gentamicine et incuber pendant 1 heure avant de recueillir les cellules dans _un incubateur à CO2 (37 ° C, 5% CO _2).
2. Re-isolement de ^cellules T CD4 +
   1. Recueillir les cellules non adhérentes et les remettre en suspension dans du tampon PBS / BSA / EDTA. La plupart des pays en développement restent attachés à la plaque de culture en plastique. Tubes Vortex doucement pour assurer la désagrégation de la cellule. Gardez 500 pi de surnageant cellulaire que le contrôle de montrer que la gentamicine a bien fonctionné.
   2. Ré-isoler les cellules ^T CD4 + à partir d'échantillons contenant les DC et les cellules T en même temps que dans l'étape 2.2, Bien que la plupart des pays en développement auraient fixé sur la plaque. Gardez les échantillons de contrôle sur la glace. Prenez en compte que les expériences de contamination inférieur à 2%. Un exemple de cellules T ^CD4 + après purification transinfection est représenté sur la figure 3D.
3. Lyse cellules T et les épépiner sur Bactéries Plaques Moyen-agar.
   1. Laver les cellules ^T CD4 + deux fois avec du PBS.
   2. Compter les cellules et remettre en suspension les 2 à ⁶ x 10 cellules / ml dans du PBS.
   3. Ajouter 500 ul de 0,1% de Triton X-100 dans 500 ul de cellules T pour les lyser à 1 x 10 ⁶ cellules / ml, en libérant les bactéries intracellulaires sur les cellules T.
   4. Faire des dilutions en série 3 décimales de cellules lysées et ensemencer 50 ul de chaque dilution sur des plaques de gélose bactéries moyennes. Diviser plaques en 4 portions et épépiner les différentes dilutions de cellules lysées dans chaque partie. Les résultats représentatifs sont présentés sur la figure 4.
      1. Comme témoin, la plaque aussi lestocké surnageant cellulaire des conjugués sur de la gélose, de sorte que la gentamicine a bien fonctionné. Aussi plaque DC infectées comme un contrôle supplémentaire. En cas de contamination se produit à faible PED (<2%), soustraire les unités formant colonie (UFC) correspondant à la contamination DC faible.

4. Quantification des cellules T Transinfection par cytométrie en flux

Remarque: La figure 2 résume cette étape.

1. T Mobile Transinfection
   1. Infecter BMDCs comme dans l'étape 1.3, mais utiliser GFP exprimant bactéries dans ce cas.
   2. Stain cellules CD4 ^{+ T (isolés} à partir de ganglions lymphatiques dans l'étape 2.2) avec un aminocoumarine tracker cellule de chlorométhyle (CCMC) pendant 30 min à 37 ºC selon le protocole du fabricant.
   3. Laver les cellules ^T CD4 + marqués deux fois avec IPMB 10% de FBS (sans antibiotiques).
   4. Incuber DC infectées (après 1 h d'incubation avec des bactéries) avec marqué ^CD4 +Les cellules T pour 30 min pour permettre la formation de synapse immunologique à 37 ºC, y compris tous les contrôles expliquant à l'étape 3.1.1.
2. Coloration des cellules infectées par ^T CD4 +
   1. Après 30 min de DC-T création de la synapse, recueillir des cellules et lavez-les dans du PBS / BSA / EDTA.
   2. Après deux lavages avec du tampon PBS / BSA / EDTA, les cellules agrégés distincts par vortex doucement les tubes.
   3. Fixer les échantillons dans 0,2 ml / tube de PBS contenant 3% de PFA pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, lavez-les dans du PBS.
   4. Incuber avec l'anticorps monoclonal anti-souris-CD16 / CD32 (2,5 pg / ml) dans 50 ul / échantillon de PBS / BSA / EDTA pendant 15 minutes sur de la glace pour bloquer les récepteurs Fc des cellules dendritiques.
   5. Ajouter un lapin anti-bactéries anticorps (10 pg / ml comme concentration finale) à 50 ul / échantillon de PBS / BSA / EDTA pendant 30 minutes sur de la glace pour colorer les bactéries extracellulaires.
   6. Laver les cellules avec du PBS / BSA / EDTA et on incube avec un anticorps contre CD11c de souris conjugué à de la phycoérythrine (PE) et un soicondaire anticorps contre lapin conjugué avec d'autres comme fluorochrome Alexa-Fluor 647 au 1: 200 dans 100 pi / échantillon de PBS / BSA / EDTA pendant 30 minutes sur la glace.
   7. Laver les cellules et analyser les échantillons par cytométrie en flux. Ne pas oublier d'inclure un échantillon de cellules T transinfected utilisant des bactéries non-fluorescentes comme contrôle négatif et les échantillons étiquetés avec un seul de chaque fluorochrome utilisé dans l'expérience pour compenser les échantillons et d'ajuster la cytométrie de flux paramètres ^25. Analyse représentative est représentée sur la Figure 5.
      Remarque: si les bactéries ne pas exprimer la GFP, de distinguer les bactéries extracellulaires et intracellulaires, extracellulaires étiquette bactéries, en fixer et perméabiliser les échantillons avec du Triton X-100 à 0,5% dans du PBS pendant 5 min. Ensuite tacher bactéries intracellulaires totaux (+ extracellulaire) avec un fluorochrome différent.

Résultats

Ici, nous avons décrit comment effectuer transinfection bactérienne des cellules T murin de la moelle osseuse infectée dérivée-PED et comment mesurer transinfection bactérienne via deux approches différentes: la cytométrie en flux et de la gentamicine survie dosage figure 1 résume la procédure pour obtenir les cellules.. DCs sont générés par incubation de cellules de moelle osseuse avec le GM-CSF pendant 9 jours. Ensuite, les PED sont maturée avec LPS pour ...

Discussion

Cellules T ou lymphocytes T sont un type de leucocytes qui jouent un rôle central dans l'immunité à médiation cellulaire et appartiennent à la ²⁶ réponse immunitaire adaptative. Les cellules T sont réfractaires à être infectés in vitro mais certains rapports indiquent qu'ils peuvent être infectés in vivo ^14,15. Les contacts intimes de cellules APC et T au cours de synapse immunologique servent de plates-formes d'échange de matériel biologique ^13,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Fisher Scientific	SH3025501
r-GMCSF	Peprotech	315-03
LPS	SIGMA	L2630-10mg
Na Pyruvate	Thermo Scientific	SH3023901
2-ME	Gibco	31350-010
OVAp OTII (323–339)	GenScript
Cell Strainer 70uM	BD	352350
30 uM Syringe Filcons Sterile	BD	340598
AutoMacs Classic	Miltenyi Biotec	130-088-887
Gentamicin	Normon	624601.6
Transwell	Costar	3415
LB	Pronadisa	1231
Agar	Pronadisa	1800
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton X-100
CD8 biot	BD Biosciences	553029
IgM Biot	ImmunoStep	Clone RMM-1
B220 Biot	BD Biosciences	553086
CD19 biot	BD Biosciences	553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)	BD Biosciences	553622
CD11b biot	Immunostep	11BB-01mg
CD11c biot	Immunostep	11CB3-01mg
DX5 biot	BD Biosciences	553856
Gr-1 biot	BD Biosciences	553125
CD16/CD32	ImmunoStep	M16PU-05MG
anti Salmonella	ABD Serotec	8209-4006
CD11cPE	BD Biosciences	553802
CD4-APC	Tonbo Biosciences	20-0041-U100
Gr-1 APC	BD Biosciences	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD Biosciences	553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed	Invitrogen	A-21245
CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin)	Life technologies	C2110
BSA	SIGMA	A7030-100G
Streptavidin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-101
BD FACSCanto II	BD Biosciences