T細胞は、樹状細胞からTransinfectionによって細菌をキャプチャ

要約

ここで、プロトコルは、事前に感染した樹状細胞（DC）からtransinfection介して抗原提示の間に発生するCD4 ⁺ T細胞による細菌の取り込みを測定するために提示されています。初代細胞、DC、DC / T細胞複合体の形成の感染、および細菌のT細胞トランスフェクションの測定の分離：私たちは、必要なステップを実行する方法を示しています。

要約

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4⁺ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4⁺ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

概要

病原体は、ホストに感染すると、細菌排除のために必要な自然免疫と適応免疫応答の活性化は、通常はあります。自然免疫は、ほとんどの感染を防ぐ防御の最前線です。自然免疫は、微生物の広範なグループの間で保存されている正確な方法要素（病原体関連分子パターン^、PAMPS）1に区別します。先天性免疫機構は、食細胞（マクロファージ、好中球、および樹状細胞）、マスト細胞、好酸球、好塩基球、およびナチュラルキラー細胞を含む皮膚、化学障壁（抗菌ペプチド、リゾチーム）と先天的白血球、などの物理的障壁を含みます^2。これらの細胞は、コンタクトを介して、または病原体巻き込むと殺害を含んで食作用を介してそれらを攻撃することによってのいずれか、特定して病原体を排除します。このシステムは、pに対する免疫記憶を与える適応免疫とは対照的に、生涯の防衛を許可していませんathogens。適応免疫系は、防衛の2行目で、認識し、複数の微生物および非微生物物質³の特定の抗原に反応することができます。適応免疫系の主要な構成要素は、BおよびT細胞を含むリンパ球です。 B細胞は、病原体または外来性タンパク質に対する抗体を分泌する、体液性応答に関与しています。しかし、T細胞は、サイトカイン分泌または殺す病原体に感染した細胞を^4との免疫応答を調節する、細胞性免疫を表します。

主要組織適合複合体^（MHC）5-7によって細胞表面に提示される抗原に貪食病原体及びプロセス細菌成分を認識することができ、樹状細胞またはマクロファージ、先天性免疫系の構成成分を含む、抗原提示細胞（APC）。 APCが病原体を貪食した後、彼らは通常、彼らはTと対話流入領域リンパ節への移行します細胞。 Tリンパ球は、そのT細胞レセプターによって特異的ペプチド-MHC複合体を認識することができます。免疫シナプス（IS）は、抗原提示^8,9の間に抗原負荷APCとリンパ球との界面に発生します。いくつかの細菌は、食作用を生き残るためには、APCの内部に体系的に普及させることができます。このビューでは、感染したAPCは、細菌の貯水池や細菌の拡散^{10を容易に} 「トロイの木馬」としての役割を果たす。 IS形成の過程で起こりAPCおよびリンパ球の間の密接な接触はまた、膜の一部の交換、遺伝物質およびエキソソームのためのプラットフォームとして機能し、T細胞を感染させるためにいくつかのウイルスのハイジャックすることができます。このプロセスはtransinfection ^11-13と呼ばれています。

いくつかの病原性細菌（ リステリア菌 、 サルモネラ菌や赤痢菌）は 、in vivoでのTリンパ球に侵入し、その挙動^14-16を変更することができます。我々は持っています最近、Tリンパ球は、抗原提示¹⁶の過程で以前に感染した樹状細胞（DC）からtransinfectionによって細菌を捕捉することができることを説明しました。 T細胞の直接感染より（1,000-4,000x）極めてより効果transinfectionによる細菌捕獲。 T細胞はtransinfectionはT細胞によって駆動されるプロセスよりも示す病原体及び非病原体細菌を捕捉します。驚くべきことに、細胞が急速に捕捉された細菌を殺し、プロの食細胞¹⁶よりもので、より効率的にやったT（東工大）transinfected。免疫学の定説を破るこれらの結果は、適応免疫の細胞は、先天性免疫のおそらく排他的であった機能を実行することができることを示しています。加えて、我々は、TIT細胞が前炎症性サイトカインを大量に分泌し、 インビボでの細菌感染から保護することが示されました。

ここでは、細菌transinfectionプロセスを研究するために使用される様々なプロトコルを提示マウスモデル。このモデルは、細菌に感染した骨と特異的に相互作用するI-AB ¹⁷の文脈においてOVA（OVAp）ペプチド323-339に特異的なTCRを負担OTIIトランスジェニックマウスからのCD4 ⁺ T細胞の使用に基づきますmarrow-安定した免疫シナプスを形成OVApでロード由来DC（BMDCを^{）18,19、。}

T細胞transinfectionを可視化し、蛍光顕微鏡を使用して追跡することができます。さらに、フローサイトメトリー、緑色蛍光タンパク質^{（GFP）16,20を}発現する細菌によって放出される蛍光を利用して、感染した細胞を検出するために使用することができます。さらに、T細胞transinfectionより敏感なアプローチ、多数のイベントの測定を可能にゲンタマイシン生存アッセイにより定量することができます。ゲンタマイシンは、真核細胞に浸透することができない抗生物質です。したがって、この抗生物質を使用して、抗生物質添加FRを生き残った細胞内細菌の分化を可能にします^21を殺されたオム外のもの。

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プロトコル

注意：実験手順は、大学自治・デ・マドリッドの研究倫理委員会によって承認され、スペイン語、欧州のガイドラインに従って動物福祉と健康の大学自治・デ・マドリードヘッドの監督の下で行われました。マウスは、特定病原体不在（SPF）は、ハウジングで飼育され、それらは、二酸化炭素（CO _2）吸入法を用いて、訓練を受けた有資格者により安楽死させました。

1.マウスの骨髄由来DC分化および感染

注： 図1は、この最初のステップをまとめたものです。すべての手順は、メディア、楽器、ピペットチップ及び培養皿だけ滅菌を使用して、この時点からフード内で行われるべきです。

1. マウス骨髄由来DCの分化
   1. 1 C57 / BL6 ^マウス 22から脛骨と大腿骨を解剖し、RPMI培地10mlでプラスチックの皿に移します。
   2. 滅菌はさみで、各骨端をカットし、特徴的な赤の鮮やかな色をしている骨髄を、公開しています。
   3. 滅菌ペトリに無菌注射器を用いて0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（PBS / BSA / EDTA緩衝液）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlで骨の内部に吹き込みます皿。
   4. 冷却遠心機（4℃）で600×gでチューブ中の細胞懸濁液と遠心分離機を収集します。
   5. 塩化アンモニウム-カリウム（ACK）溶解緩衝液（0.15 M NH _{4 Clを} 、10mMのKHCO ₃および0.1mM EDTA）を1mlで細胞を再懸濁し、赤血球を除去するために室温で30秒間インキュベートします。
   6. 塊は、濾過により除去されたので、同じ速度（600×gで）で遠心分離する前に、骨片および細胞塊を除去するために、セルストレーナー（70ミクロン）を介して、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI 1640培地10mlを加え、濾過します。
   7. 細胞をカウントし、AND RPMI 10％FBS（50μMのβ-メルカプトエタノールを含有し、1mMピルビン酸ナトリウム）、5×10 ⁵細胞/ mlに調整し、20 ngの/ mlの組換えマウス顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（RM-GM-CSF）を追加最終濃度として。
   8. CO ₂インキュベーター中で、滅菌、微生物学的品質、15 cmでペトリ皿、培養にこの懸濁液を加える（37℃、5％CO _2）。
   9. 3日ごとに、20 ng / mlでRM-GM-CSFを含有する新鮮な培地で、細胞密度を5×10 ⁵細胞/ mlで、非接着細胞およびPBS中の5mM EDTAで剥離した細胞を再懸濁両方をスピンダウン。
2. DCおよび抗原負荷の成熟
   1. 9日目に、20 ngの/ mlのRM-GM-CSFを含有する培地中濃度の5×10 ⁵細胞/ mlで細胞を再懸濁。その後、細胞に高MHC-IIの発現を可能にし、24時間非組織培養処理滅菌15センチメートルペトリ皿にインキュベートすることを20ng /リポポリサッカライド（LPS）のミリリットルを追加します。
   2. 1の後LPS刺激の日は、フローサイトメトリーによってDCの分化を確認するために、マウスのCD11c、MHCIIおよびGR-1に対する抗体で、いくつかのDC細胞を染色します。 DCのフローサイトメトリー分析の例を図3A及び 3Bに示されています。
      1. サンプルあたり50μlのPBS / BSA / EDTA緩衝液中の最終濃度2.5μgの/ mlの抗マウスCD16 / CD32モノクローナル抗体を用いたDC（5×10 ^5細胞 /サンプル）をインキュベートします。それぞれPBS / BSA / EDTA緩衝液で500：100：1：200および1その後、1で異なる蛍光色素とコンジュゲートMHCII（IA / IE）、のCD11cおよびGR-1に対する抗体の50μlを添加します。
      2. 最後に、PBS / BSA / EDTAバッファーでDCを洗浄し、製造業者のプロトコールに従って、フローサイトメトリーによって分析します。
         注：細胞が十分に分化している場合は、細胞が抗原負荷の準備ができています。
   3. ウォッシュ（抗生物質を含まない）RPMI、10％FBSを含む樹状細胞および10μg/ mlのOTII OVAp（OVA 323-339でそれらをインキュベート; ISQA37ºCで最小1時間、5×10 ⁶のDCあたりRMPI 10％FBS培地1ml中のプラスチックチューブにVHAAHAEINEAGR）。陰性対照として、OVApとインキュベートすることなく、DCを残します。
3. DCの感染
   1. CO ₂インキュベーター（37℃、5％CO _2）で1時間10細菌（DCあたり10細菌）の感染多重度（MOI）での樹状細胞に感染します。
   2. ウォッシュDC細胞は、細胞外細菌の大部分を洗浄するためにRMPI、10％FBSおよび450×gで遠心分離にPBSおよび1倍で3倍。最後に、20×10 ⁶細胞/ mlで（抗生物質を含まない）RMPI 10％FBS培地中で細胞を再懸濁し。

OTIIトランスジェニックマウスからのCD4 ^{+ T}リンパ球の2の単離

注： 図1は、この第二段階をまとめたものです。リンパ節は、リンパ節におけるCD4 ^{+リンパ球の}割合ので、CD4 ⁺ T細胞を単離する代わりに脾臓を使用すべきですS（〜50％）、脾臓（〜25％）よりも大きいので、精製はより有効であろう。

1. リンパ節の単一細胞懸濁液を作製
   1. OTIIトランスジェニックマウスから^23ノード鼠径部、腋窩、上腕、子宮頸部および腸間膜リンパを削除し、RPMI、10％FBS培地10mlでプラスチックの皿に移します。
   2. 2つや消し顕微鏡スライドを使用して無菌フード下のリンパ節を挽きます。 1顕微鏡スライドのつや消し側のリンパ節を置き、臓器がグラウンドされるまで、第2のスライドのつや消し側でこすります。
   3. PBS / BSA / EDTA緩衝液中の単一細胞懸濁液を洗​​ってください。
   4. セルストレーナー（70μm）は、結合組織を除去し、PBS / BSA / EDTA緩衝液で洗浄するためにかかわらず、細胞をフィルタリングします。
   5. ACK溶解緩衝液1ml中に細胞を再懸濁し、赤血球を除去するために室温で1分間インキュベートします。
2. CD4 ⁺ T細胞の単離
   1. ステップ2.1.3カウントのように再び洗浄し細胞を、PBS / BSA / EDTA緩衝液中の100×10 ⁶細胞/ mlで再懸濁します。 ^CD4 + T細胞の後の負の選択のために氷上で30分間、250：CD8、IgM抗体、B220、CD19、MHCクラスII（I-AB）、のCD11b、CD11cの1でDX5に対するビオチン化抗体を追加します。
   2. PBS / BSA / EDTA緩衝液中で細胞を洗浄し、氷上で15分間、製造業者のプロトコールで推奨濃度でストレプトアビジンマイクロビーズを用いた細胞（100×10 ⁶細胞/ ml）をインキュベートします。
   3. PBS / BSA / EDTA緩衝液中で細胞を洗浄し、CD4 ⁺ T細胞の単離の前に細胞ストレーナー（30ミクロン）かかわらず、それらをフィルタリングします。
   4. 製造業者のプロトコルに従って、磁気細胞分離機を用いて陰性選択によってCD4 ⁺ T細胞を単離します。
   5. 細胞をカウントし、（抗生物質を含まない）RPMI、10％FBS培地に4×10 ⁶細胞/ mlに調整します。
   6. 流れにより純度を確認して修正し、氷単離したCD4 ^{+ T細胞} （3×10 ^5細胞 ）を続けますサイトメーター^24を説明します。 CD4 ⁺ T細胞の精製の ​​一例は、図3Cに示されています。

ゲンタマイシン保護アッセイ3. T細胞Transinfection測定

注： 図2は、プロトコルのこの第三の工程をまとめたものです。

1. T細胞Transinfection
   1. CO ₂インキュベーター（37℃、5％における免疫シナプス形成を可能にするために30分間（DCを1時間感染させ、自由な細菌を除去するために洗浄した）感染したDC細胞（1）を有する単離されたCD4 ⁺ T細胞をインキュベートCO _2）。
   2. 追加単離されたCD4 ⁺ T細胞（2×10 ⁶細胞）を、24ウェル培養プレートに感染したDC（2×10 ^6細胞 ）を0.1mlの0.5 mlです。陰性対照として、30分間、10細菌のMOIで直接0.5 mlのCD4 ⁺ T細胞に感染します。
   3. 使用したT細胞から感染したDCを分離する追加のコントロールを含めますDC-Tの物理的接触を妨げる（孔径3ミクロンを有する）ポリカーボネートトランスウェル障壁。ウェル（24ウェルプレート）の下の区画に0.1トランスウェル内部のDC mlの^CD4 + T細胞の0.5ミリリットルを追加します。
   4. 最後に、RMPI培地で完全に全てのサンプルにおいて同等のボリュームを作成する各ウェルの0.6ミリリットルがあるまで。
   5. 免疫シナプス形成の30分後、ゲンタマイシン100μg/ mlを添加し、CO ₂インキュベーター中で細胞を収集する前に1時間インキュベート（37℃、5％CO _2）。
2. 再分離^CD4 + T細胞の
   1. 非接着細胞を収集し、PBS / BSA / EDTA緩衝液で再懸濁します。 DCの大部分は、プラスチック培養皿に付着したままです。ボルテックスチューブを静かに細胞分解を確実にします。ゲンタマイシンがうまく働いていることを示すためのコントロールとして細胞上清500μlのを保管してください。
   2. ステップ2.2と一緒にDCおよびT細胞を含む試料からCD4 ⁺ T細胞を再単離します、が、DCのほとんどがプレートに付着している必要があります。氷の上にコントロールサンプルを保管してください。アカウントに2％未満の汚染との唯一の実験を行ってください。 transinfection後のCD4 ⁺ T細胞の精製の ​​一例が図3Dに示されています。
3. 溶解性T細胞および細菌中寒天プレート上でそれらをシード。
   1. PBSで2回洗浄CD4 ⁺ T細胞。
   2. 細胞をカウントし、PBS中で2×10 ⁶細胞/ mlで再懸濁。
   3. T細胞からの細胞内細菌を放出する、1×10 ⁶細胞/ mlで、それらを溶解するT細胞を500μlの0.1％トリトンX-100の500μLを加えます。
   4. 溶解した細胞の3連続小数の希釈を行い、細菌培地寒天プレート上で各希釈液50μlをシード。 4の部分に板を分割し、各部分に溶解した細胞の異なる希釈をシード。代表的な結果を図4に示します 。
      1. 対照として、またプレートゲンタマイシンがうまく働いていることを確認するために、寒天のコンジュゲートの細胞上清を保管していました。また、追加の対照として、感染したDCをプレート。ケースでは、低DCの汚染は（<2％）、低直流汚染に対応するコロニー形成単位（CFUの）を引く起こります。

フローサイトメトリーによるT細胞Transinfection 4.定量

注： 図2は、この手順をまとめたものです。

1. T細胞Transinfection
   1. ステップ1.3のようにのBMDCに感染するが、この場合には、GFP発現する細菌を使用しています。
   2. 製造業者のプロトコルに従って、37℃で30分間、細胞トラッカークロロメチルアミノクマリン（CMAC）と（ステップ2.2でリンパ節から単離された）ステイン^CD4 + T細胞ºC。
   3. 二回（抗生物質を含まない）RMPI 10％のFBSで標識された^CD4 + T細胞を洗浄します。
   4. 感染した樹状細胞をインキュベートし、標識^CD4 +と（細菌と1時間のインキュベーション後）30分間のT細胞は、ステップ3.1.1で説明するすべてのコントロールを含む37ºCで免疫シナプスの形成を可能にします。
2. 感染CD4 ⁺ T細胞の染色
   1. DC-T免疫シナプス形成の30分後、細胞を回収し、PBS / BSA / EDTAでそれらを洗浄。
   2. PBS / BSA / EDTA緩衝液、静かにチューブをボルテックスすることにより独立した凝集細胞で2回洗浄した後。
   3. 室温で15分間、3％PFAを含むPBSを0.2ml /チューブでサンプルを修正しました。その後、PBSでそれらを洗ってください。
   4. 樹状細胞のFc受容体をブロックするために、氷上で15分間、PBS / BSA / EDTAを50μl/サンプル中の抗マウスCD16 / CD32モノクローナル抗体（2.5μgの/ ml）でインキュベートします。
   5. 細胞外細菌を染色し、氷上で30分間50μL/ PBS / BSA / EDTAのサンプル中の抗細菌抗体（最終濃度として10 / mlの）ウサギを追加します。
   6. PBS / BSAは/ EDTAで細胞を洗浄し、フィコエリトリン（PE）とコンジュゲートしたマウスのCD11cに対する抗体およびSEでインキュベート氷上で30分間、PBS / BSA / EDTAを100μl/サンプル中の200：1でアレクサフルーア647のような他の蛍光色素と結合したウサギに対するcondary抗体。
   7. 細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによってサンプルを分析。ただ一つのサンプルを補償し、設定²⁵フローサイトメトリーを調整するために実験で使用した各蛍光色素で標識の非蛍光細菌などネガティブコントロールとサンプルを使用してtransinfected T細胞のサンプルを含めることを忘れないでください。代表的な分析は、 図5に示されています。
      注：細菌は、GFPを発現しない細胞内および細胞外細菌を区別するために、細胞外細菌をラベル、修正し、5分間PBS中の0.5％トリトンX-100を含む試料を透過した場合。その後、異なる蛍光色素で総細菌（細胞内+外）を染色します。

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結果

ここで、我々は派生-DCを感染した骨髄からマウスT細胞細菌transinfectionを実行する方法を説明し、どのように2つの異なるアプローチを介した細菌transinfectionを測定する：フローサイトメトリーおよびゲンタマイシン生存アッセイ図1は、細胞を得るための手順をまとめたものです。 DCは、9日間のGM-CSFとの骨髄細胞をインキュベートすることによって生成され...

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ディスカッション

T細胞またはTリンパ球は細胞性免疫において中心的な役割を果たし、適応免疫応答²⁶に属している白血球の一種です。 T細胞は 、インビトロで感染されるのに不応性であるが、いくつかの報告は、それらがインビボ^14,15 に感染させることができることを示しています。免疫シナプス中のAPCとT細胞の緊密な連絡先は、HIV ¹¹のようないくつかの?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Fisher Scientific	SH3025501
r-GMCSF	Peprotech	315-03
LPS	SIGMA	L2630-10mg
Na Pyruvate	Thermo Scientific	SH3023901
2-ME	Gibco	31350-010
OVAp OTII (323–339)	GenScript
Cell Strainer 70uM	BD	352350
30 uM Syringe Filcons Sterile	BD	340598
AutoMacs Classic	Miltenyi Biotec	130-088-887
Gentamicin	Normon	624601.6
Transwell	Costar	3415
LB	Pronadisa	1231
Agar	Pronadisa	1800
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton X-100
CD8 biot	BD Biosciences	553029
IgM Biot	ImmunoStep	Clone RMM-1
B220 Biot	BD Biosciences	553086
CD19 biot	BD Biosciences	553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)	BD Biosciences	553622
CD11b biot	Immunostep	11BB-01mg
CD11c biot	Immunostep	11CB3-01mg
DX5 biot	BD Biosciences	553856
Gr-1 biot	BD Biosciences	553125
CD16/CD32	ImmunoStep	M16PU-05MG
anti Salmonella	ABD Serotec	8209-4006
CD11cPE	BD Biosciences	553802
CD4-APC	Tonbo Biosciences	20-0041-U100
Gr-1 APC	BD Biosciences	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD Biosciences	553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed	Invitrogen	A-21245
CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin)	Life technologies	C2110
BSA	SIGMA	A7030-100G
Streptavidin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-101
BD FACSCanto II	BD Biosciences