As células T Capturar Bactérias por Transinfection das dendríticas

Resumo

Aqui é apresentado um protocolo para medir a captura de bactérias por células ^T CD4 +, o qual ocorre durante a apresentação de antigénio através de células dendríticas transinfection pré-infectadas (DC). Mostramos como executar os passos necessários: isolamento de células primárias, infecção de formação conjugado celular DC, DC / T, e medição da transfecção de células T bacteriana.

Resumo

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4⁺ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4⁺ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Introdução

Quando um agente patogénico infecta o seu hospedeiro, geralmente há uma ativação da resposta imune inata e adaptativa, necessários para o apuramento bacteriana. A imunidade inata é a primeira linha de defesa que impede a maioria das infecções. A imunidade inata em distinguir a maneira como os elementos precisos que são conservadas entre grandes grupos de microrganismos (padrões moleculares associados a agentes patogénicos, PAMPS ^1). Os mecanismos da imunidade inata incluem barreiras físicas tais como a pele, as barreiras químicas (péptidos antimicrobianos, lisozima) e os leucócitos inatos, que incluem os fagócitos (macrófagos, neutrófilos, e células dendríticas), mastócitos, eosinófilos, basófilos e células assassinas naturais ^2. Estas células identificar e eliminar patógenos, quer por atacá-los através do contato ou via fagocitose, que inclui patógeno engolindo e matando. Este sistema não permite a defesa ao longo da vida, em contraste com a imunidade adaptativa, que conferem memória imunológica contra pathogens. O sistema imune adaptativo é a segunda linha de defesa e é capaz de reconhecer e de reagir a antigénios específicos de múltiplos microbiana e substâncias não-microbianos ^3. Os principais componentes do sistema imunitário adaptativo são linfócitos, que incluem células B e T. As células B estão envolvidos na resposta humoral, que segregam anticorpos contra os agentes patogénicos ou proteínas exógenos. No entanto, as células T representar a imunidade mediada por células, modulando a resposta imunitária com citocinas secreção ou matando as células infectadas com agentes patogénicos ^4.

Células apresentadoras de antígenos (APCs) incluindo os macrófagos ou células dendríticas, dos componentes do sistema imune inato, pode reconhecer patogénios fagocitam e processos componentes bacterianos em antigénios, que são apresentados na superfície da célula pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de ^5-7. Depois de APCs foram fagocitados patogénios, eles usualmente migram para os gânglios linfáticos de drenagem, onde eles interagem com Tcélulas. Os linfócitos T podem reconhecer complexos MHC-péptido específicos pelos seus receptores de células T. A sinapse imune (IS) ocorre na interface entre uma APC carregadas com antigénio e um linfócito durante a apresentação do antigénio ^8,9. Algumas bactérias podem sobreviver fagocitose e divulgar sistematicamente dentro APCs. Nesta visão, APCs infectados servem como reservatórios de bactérias ou "cavalos de tróia" que facilitam a propagação de bactérias ^10. O contato íntimo entre APCs e os linfócitos que ocorrem durante o curso de formação é também funcionar como uma plataforma para a troca de parte das membranas, material genético e exossomos e pode ser sequestrado por alguns vírus para infectar células T; este processo é chamado transinfection ^11-13.

Algumas bactérias patogénicas (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica e Shigella flexneri) são capazes de invadir os linfócitos T in vivo e alterar o seu comportamento ^14-16. Nós temosdescrito recentemente que os linfócitos T também são capazes de capturar as bactérias por transinfection a partir de células dendríticas infectadas anteriormente (DCs) durante o curso de apresentação de antigénio ^16. T célula bacteriana captura por transinfection muito mais eficaz (1,000-4,000x) do que infecções diretos. T patógeno células captura e bactérias não-patógeno indicando que transinfection é um processo impulsionado por células T. Surpreendentemente, transinfected T (TIT) células mortas rapidamente as bactérias capturados e fê-lo de forma mais eficiente do que os fagócitos profissionais ^16. Estes resultados, que quebram um dogma de imunologia, mostram que as células de imunidade adaptativa pode executar funções que foram supostamente exclusiva da imunidade inata. Além disso, mostrámos que as células tit secretar grandes quantidades de citocinas pró-inflamatórias e proteger de infecções bacterianas in vivo.

Aqui apresentamos os diferentes protocolos utilizados para estudar o processo transinfection bacteriana emum modelo de rato. Este modelo baseia-se na utilização de células ^T CD4 + a partir de ratinhos transgénicos OTII, que carregam um TCR específico para o péptido 323-339 de OVA (OVAp) no contexto de I-Ab ¹⁷ que interagem especificamente com o osso bacteriana infectada marrow- DCs derivadas BMDCs ^(18,19) carregados com OVAp, que formam sinapses imunes estáveis.

T transinfection célula pode ser visualizado e rastreados utilizando microscopia de fluorescência. Além disso, a citometria de fluxo pode ser usado para a detecção de células infectadas por aproveitando a fluorescência emitida por bactérias que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) ^16,20. Além disso, T transinfection célula pode ser quantificada por um método mais sensível, a gentamicina ensaio de sobrevivência que permite a medição de um grande número de eventos. A gentamicina é um antibiótico que não podem penetrar nas células eucarióticas. Portanto, utilizando este antibiótico permite a diferenciação de bactérias intracelulares que sobreviveram à adição de antibiótico FRos extracelulares om que foram mortas ^21.

Protocolo

Nota: Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidad Autónoma de Madrid e conduzido sob a supervisão da Universidad Autónoma de Madrid Cabeça de Bem-Estar Animal e Saúde de acordo com diretrizes espanholas e europeias. Os camundongos foram criados em free (SPF) de habitação específico patógeno e eles foram sacrificados por pessoal treinado e qualificado, utilizando dióxido de carbono _(CO 2) método de inalação.

1. Rato Medula Óssea derivado DCs Differentiation and Infection

Nota: A Figura 1 resume este primeiro passo. Todos os procedimentos devem ser realizados na capa deste ponto em diante, usando apenas estéreis mídia, instrumentos, pontas para pipetas e placas de cultura.

1. Rato de Medula Óssea DCs derivadas de Diferenciação
   1. Dissecar tíbias e fémures de uma C57 / BL6 rato ²² e transferir para um prato de plástico com 10 ml de meio RPMI.
   2. Corte cada epífise off, com tesoura estéril e expor medula óssea, que tem uma cor brilhante vermelha característica.
   3. Infundir o interior do osso com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (tampão / BSA / EDTA PBS) utilizando uma seringa esterilizada em um Petri estéril prato.
   4. Recolha a suspensão celular e centrifugue num tubo a 600 xg numa centrifugadora refrigerada (a 4 ° C).
   5. Ressuspender as células em 1 ml de cloreto de amónio-potássio-(ACK) tampão de lise (0,15 M NH ₄ Cl, 10 mM KHCO ₃ e EDTA 0,1 mM) e incuba-se durante 30 segundos a temperatura ambiente, a fim de eliminar as células vermelhas do sangue.
   6. Adicionar 10 ml de meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e filtrar através de um filtro de células (70 ^ M) para remover os fragmentos ósseos e aglomerados de células antes da centrifugação com a mesma velocidade (600 xg) porque aglomerados foram eliminados por filtração.
   7. Contar as células umad ajustar para 5 x 10 ⁵ células / ml de RPMI com 10% de FBS (contendo 50 ^ M B-mercaptoetanol, piruvato de sódio 1 mM) e adiciona-se 20 ng / ml de factor recombinante de murino de granulócitos-macrófagos de colônias estimulante (RM-GM-CSF) como uma concentração final.
   8. Adicionar a esta suspensão, uma qualidade microbiológica estéril, 15 cm numa caixa de Petri, e a cultura num _incubador de CO2 (37 ° C, 5% CO _2).
   9. De três em três dias, girar ambas as células não aderentes e as células destacadas com EDTA 5 mM em PBS e ressuspender em 5 x 10 ⁵ culas / ml de densidade celular, com meio fresco contendo 20 ng / ml de RM-GM-CSF.
2. Maturação das DCs e Antigen Carregando
   1. No dia 9, ressuspender as células a 5 x 10 ⁵ culas / ml de densidade em meio contendo 20 ng / ml de RM-GM-CSF. Em seguida, adiciona-se 20 ng / ml de lipopolissacárido (LPS) para permitir a expressão elevada de MHC-II em células e incuba-se um não-tecido tratadas com cultura estéril prato de Petri 15 cm durante 24 horas.
   2. Depois de umdia de LPS-estimulação, manchar algumas células com anticorpos contra DC CD11c rato, MHCII e Gr-1 para buscar diferenciação DCs por citometria de fluxo. Um exemplo de análise de citometria de fluxo de DC é mostrado na Figura 3A e 3B.
      1. Incubar as DCs (5 x 10 ⁵ células / amostra) com um anticorpo monoclonal anti-ratinho CD16 / CD32 a 2,5 ug / ml de concentração final em 50 ul de PBS / BSA / EDTA por amostra. Em seguida, adicionar 50 ul de anticorpos contra os MHCII (IA / IE), CD11c e Gr-1 conjugados com diferentes fluorocromos para 1: 100, 1: 200 e 1: 500 em / tampão de BSA / PBS EDTA respectivamente.
      2. Finalmente, lavar com DCs / tampão de BSA / PBS EDTA e analisar por citometria de fluxo de acordo com o protocolo do fabricante.
         Nota: Se as células são bem diferenciados, células estão prontas para carga de antigénio.
   3. Lavar as DCs com meio RPMI 10% FBS (sem antibióticos) e incubar-los com 10 ug / ml OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) em um tubo de plástico em 1 ml de RPMI 10% FBS por 5 x 10 ⁶ DC mínimo para 1 h a 37 ºC. Como controlo negativo, deixe DCs sem incubação com OVAp.
3. A infecção de DCs
   1. Infect DCs a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 bactérias (10 bactérias por DC) durante 1 hora numa _incubadora de CO2 (37 ° C, 5% CO _2).
   2. Lavar as células DC 3x em PBS 1x e em RPMI 10% FBS e centrifugar a 450 xg de modo a lavar a maior parte das bactérias extracelulares. Finalmente, Ressuspender as células em RPMI 10% FBS (sem antibióticos) a 20 x 10 ⁶ células / ml.

2. Isolamento de linfócitos ^T CD4 + a partir de Ratos Transgénicos OTII

Nota: A Figura 1 resume esta segunda etapa. Os gânglios linfáticos deve ser usado em vez de baço para isolar as células ^T CD4 +, pois a proporção de linfócitos T CD4 ⁺ no nódulo linfáticos (~ 50%) é maior do que no baço (~ 25%) e, portanto, a purificação poderia ser mais eficaz.

1. Faça suspensão de células individuais de linfonodos
   1. Remover inguinal, axilar, braquial, do colo do útero e da linfa mesentéricos ²³ a partir de ratinhos transgénicos OTII e transferir para um prato de plástico com 10 ml de RPMI 10% de FBS.
   2. Linfonodos moagem sob um capuz estéril usando duas lâminas de microscópio fosco. Coloque gânglios linfáticos de um lado fosco de uma lâmina de microscópio, e esfregue com o lado fosco do segundo slide até órgãos têm sido chão.
   3. Lavar única suspensão celular em tampão PBS / BSA / EDTA.
   4. Filtrar as células embora um filtro de células (70 ^ M) para remover o tecido conjuntivo e lava-se com / tampão de BSA / PBS EDTA.
   5. Ressuspender as células em 1 ml de tampão de lise ACK e incubar durante 1 min à temperatura ambiente a fim de eliminar as células vermelhas do sangue.
2. Isolamento de ^células T CD4 +
   1. Lave novamente como no passo 2.1.3 e contagemcélulas para voltar a suspender-los em 100 x 10 ⁶ células / ml em / tampão de BSA / PBS EDTA. Adicionar anticorpos biotinilados contra CD8, IgM, B220, CD19, MHC de classe II (I-Ab), CD11b, CD11c e DX5 a 1: 250 durante 30 min em gelo para posterior selecção negativa de células ^T CD4 +.
   2. Lave as células em / BSA / EDTA PBS e incubar as células (100 x 10 ⁶ células / ml) com microesferas de estreptavidina na concentração recomendada para o protocolo do fabricante, durante 15 min em gelo.
   3. Lave as células em / tampão de BSA / PBS EDTA e filtrá-las, embora de um filtro celular (30 uM) antes do isolamento de células ^T CD4 +.
   4. Isolar as células ^T CD4 + por selecção negativa utilizando uma máquina de separação de células magnético de acordo com o protocolo do fabricante.
   5. Contar as células e ajusta-se 4 x 10 ⁶ culas / ml com meio RPMI 10% FBS (sem antibióticos).
   6. Corrigir e manter em gelo isolaram células ^T CD4 + (3 x 10 ⁵ células) para verificar a pureza por fluxocitómetro como descrito ^24. Um exemplo de ^células T CD4 + de purificação é mostrada na Figura 3C.

3. T celular Transinfection Medição por ensaio de proteção gentamicina

Nota: A Figura 2 resume esta terceira etapa do protocolo.

1. T Transinfection celular
   1. Incubar as células ^T CD4 + isoladas com células infectadas DC (1: 1) (as DCs foram infectadas durante 1 hora e lavou-se para eliminar as bactérias livres) durante 30 min para permitir a formação de sinapses imune em um _incubador de CO2 (37 ° C, 5% CO _2).
   2. Adicionar 0,5 ml de células ^T CD4 + isoladas (2 x 10 ⁶ células) e 0,1 ml de DCs infectadas (2 x 10 ⁶ células) numa placa de cultura de 24 poços. Como controlo negativo, infectar directamente 0,5 ml de células ^T CD4 + a uma MOI de 10 bactérias durante 30 min.
   3. Incluir controlos adicionais que separam DCs infectadas a partir de células T utilizandouma barreira de policarbonato Transwell (com 3 um de tamanho dos poros), impedindo o contacto físico DC-T. Adicionar 0,1 ml de DC dentro do transwell e 0,5 ml de células ^T CD4 + para dentro do compartimento inferior do poço (placa de 24 poços).
   4. Finalmente, com meio RPMI completo até que não é de 0,6 ml em cada poço para tornar volumes iguais em todas as amostras.
   5. Após 30 minutos de formação da sinapse imune, adicionar 100 ug / ml de gentamicina e incubar durante 1 h antes de se recolher as células numa _incubadora de CO2 (37 ° C, 5% CO _2).
2. Re-isolamento de células ^T CD4 +
   1. Recolher as células não aderentes e ressuspender-los em tampão de PBS / BSA / EDTA. A maioria das DCs permanecem ligadas à placa de cultura de plástico. Tubos de vórtice suavemente para garantir a desagregação celular. Manter a 500 ul de sobrenadante de células como controlo para mostrar que a gentamicina tem funcionado bem.
   2. Re-isolamento das células ^T CD4 + a partir de amostras que contêm células T e DCs em conjunto, como no passo 2.2, Embora a maioria dos DCs deveria ter anexado ao prato. Mantenha as amostras de controlo no gelo. Leve em conta apenas experimentos com menos de 2% de contaminação. Um exemplo de ^células T CD4 +, após purificação transinfection é mostrado na Figura 3D.
3. As células T Lyse e semeá-los em bactérias placas de meio-ágar.
   1. Lave as células ^T CD4 + por duas vezes com PBS.
   2. Contar as células e ressuspender-los a 2 x 10 ⁶ culas / ml em PBS.
   3. Adicionar 500 ul de 0,1% de Triton X-100 em 500 uL de células T para lisar-los a 1 x 10 ⁶ células / ml, liberando as bactérias intracelulares para fora das células T.
   4. Faça 3 diluições decimais seriadas de células lisadas e sementes 50 ul de cada diluição em placas de ágar bactérias médios. Divida placas em 4 porções e semear as diferentes diluições de células lisadas em cada parte. Os resultados representativos são mostrados na Figura 4.
      1. Como controlo, também a placasobrenadante de células armazenados dos conjugados em agar, para assegurar que a gentamicina tem funcionado bem. Plate, também DCs infectadas como um controle adicional. No caso de baixa contaminação ocorre DCs (<2%), subtrair as unidades formadoras de colónias (CFUs) correspondentes a baixa contaminação DC.

4. Quantificação de células T Transinfection por citometria de fluxo

Nota: A Figura 2 sumaria este passo.

1. T Transinfection celular
   1. Infect BMDCs como na etapa 1.3, mas usar bactérias expressando GFP neste caso.
   2. Mancha células ^T CD4 + (isoladas de nódulos linfáticos no passo 2.2) com um rastreador aminocoumarin célula clorometilo (CMAC) durante 30 min a 37 ºC de acordo com o protocolo do fabricante.
   3. Lave as células ^T CD4 + rotulados duas vezes com RPMI a 10% de FBS (sem antibióticos).
   4. Incubar as DCs infectadas (após 1 h de incubação com bactérias) com rotulados ^CD4 +As células T durante 30 minutos para permitir a formação de sinapses imunes a 37 ° C, incluindo todos os controlos que explicam no passo 3.1.1.
2. Coloração de células infectadas ^T CD4 +
   1. Após 30 min de DC-T a formação de sinapses imune, recolher as células e lava-las em PBS / BSA / EDTA.
   2. Após duas lavagens com tampão PBS / BSA / EDTA, células agregados separados por vórtice suavemente os tubos.
   3. Fixar as amostras de 0,2 ml / tubo de PBS contendo 3% de PFA durante 15 min à TA. Em seguida, lave-os em PBS.
   4. Incubar com anticorpo monoclonal anti-ratinho-CD16 / CD32 (2,5 ug / ml) em 50 ul / amostra de PBS / BSA / EDTA durante 15 min em gelo para bloquear os receptores Fc de células dendríticas.
   5. Adicionar um coelho anti-bactérias anticorpo (10 ug / ml como concentração final) em 50 ul / amostra de PBS / BSA / EDTA durante 30 min em gelo para corar bactérias extracelulares.
   6. Lavar as células com PBS / BSA / EDTA e incubar com um anticorpo contra CD11c rato conjugado com ficoeritrina (PE) e uma SEcundária anticorpo contra coelho conjugado com outro fluorocromo Alexa-Fluor como 647 a 1: 200 em 100 ul / amostra de PBS / BSA / EDTA durante 30 min em gelo.
   7. Lave as células e analisar as amostras por citometria de fluxo. Não se esqueça de incluir uma amostra de células T transinfected usando bactérias não fluorescentes como controle negativo e amostras marcadas com apenas um de cada fluorocromo utilizado no experimento para compensar as amostras e ajustar a citometria de fluxo configurações ^25. Análise representativa está mostrada na Figura 5.
      Nota: Se as bactérias não expressam GFP, para distinguir intracelular e bactérias extracelulares, bactérias extracelulares etiqueta, corrigir, e permeabilizar amostras com Triton X-100 a 0,5% em PBS durante 5 min. Depois corar bactérias intracelulares totais (+ extracelular) com um fluorocromo diferente.

Resultados

Aqui descrevemos como executar transinfection bacteriana de células T de murino a partir de medula óssea derivadas de DCs infectadas e como medir transinfection bacteriana através de duas abordagens diferentes: a citometria de fluxo e ensaio de sobrevivência gentamicina A Figura 1 resume o procedimento para obter as células.. DCs são geradas por incubação de células de medula óssea com GM-CSF durante 9 dias. Em seguida, as DCs são maturados com LPS para aument...

Discussão

As células T ou linfócitos T são um tipo de leucócitos que desempenham um papel central na imunidade mediada por células e pertencem a resposta imune adaptativa ^26. As células T são refractários à infecção in vitro, mas alguns relatórios indicam que eles podem ser infectadas in vivo ^14,15. Os contatos íntimos de células T e APC durante sinapse imune servir de plataforma para o intercâmbio de material biológico ^{13, incluindo} alguns vírus, como o HIV

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Fisher Scientific	SH3025501
r-GMCSF	Peprotech	315-03
LPS	SIGMA	L2630-10mg
Na Pyruvate	Thermo Scientific	SH3023901
2-ME	Gibco	31350-010
OVAp OTII (323–339)	GenScript
Cell Strainer 70uM	BD	352350
30 uM Syringe Filcons Sterile	BD	340598
AutoMacs Classic	Miltenyi Biotec	130-088-887
Gentamicin	Normon	624601.6
Transwell	Costar	3415
LB	Pronadisa	1231
Agar	Pronadisa	1800
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton X-100
CD8 biot	BD Biosciences	553029
IgM Biot	ImmunoStep	Clone RMM-1
B220 Biot	BD Biosciences	553086
CD19 biot	BD Biosciences	553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)	BD Biosciences	553622
CD11b biot	Immunostep	11BB-01mg
CD11c biot	Immunostep	11CB3-01mg
DX5 biot	BD Biosciences	553856
Gr-1 biot	BD Biosciences	553125
CD16/CD32	ImmunoStep	M16PU-05MG
anti Salmonella	ABD Serotec	8209-4006
CD11cPE	BD Biosciences	553802
CD4-APC	Tonbo Biosciences	20-0041-U100
Gr-1 APC	BD Biosciences	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD Biosciences	553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed	Invitrogen	A-21245
CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin)	Life technologies	C2110
BSA	SIGMA	A7030-100G
Streptavidin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-101
BD FACSCanto II	BD Biosciences