交货蛋白质，多肽或细胞不可渗透的小分子进入活细胞被孵化与核内体溶解试剂dfTAT

摘要

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

摘要

大分子递送策略通常利用内吞途径蜂窝条目的路由。然而，内体截留严重限制与大分子穿透细胞的胞质空间的效率。最近，我们通过确定试剂dfTAT，标记有荧光团四甲肽TAT的二硫键二聚体规避这个问题。我们已经生成原型细胞穿透肽（CPP）的TAT，dfTAT，穿透活细胞和到达细胞具有特别高的效率的胞质空间的荧光标记的二聚体。胞质递送dfTAT的是在多种细胞系，包括原代细胞来​​实现的。此外，交货不会明显影响细胞的活力，增殖或基因表达。 dfTAT可以提供小分子，肽，抗体，生物活性酶和转录因子。在这份报告中，我们描述参与DFTA协议T合成和细胞输送。手稿描述如何通过改变蛋白质的细胞外给药量以控制蛋白质递送至细胞的胞质空间的量。最后，这种新技术和涉及验证输送步骤的当前局限性进行了讨论。所描述的方案应为基于细胞的测定以及对于离体操作的细胞和重编程是非常有用的。

引言

递送蛋白质，肽或细胞不可渗透的小分子进入活细胞是在许多生物或生物技术应用（细胞成像，功能测定法，细胞重新编程等 ^）1-4常常合乎需要的。许多递送方法已被报道，包括显微注射，电穿孔，或用载体试剂（例如，细胞穿透肽，例如TAT，脂质^）5-7。每种技术一般都有特定的优点和缺点，可能使这些方法足以满足一定的应用，但不是为别人。常见问题涉及在少数细胞而不在整个贫困人口递送效率和/或控制的多少材料输送^8,9，毒性或有害生理影响^10,11，缺乏临时控制的，交付的缺乏（例如，显微注射^）12，和复杂的化学缀合或制剂方案^11。

S ="jove_content">最近，我们已经开发了一种新的交付策略绕开这些限制。这一战略依赖于一个名为dfTAT肽（二聚体荧光^TAT）13。 dfTAT从公知的细胞穿透肽（CPP）的TAT而得。 dfTAT包含TAT的两个二硫键结合拷贝标记荧光团四甲基罗丹明。尽管他们的相似之处，TAT和dfTAT活性显著不同。 TAT是典型的内吞作用内化进入细胞。这CPP仍然但是在大多数被困在内涵体（这通常会导致细胞内的肽的点状分布时，利用荧光显微镜检查）。像TAT，dfTAT有效地被细胞内吞。然而，dfTAT不会留在里面内涵体困。相反，它介导内体泄漏的方式，是非常有效的。 dfTAT的内体裂解活性可以然后被利用通过一个简单孵育测定递送大分子。

ntent">传送过程的当前理解如下。dfTAT诱导巨吞。其结果是，细胞孵育dfTAT占用的可溶性蛋白，肽或小分子（感兴趣的分子，MOI）存在于介质通过流体相内吞作用（ 参见图1）。dfTAT和MOI之间的相互作用不是必须的，只要内吞途径中一起两个实体通信。正如dfTAT到达内吞细胞器的内腔中一个特定的阈值，它表示它的内体泄漏活性（的分子细节仍有待充分表征的）。漏细胞器的内腔的内容，因此，教学语言，然后被释放到细胞中。因此，这种方法是与MOI没有缀合或制剂计划必须很方便的。此外，由于dfTAT是不直接修改一个MOI，它还应不同的MOI功能干扰一旦细胞内递送的实现。此外，浓度dfTAT用于交付是独立于MOI的媒体。例如，dfTAT浓度可以保持不同的实验之间保持恒定，以保证在内体泄漏重现的效率。与此相反，MOI在媒体浓度可逐渐改变以达到所需水平的细胞质MOI交付。

实现了与dfTAT高内体泄漏效率显着地无害的许多测试日期的细胞。这是一个惊喜，因为内吞细胞器是细胞的重要组成部分，人们所期望的显着泄漏通过dfTAT介会伴随着有害的细胞反应。然而，处理的细胞增殖以相同的速率作为未经处理的细胞，并且不显示在其转录任何显著改变。此外，可交付使用可重复的递送效率分钟内反复，这表明细胞可以容忍或恢复从分娩过程，而不会丢失他们的能力，内吞作用或内体泄漏。 dfTAT交付和什么这些反应可能是有待探索的分子细节中微妙的细胞反应可能发生。然而，通过结合高效率，便利性的协议，并没有毒性，这种交付方法应该证明在许多细胞为基础的应用可以立即投入使用。本文提出的协议的目的是使该技术访问研究界。

研究方案

1. SPPS:CK（TMR）TATG（fTAT）合成

注意:dfTAT产生于两个步骤:合成的单体fTAT通过固相肽合成接着二硫键二聚化以形成dfTAT的。

1. 在一个标准的50 ml的SPPS容器溶胀二甲基甲酰胺（DMF）将500mg Rink酰胺MBHA树脂的1小时。
2. 通过温育的Fmoc保护的树脂中20％哌啶溶液（20％哌啶的DMF，将10毫升（0.30毫摩尔）进行Fmoc去保护。（1×5分钟和1×15分钟）用洗涤步骤使用贯彻去保护步骤两次DMF（洗涤步骤包括冲洗所述树脂多次使用的约150毫升DMF，总体积并除去通过真空过滤）中的溶剂中反应之间。
3. 合成CK（TMR）RKKRRQRRRG（fTAT）在Rink酰胺MBHA树脂。使用下面的Fmoc保护的氨基酸:Fmoc-赖氨酸（MTT）-OH（仅在N末端），将Fmoc-赖氨酸（BOC）-OH，使Fmoc-Gly-OH，Fmoc基 - 精氨酸（了Pbf）-OH，的Fmoc- GLN（TRT）-OH，和Fmoc-半胱氨酸（TRT）-OH。进行，使用N _2（20 PSI）以搅动该反应的反应。完成所有的反应在室温。
   1. 进行4小时的每个氨基酸偶联反应。对于每一个耦合，使用Fmoc基保护的氨基酸（1.2毫摩尔），N，N，N'，N' -四甲基-O-（1- -1H-苯并三唑 -1-基）脲六氟磷酸酯（HBTU）（0.44克，1.1毫摩尔），和二异丙基乙胺（DIEA）（0.51毫升，3.0毫摩尔）溶解在DMF中。以下的4小时耦合，用DMF洗涤树脂，并如在步骤1.2中所述进行Fmoc去保护步骤。
   2. 重复，直到fTAT的线性肽链:合成（线性肽链CKRKKRRQRRRG没有TMR）。
   3. 然后彻底使用第一DMF中，并以下，与二氯甲烷（DCM）洗涤树脂。冲洗树脂多次使用的约150毫升DMF或DCM的总体积与除去溶剂通过真空过滤。
   4. ü本身MALDI-TOF，确认获得的肽具有正确的分子量。
      1. 通过将1毫克矩阵到一个50微升的0.01％TFA的水溶液和50微升的乙腈组成的溶液使一个矩阵组合。
      2. 以确认线性肽链的质量，使用α氰基-4-羟基肉桂酸。运行粗肽的分析型HPLC和从纯峰的顶部收集50微升。
      3. 以制备样品到板在MALDI板上:添加8微升肽到2微升基质溶液和就位在MALDI板上的空气干燥或在37℃的热板。
         注意:精氨酸是已知的氨基酸难以夫妇在SPPS。成功的偶合是通过执行一个Kaiser试验^14（例如，茚三酮试验）确定。这种测试允许的游离胺可能留下的未偶联在树脂上的检测。万一蓝色被检测（指示游离胺的存在），耦合小号TEPS是重复的。
4. 为CK（-NH-TMR）TATG（fTAT），裂解MTT保护基赖氨酸的ε-氨基上的CK（-NH-MTT）TATG用的1％三氟乙酸（TFA）和2％三异丙基硅烷组成的溶液（TIS）的DCM。
   1. 作为除去MTT保护基将导致黄色的外观，孵育用20毫升上述溶液的树脂5分钟，重复上述操作直至没有黄色是观察。之间在洗净用DCM和DMF的树脂。此外，因为TIS是清除剂，将清除的MTT法，一旦无黄颜色出现在MTT法的存在下该溶液中。
   2. 添加用1％TFA的DCM溶液（无TIS）的附加溶液的树脂，以确保没有更多的MTT是除去并将溶液保持清澈。
5. 溶解的三个组成部分:Carboxytetramethylrhodamine（TMR），HBTU，和DIEA（4，3.9和10等价于相对于树脂（以mg）的量）的DMF并添加此混合物到树脂中，进行该反应O / N使用干燥的N _2，以提供搅拌。
6. 以下的Fmoc脱保护和氨基酸缀合，用DCM洗涤树脂，并让其干燥。用于从树脂上的肽的完全切割，添加含有92.5％TFA，2.5％的溶液_H 2 O的，2.5％，TIS和2.5％乙二硫醇（EDT）（总体积= 4毫升）的肽基树脂3小时，在室温以实现全球去保护和切割从树脂。
   1. 由排出溶液从步骤1.6成40 ml的_Et 2 O等的沉淀用冷的无水乙醚_（Et 2 O等）的粗肽的产品，旋下来，在4℃和4000×g离心20 - 25分钟。重复此步骤，以允许用冷无水乙醚_{2 O}沉淀物的洗涤
   2. 重悬沉淀物在水（5ml或直至沉淀完全溶解），并冷冻干燥。然后重悬在0.1％TFA水溶液/乙腈制得的产品。
<李>用分析C18柱（5微米，4×150毫米），以分析每一个肽进行HPLC分析。使用1毫升/分钟的流速，并检测在214nm和550nm处。
7. 在C18 10×250毫米柱的肽纯化进行半制备型HPLC。使用的4毫升/分钟的流速，并检测在214nm和550nm处。对于所有的运行时，使用0.1％TFA水溶液（溶剂A）和90％乙腈，9.9％水和0.1％TFA（溶剂B）中的线性梯度。
8. fTAT，预期质量::2,041.17，观察到的质量:2040.66根据制造商的协议通过MALDI-TOF确定的肽的正确身份。 DEAC-K9，预期质量:1,412.97，观察肿块:1,415.59。使用α-氰基-4-羟基肉桂酸矩阵的MALDI-TOF。

2.氧化反应:dfTAT代

1. 通气的磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4的1小时（至少5毫升下面的反应）。
2. 在AER溶解fTAT（0.3毫克^，1.5×10 -4毫摩尔）ated pH 7.4的PBS（5毫升）中。确保的pH为7.0之间 - 7.5在加入肽后。如果不添加氢氧化钠（1M，以小的增量1 - 5微升）以使pH恢复到7.4。
3. 注意:氧溶解在PBS作用以氧化硫醇基上fTAT和形成二硫键。
4. 章动反应O / N，以允许它直到完成（100％收率基于HPLC分析）反应。使用反相HPLC提纯产物和通过质谱法（MALDI-TOF）如在步骤1.9分析。预期质量:4,080.34，观察肿块:4,084.21。
5. 冷冻干燥纯dfTAT（0.71×10 ^-4毫摩尔），并悬浮在200μl水（浓度纯dfTAT = 356.3μM）。

3.测量dfTAT浓度

1. 在149微升的50mM TCEP溶液重悬纯化dfTAT（通常为1微升取决于肽的纯化的量）的等分试样。
2. 注:在这一步dfTAT减记至莫nomer对口fTAT消除时出现的吸光度淬火由于TMR荧光团在dfTAT近距离（TMR在dfTAT消光系数ε减小相比TMR的降低fTAT的ε）。
3. 允许样品大约20分钟反应（分析性HPLC可用于确认形成fTAT的）。
4. 添加所有的溶液到石英比色皿，测量吸光度556纳米。
5. 使用比尔定律（A =εcl:ε= 91500 ^{M-1 -1）}来计算fTAT的浓度，确定dfTAT的浓度，并划分[fTAT]由两个。

4.蜂窝交货实验

1. 种子在培养皿中的细胞（HeLa细胞，HDF， 等）在80汇合- 90％（例如，8孔或24孔皿）。生长的细胞在适当的培养基（例如，DMEM补充有10％FBS和青霉素/链霉素），直到80 -在37℃90％汇合湿润气氛含有5％ _的 CO 2。
2. （通过添加200微升PBS，然后除去它三次）洗涤细胞，用PBS三次（3倍）。
3. 使dfTAT的5μM的工作浓度在NRL-15培养基稀释dfTAT（在水中）的股票（对于一个8井菜的总体积应为200微升）。 5微米dfTAT甲浓度导致有效递送在测试日期（ 图3）大多数细胞类型（在90％以上的细胞中存在的碟形高水平胞质递送）。然而，较低或较高的浓度可能是更充分的用于与高或低的倾向为渗透的细胞类型。
   注意有关介质:NRL-15用于dfTAT的交付，因为它不含有半胱氨酸可能降低dfTAT二硫键。然而，我们的数据表明，这两个定期L-15（半胱氨酸）和DMEM可以用作传递介质。 L-15的包含还原氨基酸半胱氨酸但半胱氨酸presumabLY氧化在媒体上形成胱氨酸（DMEM是制定与胱氨酸）。因此dfTAT丝毫无损这些媒体和传送工作在相同的效率，与nrL15获得。
4. 孵育细胞dfTAT（5μM）具有或不具有货物（例如，绿色荧光蛋白（10μM）），并保持在37℃下进行1小时（温育时间可以减少，但dfTAT通常需要大约30至45分钟，以诱导内体泄漏）。
5. 用肝素（1毫克/毫升）中的L-15洗涤细胞（3次洗涤，建议）以除去dfTAT结合于细胞的质膜上。
6. 孵育细胞与细胞不透核染色剂，例如，SYTOX蓝，SYTOX绿（2μM在NRL-15），以确定细胞的质膜是否受到损害，根据（死细胞将同时活细胞不会被染色）制造商的协议。
7. 使用荧光显微镜（100X油浸或20X物镜）图像的细胞。使用RFP滤波器（图片dfTAT防爆=560±20纳米/ EM = 630±35纳米）。
   注意:成功递送导致dfTAT的漫荧光整个细胞（评估蛋白质或感兴趣的肽的递送将取决于应用）。核仁由fTAT（dfTAT的时胞质条目的还原产物）的染色可以用作一个指示检测到的荧光是细胞内的。 fTAT将在几个小时内降解。在这一点上，降解片段的荧光将显示为点状。这不应该混淆为点状分布也可以看出，如果dfTAT仍然不成功内内体困（这可能发生，如果dfTAT出现在太低的浓度）。

MOI 5. Controling集中交付

1. 确定实现dfTAT中使用的细胞类型高效胞浆释放所需要的"最优配送"的浓度。在细胞培养与increasin执行荧光显微镜克浓度dfTAT的。最佳dfTAT浓度被定义为最小浓度，导致清除胞质"扩散"TMR荧光细胞的大约100％在培养。
2. 改变MOI的浓度用在共温育协议，同时保持dfTAT恒定的浓度（例如，使用dfTAT的最佳递送浓度）。改变培养时间以不足1小时也可以是一种选择，以改变的量的MOI递送。

结果

为了评估fTAT和dfTAT之间的差，HeLa细胞被温育1小时以每种肽，以确定在他们的细胞定位的差异。使用荧光显微镜的两个CPP的内化进行了评估。 图2表明，fTAT（20μM）定位于点状分布。这种分布是一致的肽剩余的夹带里面内涵体。与此相反，dfTAT（5微米）的荧光信号显示整个胞质溶胶和细胞核的均匀分布;图3示出了 dfTAT的胞质分布在许多不同的细胞系，包括COLO 31...

讨论

因为这用于dfTAT交付不应过分融合的细胞（> 90％汇合）可能会影响传递效率。该细胞也应该是健康的:死细胞的培养可以释放凋亡片段与dfTAT可交互（例如，从DNA降解核）。这反过来又可以与递送效率和成像质量干扰。细胞应彻底洗净加入dfTAT之前删除FBS。 BSA存在的FBS可以结合dfTAT并且这可以降低dfTAT的递送效率。洗涤然而，应当小心以过大的力进行可能导致贴壁细胞从培养皿分离或...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin	Sigma	CAS 9041-08-1
SYTOX Blue	Invitrogen	S11348
SYTOX Green	Invitrogen	S7020
nrL15 L-15 (–) cysteine	Hyclone		Special order
Fmoc-protected Amino acids	Novabiochem
dfTAT			Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)
Biosafety Cabinet
Inverted epifluorescence microscope	Olympus	model IXB1	equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).
37 °C humidified, 5% CO2 incubator
Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis