Доставка белки, пептиды или сотовых непроницаемый малых молекул в живых клетках при инкубации с эндосомолитического реагента dfTAT

Резюме

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Аннотация

Высокомолекулярные стратегии доставки, как правило, используют в качестве эндоцитотический путь маршрута сотовых запись. Тем не менее, эндосом захвата серьезно ограничивает эффективность, с которой макромолекулы проникают цитозольного пространство клеток. Недавно мы обойти эту проблему путем идентификации реагента dfTAT, дисульфидной связью димер пептида TAT меченого флуорофором с тетраметилродамин. Мы сформировали флуоресцентно меченного димера прототип сотового проникновения пептид (СРР) ТАТ, dfTAT, который проникает живые клетки и достигает цитозольную пространство клеток с особенно высокой эффективностью. Цитозольного доставка dfTAT достигается в нескольких клеточных линий, в том числе первичных клеток. Кроме того, доставка не заметно повлиять на жизнеспособность клеток, пролиферацию или экспрессию генов. dfTAT может доставить небольшие молекулы, пептиды, антитела, ферменты, биологически активные и транскрипционный фактор. В этом докладе мы описываем протоколы, участвующие в DFTAСинтез Т и клеточная доставки. В рукописи описано, как контролировать количество белка подаваемого в цитозоле клеток пространстве, изменяя количество белка вводят внеклеточно. Наконец, обсуждаются текущие ограничения этой новой технологии и этапов в проверке доставку. Описанные протоколы должны быть чрезвычайно полезны для клеточных анализов, а также для манипулирования экс виво и перепрограммирования клеток.

Введение

Доставка белки, пептиды или клеточных непроницаемый малых молекул в живых клетках часто желательно во многих биологических или биотехнологических приложений (сотовой изображений, функциональные пробы, сотовые перепрограммирования, и т.д.). ^1-4. Многие подходы доставки уже сообщалось, в том числе микроинъекции, электропорации или использования носителей агенты (например., Cell-проникающих пептидов, таких как ТАТ, липиды) ^5-7. Каждый метод, как правило, имеет определенные плюсы и минусы, которые могли бы сделать эти подходы достаточно для некоторых приложений, но не для других. Общие вопросы включают плохие эффективность доставки и / или отсутствие контроля, сколько материал поставляется ^8,9, токсичности или вредного физиологического воздействия ^10,11, отсутствие временной контроль, доставка в несколько клеток, но не в целом населения (например., микроинъекции) ^12, и сложный химический сопряжения или формулировка схемы ^11.

S = "jove_content"> В последнее время мы разработали новую стратегию доставки, которая обходит эти ограничения. Эта стратегия опирается на пептида по имени dfTAT (димер люминесцентные ТАТ) ^13. dfTAT происходит от хорошо знаю клеток проникающим пептида (СРР) ТАТ. dfTAT содержит две дисульфидные связаны копии ТАТ меченные флуорофора тетраметилродамин. Несмотря на сходство, ТАТ и dfTAT значительно отличаются деятельности. ТАТ обычно интернализации в клетки эндоцитоза. Это СРР, однако, остается в основном в ловушке внутри эндосом (это, как правило, приводит к распределению точечной пептида внутри клеток при рассмотрении с помощью флуоресцентной микроскопии). Как ТАТ, dfTAT эффективно эндоцитозу клетками. Тем не менее, dfTAT не оставаться в ловушке внутри эндосом. Вместо этого, он опосредует утечки эндосом таким образом, что является чрезвычайно эффективным. Эндосомолитического деятельность dfTAT то может быть использована для доставки макромолекул с помощью простого анализа инкубации.

ntent "> В настоящее время понимание процесса доставки выглядит следующим образом. dfTAT вызывает макропиноцитозом. В результате, клетки инкубировали с dfTAT занять растворимые белки, пептиды, или небольших молекул (молекул интересов, МВД), присутствующих в средствах массовой информации по жидкости фазы эндоцитоз (рисунок 1). Взаимодействие между dfTAT и МВД не нужны, пока обе структуры трафика вместе в эндоцитотического пути. Как dfTAT достигает определенного порога в пределах просвет эндоцитотических органелл, он выражает свою деятельность утечки эндосом (молекулярные данные остаются полностью охарактеризованы). Содержание просвет негерметичных органелл, и, следовательно, МВД, затем выбрасывается в клетках. Этот подход, следовательно, очень удобно, так как отпадает необходимость в схемах сопряжения или композиции с MOI. Кроме того, из-за dfTAT является непосредственно не модификации MOI, следует также не мешают функции MÕIS раз внутриклеточной доставки достигается. Кроме того, концентрациюdfTAT используется доставки независимым от МВД в средствах массовой информации. Например, концентрация dfTAT может поддерживаться постоянным между различными экспериментами, чтобы гарантировать воспроизводимость эффективность в утечки эндосомный. В противоположность этому, концентрация МВД в среде может быть постепенно изменяется для достижения желаемых уровней МВД поставляется в цитозоле.

Высокая эффективность эндосом утечки достигается с dfTAT удивительно безвредны для многих клеток, протестированных на сегодняшний день. Это потому, что сюрприз эндоцитотический органеллы важным компонентом клеток и можно было бы ожидать, что резкое утечки посредничестве dfTAT будет сопровождаться вредных клеточных реакций. Тем не менее, обработанные клетки размножаются с такой же скоростью, как необработанных клетках и не отображать любые существенные изменения в их транскриптома. Кроме того, доставка может быть повторен в течение нескольких минут с эффективностью доставки воспроизводимых, указывая, что клетки могут либо терпеть или восстановить из процесса доставки без потериих способность к эндоцитоза или утечки эндосомный. Тонкие клеточные ответы могут иметь место во время dfTAT доставки и молекулярных деталях, что эти ответы могут быть еще предстоит исследовать. Тем не менее, комбинируя высокую эффективность, удобство протоколов, а также отсутствие токсичности, эта поставка подход должен доказать сразу полезна во многих приложениях на основе клеток. Протоколы, представленные здесь, направлены на то, что эта технология доступна для научного сообщества.

протокол

1. SPPS: CK (ПМР) TATG (fTAT) Синтез

Примечание: dfTAT производится в два этапа: синтез мономеров fTAT путем синтеза пептидов в твердой фазе с последующим дисульфида димеризации облигаций для формирования dfTAT.

1. Выпуклость 500 мг амидного каток МБГА смоле в диметилформамиде (ДМФА) в стандартном 50 мл SPPS судна в течение 1 часа.
2. Выполнение Fmoc снятие защиты путем инкубации Fmoc защищенную смолу в 20% -ном растворе пиперидина (20% пиперидина в ДМФ, 10 мл (0,30 ммоль). Провести этапы снятия защиты в два раза (1 х 5 мин и 1 х 15 мин) с отмывкой при помощи ДМФ (стадию промывки включает промывки смолы многократно с общим объемом около 150 мл ДМФ и удал растворитель с помощью вакуумного фильтрования) между реакций.
3. Обобщить CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) на каток амидной МВНА. Используйте следующие Fmoc защищенных аминокислот: Fmoc-Lys (МТТ) -OH (только на N-конце), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- ГLn (Trt) -OH, Fmoc и Cys-(Trt) -OH. Проведение реакции с использованием _N 2 (20 PSI) для перемешивания реакцию. Выполнение всех реакций при комнатной температуре.
   1. Провести каждый реакции сочетания аминокислотную в течение 4 ч. Для каждого сочетания, используют Fmoc защищенной аминокислоты (1,2 ммоль), N, N, N ', N' -Tetramethyl- О- (1Н--benzotriazol 1-ил) урония (HBTU) (0,44 г, 1,1 ммоль ), и диизопропилэтиламина (DIEA) (0,51 мл, 3,0 ммоль) растворяли в ДМФА. После 4 ч муфты, мыть смолы ДМФ и провели Fmoc стадии снятия защиты, как описано в шаге 1.2.
   2. Повторяйте, пока линейный пептид цепь fTAT (Linear пептидной цепи: CKRKKRRQRRRG нет ПМР) не было синтезировано.
   3. Затем промыть тщательно с использованием смолы первый DMF и после этого с дихлорметане (DCM). Промыть смолы многократно с общим объемом около 150 мл ДМФ или ДХМ и удаления растворителя путем вакуумной фильтрации.
   4. USE MALDI-TOF для подтверждения, что пептид, полученный имеет правильную молекулярную массу.
      1. Сделать матрицу смесь, добавив 1 мг матрицы в растворе, содержащем 50 мкл 0,01% TFA в водном растворе и 50 мкл ацетонитрила.
      2. Чтобы подтвердить, линейную массу пептидной цепи, использовании α-циано-4-гидроксикоричной кислоты. Выполнить аналитической ВЭЖХ неочищенного пептида и собирать 50 мкл из верхней части чистого пика.
      3. Чтобы подготовить образец к пластине на MALDI пластины: добавить 8 мкл пептида 2 мкл раствора матрицы и место на пластине MALDI высохнуть на воздухе или на 37 ° C нагревательной пластине.
         Примечание: аргинин, как известно, аминокислота трудно пара в SPPS. Успешное муфты устанавливается посредством выполнения тест Кайзера ¹⁴ (например, нингидрина тест). Этот тест позволяет для обнаружения свободных аминов, которые могут остаться отсоединяется от смолы. В случае, если синий цвет обнаружен (свидетельствует о присутствии свободных аминов), муфты сТЭЦ повторяются.
4. Для CK (-NH-ПМР) TATG (fTAT), расщепляют защитной группы МТТ в -аминогруппы Lys на CK (-NH-МТТ) TATG раствором, состоящим из 1% трифторуксусной кислоты (TFA) и 2% триизопропилсилана (ТИС) в DCM.
   1. Как удаление защитной группы МТТ приведет к появлению желтого цвета, инкубировать смолы с 20 мл указанного выше раствора в течение 5 мин, повторять это до тех пор, не наблюдается желтый цвет. Вымойте смолы с DCM и DMF между ними. Кроме так ТИС является поглотитель, который собирать МТТ, как только не желтый цвет не появляется в растворе в присутствии МТТ.
   2. Добавление дополнительного раствора с 1% TFA в DCM (не TIS) к смоле, чтобы обеспечить не не больше МТТ удаляли и раствор остается прозрачным.
5. Растворите три компонента: Carboxytetramethylrhodamine (ПМР), HBTU и DIEA (4, 3,9 и 10 эквивалентности в отношении к количеству смолы (в мг)) в ДМФА и добавляют эту смеськ смоле и проводить реакцию O / N с использованием сухого _N 2, чтобы обеспечить перемешивание.
6. После снятия защиты Fmoc-и сопряжения аминокислоты, мыть смолы с DCM и дайте ему высохнуть. Для полного расщепления пептида от смолы, добавляют раствор, содержащий 92,5% TFA, 2,5% _Н 2 О, 2,5%, ТИС, и 2,5% этандитиола (EDT) (общий объем = 4 мл) к пептидил-смолы в течение 3 ч при комнатной температуре, чтобы достичь глобального снятие защиты и отщепление от смолы.
   1. Осадок неочищенного пептида продукты, используя холодную безводном этиловом эфире _(Et 2 O), слив раствора со стадии 1.6 в 40 мл _Et 2 O, спина это вниз при 4 ° С и 4000 мкг в течение 20 - 25 мин. Повторите этот шаг, чтобы промывку осадка холодной безводного Et _{2 O.}
   2. Ресуспендируют Осадок в воде (5 мл или до осадок полностью растворяется) и лиофилизации. Затем вновь суспендируют продукты, полученные в 0,1% -ном водном TFA / ацетонитрила.
7. Выполнить анализ ВЭЖХ с аналитической колонке C18 (5 мкм, 4 х 150 мм), чтобы проанализировать каждый пептид. Использование скорости потока 1 мл / мин и детектирование при 214 нм и 550 нм.
8. Выполнение полупрепаративной ВЭЖХ на 10 х 250 мм колонку C18 для очистки пептидов. Использование скорости потока 4 мл / мин и детектирование при 214 нм и 550 нм. Для всех трасс, использовать линейные градиенты 0,1% водной ТФК (растворитель) и 90% ацетонитрила, 9,9% воды и 0,1% TFA (растворитель В).
9. Проверьте правильность личность пептидов MALDI-TOF в соответствии с протоколом производителя: fTAT, как ожидается массовое: 2,041.17, наблюдаемой массы: 2040.66. DEAC-K9, как ожидается масса: 1,412.97, наблюдается масса: 1,415.59. Использование альфа- циано-4-гидроксикоричной кислоты матрицу для MALDI-TOF.

2. Окисление Реакция: dfTAT поколения

1. Аэрируйте забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), рН 7,4 в течение 1 ч (по крайней мере, 5 мл для реакции ниже).
2. Растворите fTAT (0,3 мг, 1,5 х 10 ^-4 ммоль) в AERованные PBS, рН 7,4 (5 мл). Убедитесь, что рН в интервале между 7,0 - 7,5 после добавления пептида. Если не добавить гидроксид натрия (1 М, с небольшим шагом 1 - 5 мкл), чтобы довести рН обратно до 7,4.
3. Примечание: кислорода, растворенного в PBS действует для окисления тиоловых групп на fTAT и образовывать дисульфидную связь.
4. Качаться реакции O / N, чтобы он не реагирует до завершения (100% выход по данным ВЭЖХ). Очищают продукт с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой и анализировать с помощью масс-спектрометрии (MALDI-TOF), как на шаге 1.9. Ожидаемая масса: 4,080.34, наблюдается масса: 4,084.21.
5. Лиофильной сушке чистой dfTAT (0,71 x10 ^-4 ммоль) и ресуспендируют в 200 мкл воды (концентрация чистого dfTAT = 356,3 мкМ).

3. Измерение dfTAT Концентрация

1. Ресуспендируют аликвоту очищенного dfTAT (обычно 1 мкл в зависимости от количества пептида, очищенного) в 149 мкл 50 мМ раствора ТСЕР.
2. Примечание: На этом этапе dfTAT уменьшается до моNomer коллега fTAT устранить закаливание поглощения, что происходит из-за непосредственной близости от флуорофора ПМР в dfTAT (коэффициент экстинкции ε ПМР в dfTAT уменьшается по сравнению с е ПМР в сниженной fTAT).
3. Разрешить образец реагировать в течение примерно 20 мин (аналитической ВЭЖХ может быть использована для подтверждения формирования fTAT).
4. Добавить весь раствор в кварцевой кювете и измерить оптическую плотность при 556 нм.
5. Используя закон Бера (A = εcl: ε = 91,500 ^М -1 ^см -1), чтобы рассчитать концентрацию fTAT, определить концентрацию dfTAT, и разделить [fTAT] на два.

4. Сотовые Эксперименты Доставка

1. Семенной клеток (HeLa, HDF, и т.д.). В блюдо на слияния 80 - 90% (например, 8-а или 24-а блюдо). Рост клеток в соответствующей среде (например, DMEM, дополненной 10% FBS и ручка / Strep) до 80 - 90% слияния в 37 ° Cувлажненной атмосфере, содержащей _5% CO 2.
2. Промыть клетки три раза (3X) с PBS (добавлением 200 мкл PBS, а затем удалить его три раза).
3. Выполнить 5 мкм рабочую концентрацию dfTAT разбавлением запас dfTAT (в воде) в NRL-15 средств массовой информации (за 8 дном размерами общий объем должен быть 200 мкл). Концентрация 5 мкМ dfTAT приводит к эффективной доставки (высокий уровень цитозольного доставки в более чем 90% клеток, присутствующих в блюдо) в большинстве типов клеток испытанных на сегодняшний день (рисунок 3). Тем не менее, более низкие или более высокие концентрации могут быть более адекватными для типов клеток с высокой или низкой склонностью к проникновению.
   ПРИМЕЧАНИЕ О СМИ: NRL-15 используется для доставки dfTAT, так как он не содержит цистеин, который может уменьшить дисульфидные связи в dfTAT. Тем не менее, наши данные показывают, что как обычная L-15 (с цистеином) и DMEM, может быть использован в качестве подающего средства массовой информации. L-15 содержит восстанавливающий аминокислоты цистеин, но цистеина presumabLY окисляет в средствах массовой информации, чтобы сформировать цистина (DMEM, формулируется с цистина). Поэтому dfTAT остается неизменным в этих средах и доставка работает на той же эффективностью, что и полученные с nrL15.
4. Инкубируйте клетки с dfTAT (5 мкМ) или без груза (например., EGFP (10 мкм)) и сохранить при 37 ° С в течение 1 часа (время инкубации может быть уменьшена, но dfTAT обычно требует примерно 30 до 45 мин, чтобы вызвать утечку эндосом ).
5. Промыть клетки с гепарином (1 мг / мл) в L-15 (3 стирок рекомендуется), чтобы удалить dfTAT связан с плазматической мембраной клеток.
6. Инкубируйте клетки с клетками непроницаемой ядерной пятно, например., Sytox синий, Sytox Зеленый (2 мкМ в НРЛ-15), чтобы определить, находится под угрозой ли плазматическая мембрана клеток (мертвые клетки будут окрашены в то время как живые клетки не будут) в соответствии с Протокол производителя.
7. Клетки изображение, используя флуоресцентный микроскоп (100X масло погружения или 20X цель). Изображение dfTAT помощью RFP фильтр (Ех =560 ± 20 нм / Em = 630 ± 35 нм).
   Примечание: Успешное осуществление приводит к диффузный флуоресценции dfTAT по всей клетке (оценка доставку белка или пептида интерес, будет зависеть от приложения). Окрашивание ядрышек по fTAT (восстановленный продукт dfTAT при цитозольного записи) может быть использован как указание, что флуоресценция является внутриклеточным обнаружено. fTAT будет деградировать в течение нескольких часов. В этот момент, флуоресценция фрагментов деградации появится в пунктате. Это не следует путать для распределения точечных, что также видно, если dfTAT остается безуспешно ловушке внутри эндосом (это может произойти, если dfTAT присутствует в слишком низкой концентрации).

5. приободрить Концентрация МВД Поставляется

1. Определить оптимальный "доставки" концентрации, необходимой для достижения эффективного цитозольную выпуск dfTAT в типе клеток, используемых. Выполните флуоресцентной микроскопии на клетки инкубировали с increasinКонцентрации г dfTAT. Оптимальная концентрация dfTAT определяется как минимальной концентрации, что приводит к очистить цитозольного "диффузное" флуоресценции ПМР примерно 100% клеток в культуре.
2. Вары концентрация МВД используется в протоколе совместного инкубирования при сохранении постоянной концентрации dfTAT (например, с помощью оптимальной концентрации доставки dfTAT в). Изменение времени инкубации до менее чем 1 ч также может быть вариант, чтобы изменить количество МВД доставлены.

Результаты

Для оценки разницы между fTAT и dfTAT, HeLa клетки инкубировали в течение 1 часа с каждым пептидом, чтобы определить разницу в их клеточной локализации. Интернализация два СРР оценивалось с помощью флуоресцентной микроскопии. На рисунке 2 показано, что fTAT (20 мкМ) локализуется в распред...

Обсуждение

Клетки, используемые для доставки dfTAT не должны быть чрезмерно сливной (> 90% слияния), так как это может повлиять на эффективность доставки. Клетки также должна быть здоровой: мертвые клетки в культуре могут освободить апоптоза фрагменты, с которыми могут взаимодействовать dfTAT (напри?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin	Sigma	CAS 9041-08-1
SYTOX Blue	Invitrogen	S11348
SYTOX Green	Invitrogen	S7020
nrL15 L-15 (–) cysteine	Hyclone		Special order
Fmoc-protected Amino acids	Novabiochem
dfTAT			Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)
Biosafety Cabinet
Inverted epifluorescence microscope	Olympus	model IXB1	equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).
37 °C humidified, 5% CO2 incubator
Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis