Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT

Zusammenfassung

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Zusammenfassung

Makromolekulare Lieferstrategien verwenden typischerweise die endozytischen Weg als Weg der zellulären Eintrag. Jedoch schränkt endosomalen Einschluß der Effizienz bei der Makromoleküle eine cytosolische Raum der Zellen einzudringen. Vor kurzem haben wir dieses Problem durch die Identifizierung der Reagenzien dfTAT, eine Disulfidbindung Dimer des Peptids TAT ​​mit dem Fluorophor Tetramethylrhodamin markiert umgangen. Wir haben eine fluoreszenzmarkierte Dimer des prototypischen zellpenetrierende Peptid (CPP) TAT dfTAT, die lebende Zellen eindringt und erreicht den cytosolischen Raum von Zellen mit einem besonders hohen Wirkungsgrad erzeugt wird. Cytosolische Lieferung dfTAT in mehreren Zelllinien, einschließlich Primärzellen erreicht. Außerdem dauert die Lieferung nicht merklich beeinträchtigen die Lebensfähigkeit der Zellen, Proliferation oder Genexpression. dfTAT können kleine Moleküle, Peptide, Antikörper, biologisch aktive Enzyme und einen Transkriptionsfaktor zu liefern. In diesem Bericht beschreiben wir die Protokolle DfTa beteiligtT-Synthese und Zell Lieferung. Die Handschrift beschreibt, wie die Menge des Proteins an das cytosolische Raum der Zellen zugeführt, indem die Menge an Protein extrazellulär verabreicht steuern. Schließlich werden die jeweiligen Einschränkungen dieser neuen Technologie und Schritte bei der Validierung Lieferung beteiligt diskutiert. Die beschriebenen Protokolle sollten für zellbasierte Assays als auch für die ex vivo-Manipulation und Reprogrammierung von Zellen extrem nützlich sein.

Einleitung

Die Verabreichung von Proteinen, Peptiden oder zell undurchlässigen kleinen Molekülen in lebende Zellen ist häufig bei vielen biologischen oder biotechnologischen Anwendungen (zelluläre Bildgebung, funktionelle Assays Reprogrammierung, ^etc.) 1-4 wünschenswert. Vielen Lieferansätze bereits berichtet wurden, einschließlich Mikroinjektion, Elektroporation oder Verwendung von Trägermitteln (z. B. zellpenetrierenden Peptide wie TAT, Lipide) ^5-7. Jede Technik hat in der Regel spezifische Vor- und Nachteile, die diese Ansätze angemessen für bestimmte Anwendungen, aber nicht für andere machen könnten. Häufige Probleme beinhalten schlechte Lieferung Effizienzen und / oder Mangel an Kontrolle, wie viel Material ^8,9 geliefert, Toxizität oder nachteilige physiologische Auswirkungen ^10,11, mangelnde zeitliche Kontrolle, Lieferung in wenigen Zellen, nicht aber in einer Gesamtbevölkerung (z. B. ^{Mikroinjektion)} 12, und komplexe chemische Konjugation oder Formulierungssysteme ^11.

s = "jove_content"> Kürzlich haben wir einen neuen Liefer Strategie, die diese Einschränkungen umgeht entwickelt. Diese Strategie stützt sich auf ein Peptid mit dem Namen dfTAT (Dimer Fluoreszenz TAT) ^13. dfTAT wird aus der gut bekannten zellpenetrierenden Peptid (CPP) TAT abgeleitet. dfTAT enthält zwei disulfidgebundenen Kopien TAT mit dem Fluorophor Tetramethylrhodamin markiert. Trotz ihrer Ähnlichkeiten, TAT und dfTAT unterscheiden sich erheblich in der Aktivität. TAT wird typischerweise durch Endozytose in die Zellen internalisiert. Das CPP bleibt jedoch meist innerhalb Endosomen gefangen (dies in der Regel auf eine punktförmige Verteilung des Peptids in Zellen führen, wenn durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht). Wie TAT wird dfTAT effizient von Zellen Endozytose. Allerdings bedeutet dfTAT nicht in Endosomen gefangen zu bleiben. Stattdessen vermittelt es endosomalen Leckage in einer Weise, die sehr effizient ist. Die endosomolytische Aktivität dfTAT können dann genutzt werden, um Makromoleküle durch eine einfache Inkubation Assay zu liefern.

ntent "> Das aktuelle Verständnis der Lieferprozess ist wie folgt. dfTAT induziert Makropinozytose. Dadurch Zellen mit dfTAT inkubiert nehmen lösliche Proteine, Peptide oder kleine Moleküle (Moleküle von Interesse, MOI) in Medien präsent durch Flüssigkeitsphasen- Endozytose (siehe Abbildung 1). Die Wechselwirkungen zwischen dfTAT und MOI sind nicht erforderlich, solange beide Entitäten Verkehr zusammen im endocytischen. Wie dfTAT erreicht eine bestimmte Schwelle im Lumen endozytischen Organellen, ihre endosomalen Leckageaktivität (die molekularen Details ausdrückt bleiben werden vollständig charakterisiert). Der Inhalt des Lumens leaky Organellen und damit die MOI, wird dann in den Zellen freigesetzt wird. Dieser Ansatz ist daher sehr praktisch, da keine Konjugation oder Zubereitung Schemata mit MOI erforderlich. Da außerdem dfTAT ist nicht direkt Modifizieren einer MOI, sollte es auch nicht mit MOIs Funktion stören, wenn intrazelluläre Abgabe erreicht wird. Darüber hinaus ist die Konzentration vondfTAT verwendet Lieferung ist unabhängig von jenem des Innenministeriums in Medien. Zum Beispiel kann dfTAT Konzentration zwischen verschiedenen Versuchen konstant gehalten wird, um reproduzierbare Effizienzen in endosomalen Leckage zu gewährleisten. Im Gegensatz dazu kann die Konzentration des MOI in Medien allmählich geändert werden, um gewünschte Niveaus erreichen MOI in Cytosol abgegeben.

Die hohe Effizienz bei der endosomalen Leck dfTAT erreicht ist bemerkens unschädlich, viele der Zellen, die bisher getestet. Das ist eine Überraschung, weil endozytischen Organellen sind wichtiger Bestandteil der Zellen und würde man erwarten, dass die dramatische Leckage durch dfTAT vermittelt würden von schädlichen Zellreaktionen begleitet werden. Doch behandelten Zellen vermehren sich mit der gleichen Geschwindigkeit wie unbehandelte Zellen und keine wesentlichen Veränderungen in ihrem Transkriptom anzuzeigen. Darüber hinaus können innerhalb von Minuten mit reproduzierbaren Abgabeeffizienzen wiederholt werden, was darauf hinweist, dass die Zellen entweder toleriert oder erholen sich von den Lieferprozess ohne Verlustihre Fähigkeit zur Endozytose oder endosomalen Leckage. Subtile zellulären Reaktionen während dfTAT Lieferung und die molekularen Details, was diese Reaktionen könnte bleiben, erkundet zu werden werden stattfinden könnte. Doch durch das hohe Wirtschaftlichkeit, Bequemlichkeit der Protokolle, und das Fehlen von Toxizität, diese Lieferansatz sofort in vielen zellbasierten Anwendungen als nützlich erweisen. Die hier angegebenen Protokollen arbeiten daran, dass diese Technologie zugänglich zu der Forschungsgemeinschaft ausgerichtet.

Protokoll

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Synthese

Anmerkung: dfTAT wird in zwei Schritten hergestellt: Synthese des Monomers fTAT durch Festphasenpeptidsynthese, gefolgt von einer Disulfidbindung Dimerisierung dfTAT bilden.

1. Quellen 500 mg Rink-Amid-MBHA-Harz in Dimethylformamid (DMF) in einem Standard-50 ml-SPPS-Gefß 1 Stunde.
2. Zuführen Fmoc-Abspaltung durch Inkubieren der Fmoc geschützten Harzes in einer 20% igen Piperidin-Lösung (20% Piperidin in DMF, 10 ml (0,30 mmol). Führen Entschützungsschritte zweimal (1 x 5 min und 1 x 15 min) mit einem Waschschritt mit DMF (der Waschschritt ein Spülen des Harzes mehrere Male mit einem Gesamtvolumen von etwa 150 ml DMF gelöst und das Lösungsmittel durch Vakuumfiltration) dazwischen Reaktionen.
3. Synthetisieren CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) auf der Rink-Amid-MBHA-Harz. Verwenden der folgenden Fmoc-geschützten Aminosäuren Fmoc-Lys (Mtt) -OH (nur am N-Terminus), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH und Fmoc-Cys (Trt) -OH. Die Reaktion _mit N 2 (20 psi), um die Reaktion zu rühren. Führen Sie alle Reaktionen bei RT.
   1. Führen Sie jede Aminosäure Kupplungsreaktion 4 Stunden. Für jede Kupplung Verwenden der Fmoc geschützten Aminosäure (1,2 mmol), N, N, N ', N' -Tetramethyl- O- (1-benzotriazol-1-yl) uroniumhexafluorphosphat (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ) und Diisopropylethylamin (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) in DMF gelöst. Nach 4 Stunden Kopplung, Waschen des Harzes mit DMF und führen Sie die Fmoc Entschützungsschritt, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
   2. Wiederholen, bis die lineare Peptidkette fTAT (Linear Peptidkette: CKRKKRRQRRRG kein TMR) synthetisiert.
   3. Dann waschen Harz gründlich mit ersten DMF und nach, dass mit Dichlormethan (DCM). Mit einem Gesamtvolumen von etwa 150 ml DMF oder DCM Spülen Sie den Harz mehrere Male und das Lösemittel durch Vakuumfiltration.
   4. Use MALDI-TOF, um zu bestätigen, dass das erhaltene Peptid hat das korrekte Molekulargewicht.
      1. Einen Matrixmischung durch Zugabe von 1 mg Matrix zu einer Lösung von 50 ul 0,01% TFA in Wasser-Lösung und 50 ul Acetonitril besteht.
      2. Um linearen Peptidkette Masse zu bestätigen, verwenden α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure. Führen Sie eine analytische HPLC des rohen Peptids und sammeln Sie 50 ul von der Oberseite des reinen Peak.
      3. Um die Probe vorzubereiten, um auf der MALDI Teller Teller: In 8 ul der Peptid bis 2 & mgr; l der Matrix-Lösung und auf den MALDI-Platte trocken oder auf einer 37 ° C Wärmeplatte in die Luft.
         Anmerkung: Arginin ist bekannt, dass eine Aminosäure schwierig Paar in SPPS sein. Erfolgreiche Kopplung durch Ausführen einer Kaiser-Test ¹⁴ (zB Ninhydrintest) etabliert. Dieser Test ermöglicht den Nachweis von freien Aminen, die auf dem Harz abgekoppelt bleiben könnten. Im Falle einer blauen Farbe festgestellt wird (Anzeichen für die Anwesenheit freier Amine), Kupplungs sTEPs werden wiederholt.
4. CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), spalten die Mtt-Schutzgruppe an der & egr; -Aminogruppe von Lys an CK (-NH-Mtt) TATG mit einer Lösung aus 1% Trifluoressigsäure (TFA) und 2% Triisopropylsilan zusammen (TIS) in DCM.
   1. Die Entfernung von MTT Schutzgruppe würde das Auftreten einer gelben Farbe führen, Inkubation des Harzes mit 20 ml der obigen Lösung für 5 min, wiederholen, bis keine gelbe Farbe beobachtet wird. Dazwischen das Harz mit DCM und DMF. Zusätzlich seit TIS ist ein Aasfresser, die die MTT abfangen würde, sobald keine gelbe Farbe erscheint in der Lösung in Gegenwart von MTT.
   2. Hinzufügen eines zusätzlichen Lösung mit 1% TFA in DCM (kein TIS) zu dem Harz keine MTT mehr versichern wird entfernt und die Lösung bleibt klar.
5. Lösen die drei Komponenten: Carboxytetramethylrhodamin (TMR), HBTU und DIEA (4, 3,9 und 10 Äquivalenz in Bezug auf die Menge des Harzes (in mg)) in DMF und diese Mischungzu dem Harz und die Reaktion O / N mit trockenem N _2, um Unruhe zu schaffen.
6. Nach der Fmoc-Entschützung und Aminosäure-Konjugation, das Harz mit DCM und trocknen lassen. Für eine vollständige Spaltung des Peptids von dem Harz, wird eine Lösung aus 92,5% TFA, 2,5% H _{2 O,} 2,5% TIS, 2,5% Ethandithiol (EDT) (Gesamtvolumen = 4 ml), um die Peptidyl-Harz für 3 h bei RT zur Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung vom Harz zu erzielen.
   1. Ausfällung der rohen Peptidprodukte mit kaltem wasserfreiem Ethylether (Et _{2 O)} durch Ablassen der Lösung aus Stufe 1.6 werden in 40 ml Et _{2 O,} drehen diese hinunter auf 4 ° C und 4.000 × g für 20 - 25 min. Wiederholen Sie diesen Schritt, um Waschen des Niederschlags mit kaltem wasserfreiem _Et 2 O ermöglichen
   2. Resuspendieren des Präzipitats in Wasser (5 ml, oder bis Niederschlag vollständig gelöst ist), und lyophilisiere. Dann resuspendieren in 0,1% wässriger TFA / Acetonitril erhaltenen Produkte.
7. Eine HPLC-Analyse mit einer analytischen C18-Säule (5 & mgr; m, 4 x 150 mm), um jedes Peptid zu analysieren. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min und Detektion bei 214 nm und 550 nm.
8. Zuführen semipräparative HPLC auf einer C18 10 x 250 mm-Säule zur Peptidreinigung. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml / min und Detektion bei 214 nm und 550 nm. Für alle Durchläufe verwenden linearen Gradienten von 0,1% wässriger TFA (Lösungsmittel A) und 90% Acetonitril, 9,9% Wasser und 0,1% TFA (Lösungsmittel B).
9. Bestätigen Sie die korrekte Identität der Peptide durch MALDI-TOF nach Herstellerprotokoll: fTAT, erwartete Masse: 2,041.17, beobachtete Masse: 2.040,66. DEAC-K9, erwartete Masse: 1,412.97, beobachtete Masse: 1,415.59. Verwenden ein α- Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Matrix für den MALDI-TOF.

2. Oxidation: dfTAT Erstellung

1. Belüften phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4 für 1 Stunde (mindestens 5 ml für die Reaktion weiter unten).
2. Löse fTAT (0,3 mg, 1,5 x ¹⁰ -4 mmol) in aerATED PBS pH 7,4 (5 ml). Sicherzustellen, dass der pH-Wert zwischen 7,0 bis 7,5 nach der Zugabe des Peptids. Wenn nicht Natriumhydroxid hinzufügen (1 M, in kleinen Schritten 1-5 ul), um den pH-Wert wieder auf 7,4 zu bringen.
3. Anmerkung: Sauerstoff, gelöst in PBS wirkt die Thiolgruppen auf fTAT oxidieren und eine Disulfidbindung bilden.
4. Nutiert die Reaktion O / N, damit sie bis zum Abschluß (100% Ausbeute, basierend auf HPLC-Analyse) zu reagieren. Man reinigt das Produkt mittels Umkehrphasen-HPLC und Massenspektrometrie (MALDI-TOF) analysiert, wie in Schritt 1.9. Erwartete Masse: 4,080.34, beobachtete Masse: 4,084.21.
5. Lyophilisiere reinen dfTAT (0,71 x10 ^-4 mmol) und resuspendieren in 200 ul Wasser (Konzentration reiner dfTAT = 356,3 & mgr; M).

3. Mess dfTAT Konzentration

1. Resuspendieren eines Aliquots des gereinigten dfTAT (typischerweise 1 & mgr; l in Abhängigkeit von der Menge an Peptid gereinigt) in einem 149 ul 50 mM TCEP Lösung.
2. Anmerkung: In diesem Schritt dfTAT in seine mo reduziertennomer Gegen fTAT um die Absorption Abschrecken, der aufgrund der großen Nähe des TMR-Fluorophor in dfTAT (der Extinktionskoeffizient ε der TMR in dfTAT wird im Vergleich zu der ε von TMR in reduzierter fTAT reduziert) zu eliminieren.
3. Die Probe wird für etwa 20 min reagieren (analytische HPLC kann verwendet werden, um die Bildung von fTAT bestätigen).
4. Hinzufügen all der Lösung auf die Quarzküvette und Messung der Absorption bei 556 nm.
5. Unter Verwendung des Beerschen Gesetzes (A = εcl: ε = 91.500 ^M -1 cm -1), um die Konzentration von fTAT berechnen, bestimmen die Konzentration von dfTAT, und teilen [fTAT] durch zwei.

4. Cellular Lieferung Experimente

1. Pflanzensamen, die Zellen (HeLa, HDF, etc.) In einer Schale auf einer Konfluenz von 80-90% (zB 8-Well-oder 24-Well-Schale). 90% Konfluenz in einer 37 ° C - wachsen Zellen in einem geeigneten Medium, bis 80 (zB DMEM mit 10% FBS und Pen / Strep ergänzt)befeuchteten Atmosphäre mit _5% CO 2.
2. Die Zellen werden dreimal (3x) mit PBS (durch Zugabe von 200 ul PBS und dann Entfernen dreimal).
3. Einen 5 uM Arbeitskonzentration von dfTAT durch in NRL-15 Medien Verdünnen einer Stamm der dfTAT (in Wasser) (für ein 8 gut austeilen das Gesamtvolumen sollte 200 ul sein). Eine Konzentration von 5 uM dfTAT führt zu effizienten Lieferung (hohe cytosolische Lieferung in über 90% der in einer Schale vorhanden Zellen) in den meisten auf dem neuesten Stand (Abbildung 3) getesteten Zelltypen. Jedoch können niedrigere oder höhere Konzentrationen für Zelltypen mit einem hohen oder niedrigen Neigung zum Eindringen mehr ausreichend sein.
   HINWEIS ÜBER DIE MEDIEN: NRL-15 ist für die Lieferung von dfTAT verwendet, da es nicht Cystein, das die Disulfidbindung in dfTAT reduzieren könnten. Jedoch zeigen unsere Daten, dass sowohl reguläre L-15 (mit Cystein) und DMEM kann als Abgabemedien verwendet werden. L-15 das Reduktions Aminosäure Cystein, aber Cystein presumab enthältly oxidiert in den Medien, um Cystin bilden (DMEM mit Cystin formuliert). dfTAT bleibt daher intakt in diesen Medien und Lieferwerk in der gleichen Effizienz wie die mit nrL15 erhalten.
4. Inkubieren Zellen mit dfTAT (5 & mgr; M) mit oder ohne Ladung (z. B. EGFP (10 & mgr; M)) und halten bei 37 ° C für 1 Stunde (Inkubationszeit reduziert, sondern dfTAT erfordert typischerweise etwa 30 bis 45 min, um die endosomale Leck induzieren ).
5. In L-15-Zellen zu waschen mit Heparin (1 mg / ml) (3 Waschungen werden empfohlen) zu dfTAT entfernen, um die Plasmamembran der Zellen gebunden wird.
6. Zellen mit Zell-undurchlässige Kernfärbung, Inkubation z. B. Sytox Blau, Sytox Green (2 uM in NRL-15), um zu bestimmen, ob die Plasmamembran der Zellen beeinträchtigt wird gemäß (toten Zellen, die während lebende Zellen werden nicht gefärbt werden) Protokoll des Herstellers.
7. Bildzellen mit einem Fluoreszenzmikroskop (100x Ölimmersion oder 20x-Objektiv). Bild dfTAT mit einem RFP-Filter (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm).
   Anmerkung: Die erfolgreiche Bereitstellung führt zu einer diffuse Fluoreszenz dfTAT gesamten Zelle (Beurteilung der Abgabe von Protein oder Peptid von Interesse wird auf Anwendung abhängt). Färbung von Nukleoli von fTAT (das reduzierte Produkt der dfTAT auf cytosolischen Eingabe) kann als Indiz dafür, dass die nachgewiesene Fluoreszenz intrazellulär verwendet werden. fTAT wird innerhalb weniger Stunden abgebaut. Zu diesem Zeitpunkt wird die Fluoreszenz der Abbaufragmente als punktförmige angezeigt. Dies ist nicht zu verwechseln für die punktförmige Verteilung, die auch zu sehen ist, wenn dfTAT bleibt erfolglos Inneren Endosomen gefangen (dies kann passieren, wenn dfTAT bei zu niedrigen Konzentration vorhanden ist) sein.

5. Controling Konzentration der MOI Lieferung

1. Identifizieren Sie die erforderlich ist, um eine effiziente Freisetzung von zytosolischen dfTAT in der verwendeten Zelltyp zu erreichen "optimale Lieferung" Konzentration. Führen Fluoreszenzmikroskopie auf Zellen mit increasin inkubiertg Konzentrationen dfTAT. Die optimale dfTAT Konzentration wird als die minimale Konzentration, die zum Löschen cytosolischen führt definierten "Diffus" TMR Fluoreszenz in etwa 100% der Zellen in einer Kultur.
2. Variiert die Konzentration des MOI in Coinkubation Protokoll verwendet, während die Konzentration von dfTAT Konstante (zB unter Verwendung von optimalen Lieferkonzentration dfTAT'S). Änderung der Inkubationszeit auf weniger als 1 Stunde könnte auch eine Option, um die Menge zu variieren MOI geliefert werden.

Ergebnisse

Um die Differenz zwischen fTAT und dfTAT beurteilen, werden HeLa-Zellen für 1 Stunde mit jedem Peptid inkubiert, um den Unterschied in ihrer zellulären Lokalisation zu bestimmen. Die Internalisierung der beiden CPP wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. 2 zeigt, dass fTAT (20 uM) lokalisiert in einem punktförmige Verteilung. Diese Verteilung steht im Einklang mit dem Peptid noch im Gerät befindliche Endosomen eingeschlossen. Im Gegensatz dazu das Fluoreszenzsignal dfTAT (5 uM) zeigt eine h...

Diskussion

Die zur dfTAT Lieferung verwendet wird, sollte nicht übermäßig sein konfluenten Zellen (> 90% Konfluenz), da dies die Abgabeeffizienz beeinflussen könnten. Die Zellen sollten auch gesund sein: toten Zellen in der Kultur kann apoptotischen Fragmente mit dem dfTAT können (zB DNA aus degradierten Kerne) interagieren, zu lösen. Dies wiederum kann mit der Lieferung Effizienz und die Qualität der Bildgebung stören. Zellen sollten gründlich gewaschen werden, um FBS zu entfernen, bevor dfTAT. BSA vorhanden ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin	Sigma	CAS 9041-08-1
SYTOX Blue	Invitrogen	S11348
SYTOX Green	Invitrogen	S7020
nrL15 L-15 (–) cysteine	Hyclone		Special order
Fmoc-protected Amino acids	Novabiochem
dfTAT			Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)
Biosafety Cabinet
Inverted epifluorescence microscope	Olympus	model IXB1	equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).
37 °C humidified, 5% CO2 incubator
Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis