在Micropost阵列方便，准确机械力分析

摘要

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

摘要

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

引言

机械性敏感基于细胞的测定允许调查粘附细胞，具有广泛的，反映了力学可以在细胞生物学发挥核心作用的应用程序。这些应用程序通常专注于推动亚细胞过程或全细胞行为的基本机制。一方面，外部环境因素，如细 ​​胞外基质组合物或基质硬度可显着地影响细胞的机械和生物反应^。1同样可以使用许多类的药物活性化合物的后观察到，其中，效果是常其特征在于使用细胞培养模型²另一方面基因型性能，例如那些引起自发或实验诱导的基因突变，可诱导了与细胞骨架结构和功能的改变相关的细胞表型的显着的变化^。3这些实施例短短数的许多可能的题目为哪些细胞机械表型是相关的，并且所有的这些都被有效地研究了micropost阵列。

在写这篇文章的时候，大约有200多篇已经发表了描述细胞micropost互动。这些作品讨论micropost偏转原理的理论问题，以及在其制造的实用说明。第一篇文章中描述的细胞和灵活micropost阵列的相互作用是出 ​​版的谈及其同事在2003年⁴相反经典牵引力显微镜（TFM），其中连续的软衬底被用于估计nanonewton规模细胞收缩，Tan等人。描述使用由有机硅弹性体的多个紧密隔开的垂直梁的方法。该技术的主要优势出现两个主要的功能。首先，为了改变小区表观基板刚度1只需要改变micropost尺寸，同时保持基板组合物，否则恒定，从而避免了在表面拓扑结构和化学的差异。第二microposts像可以与力和空间分辨率个别粘着斑的数量级上离散地分析，并且可以减少所固有的由标准的TFM类似分析的分析挑战个人弹簧。

今天的micropost阵列的应用范围大大超过了力量的只是少数单个细胞的映射。例如，秋山报告使用的分离的背脉管组织从一个蛾毛虫作为致动器的一个micropost阵列，为了开发一种昆虫肌肉供电自主微型机器人^。5

然而，microposts大部分发布的应用程序都集中在医疗条件，比如感染或癌症的研究。例如，micropost阵列已经用于研究力产生的奈瑟gonorrh捆绑IV型菌毛是与信号级联增强感染有关^。6其他已经使用microposts研究并靶向细胞骨架的药物化合物治疗乳腺癌细胞OEA菌落^。7

一个micropost的偏转采用经典梁理论常常被描述为与最终负载假设电池的悬臂只重视对micropost的最顶端。这里所施加的力 F引起的偏转δ取决于micropost的"抗弯刚性"k和由下式计算:

（1）

与E，I，和L是杨氏模量，转动惯量和梁的长度分别面积矩。然而，从这个公式的结果只能给力的，因为梁剪切加工和弯曲以及一般近似为底物变形者不被交流计数。考虑到microposts通常由从软材料如聚二甲基硅氧烷（PDMS）为基础的硅橡胶需要这些因素包括在内。 。舒恩等人证实，有这样的基础上micropost（L / D）和相应的聚合物的泊松比 V的纵横比的校正因子⁸它由下式给出。:

（2）

以 T _倾斜 （ⅴ）作为一个倾斜系数，其包括嵌合参数a = 1.3作为可以在同一篇文章中找到:

（3）

这意味着一个micropost的校正刚度ķ _压改正是纯弯曲刚度k = k _弯曲的产物和校正因子压改正计算公式如下:

（4）

因此，细胞力的计算应采用公式（1）的更精致的变化，现在读来进行:

（5）

修正的影响，只要是用于micropost尺寸典型值变得更为明显。例如，一个15微米长micropost具有圆形横截面，并且直径为5μm制成的基于PDMS的硅橡胶导致0.77的校正因子，因此，未校正的计算将23％高估施加的细胞的力。这变得更加严重为microposts具有较小的纵横比。

传统上，micropost图像分析也基于理想化的梁弯曲理论。在2005年率先使用MICR的组OPOST阵列出版适合micropost分析的图像分析软件^9所述的软件需要软件许可证及用户必须采取三种图像的每个位置。分别来自micropost的顶部和底部的平面中的传输模式，另一种在荧光模式与染色的细胞。比较所述顶部和底部的位置为每个后micropost的软件确定的力矢量场，并计算相关的参数，如每交力。其它软件包存在，他们的分析原则在描述它们的相应条款简要地提到，但这些分析软件包通常是不公开的^。10,11

设计用于映射细胞力的micropost阵列可分类为在正交micropost布局或六边形的，后者具有的所有邻居microposts之间等距的间隙的优点是。典型microposts公顷已经圆形截面和它们的尺寸范围从1.0微米至10微米的直径和2到50微米，长度⁴然而，microposts与椭圆形或正方形的横截面也有报道^。12,13

使用基于PDMS的硅氧烷混合物作为micropost材料允许用于将纳米颗粒引入该混合物中。例如添加钴纳米棒使micropost的磁性活化，从而提供了潜在的实验设计的另一个自由度^。14大部分组上产生平的刚性基板像盖玻璃或培养皿内其micropost阵列。然而，Mann和同事最近报道上形成可拉伸膜一个micropost阵列¹⁵这允许在研究活细胞的亚细胞动态响应在细胞收缩的术语细胞拉伸力到贴壁细胞的应用。

目前广泛使用的，最ESTAB用于制造micropost阵列lished过程中Sniadecki和同事^。16-18的见地协议总之标准洁净室处理中描述被用于产生关于使用SU8光致抗蚀剂的硅晶片的顶部的微结构是基于软光刻。这之后是复制方法，其中在硅橡胶被浇铸在将它们转移到模具中的结构。在第二步骤中这些模具被用于复制使用的硅橡胶上的选择的衬底顶部的初始显微结构。然而，尽管大，越来越多的与他们申请公开，建立一个制造过程microposts的花费相当长的时间，即使对微工程专家;存在需要优化和适应特定实验室环境和micropost布局，得到可接受的质量水平的许多工艺步骤。

商业micropost阵列现已就绪-T邻的使用（"现成的架子"）格式具有一贯的高品质。因此，它们是替代所需的现场制作的复杂和冗长的制造工艺。本文的市售micropost阵列用于使用单明场显微术图像映射蜂窝力。更重要的是本文介绍和文件名为MechProfiler一个全功能的开源软件，可以下载作为补充材料，这份手稿。该软件的一个比较活跃的版本也可以在http://www.orthobiomech.ethz.ch找到。

一个"关闭的，现成的"检测和兼容的开源分析软件相结合，显着降低了进入障碍，以实现精确的TFM实验。研究人员无法获得任何无尘室设备或软件开发专业知识成功地分析细胞的力量。它使用户能够集中于mechanosensitivity分析输出，而不是技术本身，使之能够为更广泛的社区牵引力测量。此外，这是对铺平阵列micropost全自动筛选的方式迈出的重要一步。

该MechProfiler分析软件处理的文件格式TIFF，PNG，BMP和JPG图片。这些图像可以用荧光，相衬或明视场光学显微镜拍摄。该独立程序与游离Matlab的编译器运行时（见: 图12）一起运行，并底层算法允许简化图像处理，从而使用户能够处理具有单个或多个细胞的图像中约1分钟。此外，这些细胞既可以活的或"固定"。

该MechProfiler软件能够通过靠质量商业micropost阵列的再现性，大大提高了数据吞吐量分析，更具体地，默认＆＃8220;非偏转"的阵列中的每个交位置可以推定针对理想格（制造偏差为网格在用于该研究的阵列均小于100纳米）。

在短的一个打开选择的用于分析的图像文件，它们作物到感兴趣的区域中，定义覆盖细胞的职位或需要被丢弃，确定后的位置，计算该挠度/对理想格力，最后节省出口有可能所有的细胞特异性的数据，其中包括一个标准的办公电子表格。

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研究方案

在Micropost阵列1.培养细胞

注意:所有步骤必须在生物安全柜中进行，以确保无菌。这里给出的容积为T25细胞培养瓶。细胞培养基配方和细胞接种密度为骨癌细胞系HuO9和M132优化。

1. 准备播种的细胞培养到micropost阵列。
   1. 通过将培养瓶在标准光学显微镜下检查细胞培养质量。确保细胞显示出典型的生长和形态通过估计如何培养瓶底部的许多被覆盖。 70％-80％A覆盖率反映了健康的增长速度。因为它们代表死细胞和/或一个杂草丛生培养注意漂浮细胞的量。
   2. Trypsinize细胞通过除去介质和洗涤用4ml 1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液中。添加0.8 ml的1×胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）和在室温下孵育，直到电池小号打跑，大约需要2-4分钟。检查过程与显微镜，偶尔挖掘瓶轻轻地支持撞出。
   3. 加入5 ml的细胞培养液（Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）/ F12，用10％胎牛血清（FBS），1％青霉素/链霉（青霉素/链霉素）），使反应停止，并以洗掉残留细胞仍然坐在瓶的底部。接着吸取此悬浮上下数次以获得均匀的混合物。一定要吸取横跨烧瓶的原始生长区域中的所有解决方案以获得一个有效的松脱。
   4. 在细胞悬液转移到15毫升管中，用台式离心机以0.5×g离心3分钟离心它。
   5. 除去上清液并且通过移液器上下吹吸5次再悬浮在5ml培养基中的细胞沉淀。请一定要避免泡沫的产生，而这样做。
   6. 通过使用细胞计数室和一个光microsco确定细胞密度PE。检查细胞聚集体的细胞悬浮液中细胞计数室和确保仅具有单个细胞用于后续实验。吸管再次上下数次，如果细胞倾向于形成聚集体将它们分开。
   7. 稀释细胞悬浮液以足够的介质获得的25000个细胞/ ml的细胞液。颠倒封闭管数次拌匀。
2. 准备micropost阵列细胞种植。
   关键注意:不要吸取到micropost阵列直接，因为这可能会损害microposts，尤其是当不想要的泡沫进行了介绍。此外，请确保micropost阵列永不干涸的发生毛细作用力导致崩溃的microposts的。
   1. 放置与micropost阵列玻璃衬底面朝上在12孔板的孔中通过使用一对镊子的，并通过添加1毫升乙醇中（99％）湿它。在室温下孵育20-30秒。
   2. 稀释乙醇逐步通过在井侧加入约1毫升无菌去离子水（DI水）和吸移用移液管或抽吸设备大致1毫升重复此步骤，至少3次。
   3. 通过添加和吸移约1 ml的取代离子水用PBS缓冲液中相同的方式。重复此步骤3次。
   4. 通过添加和吸约为1毫升培养基替换PBS缓冲带中。重复此步骤3次。
3. 在每个制备的micropost阵列的顶端吸移管1 ml的细胞液（25,000个细胞）。靠近多孔板，并将其转移到恒温箱（CO _{2 5％，37℃）。}让细胞粘附和生长在microposts为6-7小时之上。
4. 通过使用光显微镜偶尔检查的粘附过程。检查大部分细胞出现全面铺开多个microposts。

2.固定和染色细胞

注意:所有的步骤，并这里给出容积为12孔板的单个孔。建议处理不多十二井超过四个在一个时间，以避免一个晒出孔中的任何液体，这将导致在microposts的崩溃后吸出。

1. 从井抽吸介质和洗涤细胞2×1毫升的PBS缓冲液。确保使用温和的力量，同时用PBS洗涤以去除累积的孵化过程中micropost阵列上的细胞碎片和分离死细胞。
2. 固定细胞以5分钟0.5 ml的3.7％缓冲的甲醛溶液。
3. 通过洗涤micropost阵列2×1毫升无菌DI水代替甲醛溶液。
4. 染色（在50％的水，40％乙醇和10％乙酸0.05％考马斯亮蓝）将细胞与染料为约90秒。洗净多余染色液过2次用1毫升无菌去离子水。加入1毫升去离子水至micropost阵列。
5. 使用光学显微镜检查染色的结果。重复吨HE染色步骤，如果单元格的身体太微弱待观察。
6. 商店micropost阵列染色细胞之上的冰箱中在4℃下。确保让他们在水下时刻。

3.细胞成像

注:第4步仅适用于显微镜没有无限校正光学系统。

1. 加2ml去离子水至培养皿用薄玻璃底，高分辨率成像。
2. 用一对镊子到成像盘与microposts朝上传送micropost阵列。
3. 放置在成像培养皿上的光学显微镜的可移动的阶段。
4. 转用于成像的透镜的补偿环，直到在标尺上的数字表示沿着光路的所有材料的总厚度，以补偿在玻璃基板上，有机硅弹性体和顶部的液体的折射率的不匹配。这将导致一个明亮的外观的microposts的核心。
5. 关闭光圈在照明侧下降到50％，并从光路在允许一个普通明视场模式除去任何相衬环。
6. 对齐micropost阵列的microposts形成一条水平线的观察视野。确定起点（ 如左上角），移动培养皿逐步在舞台上扫描micropost阵列同时服用大量的图像。
7. 以最高的分辨率设置使用20X或40X的目标相机中的所有图像。希望能发展为在图像的中心的单细胞。
8. 通过基板沿z轴扫直到micropost提示是聚焦。使用显微镜的微调调焦轮，使之朝着注重micropost底部约2-3微米。
9. 通过采取一系列一个阵列部通过摄像参数之一清扫测试图像在一个时间（建立标准成像过程例如，曝光时间，光圈设置，灯设置等）。与MechProfiler分析图像并确定一个快速和可靠的分析的合适的参数组。

与开放源代码软件"MechProfiler"4.图像分析

注意:所有软件功能可与使用鼠标左键指点设备被激活。然而，受过训练的操作将使用设计为在键盘上，以使一个有效的两手的图像处理的左半边的记录快捷键。

1. 启动图像分析软件MechProfiler并打开一个范围，需要通过点击"打开"被分析的图像。
2. 将所有参数到由软件开发商提供的"设置"部分。确定必须根据由软件手册中详细描述的程序进行自定义配置（即，轮廓阈值和最小距离）的参数。
3. 分析图像■一个接一个通过使用"剪裁"他们种植到感兴趣的区域（单击并拖动鼠标按钮按下）。双击绘制的矩形内完成这个动作。
4. 通过点击"画细胞轮廓"，使用十字光标绘制包括细胞附着到所有microposts标记每个可见细胞轮廓一个接酮。
5. 通过点击"放弃帖子"放弃任何不必要的microposts并使用十字光标绘制。括属于一个单元的图象部分以外的或者被偏转因其他理由而不是由所关注的小区中的所有microposts。
6. 启动软件子程序"查找质心"通过鼠标点击。调整过滤器设置旁边的"查找质心"按钮，直到所有microposts注册，这是可见的红叉的中心。如果过滤器的设置过低microposts将被忽略，如果它太高亩ltiple职位将被标记为一个单一的micropost。保持过滤器的分析会话期间设置不变。
7. 使用手动编辑功能"手动编辑"的质心与多个或遗漏micropost位置。使用鼠标十字通过单击并拖动整个选择有问题的micropost。双击矩形内，并将丢失的红色标记放大的图像部分，它会自动关闭研究。放弃这样的micropost如果是绘制细胞外轮廓（见步骤4.5），然后再继续。
8. 找到理想的micropost电网用鼠标点击激活"生成网格"功能。确保位置对应的真实micropost头，用蓝色圈所示，绘制细胞轮廓内。
9. 更正其中使用相应的"曼努埃尔编辑"功能，用鼠标点击所需要的细胞区域内的任何错位的电网设施。使用十字来选择曲的micropostestion通过点击和拖动它跨越。双击出现的矩形内，并将丢失的蓝色标记的放大图像部分，它会自动关闭研究。
10. 使用按钮"计算挠度"通过鼠标点击来获得基于所述图像段中的micropost的位置和产生的理想电网之间的差计算出的偏转值的直方图。
11. 保存完整的分析，包括价值观，通过鼠标点击"保存"的表。
12. 通过点击"重置视图"和分析"下一步形象"，它可以方便地使用正确的键盘光标键来完成另一个图像部分或鼠标点击继续图像分析。

5.数据分析 - Mechanoprofiling

1. 从与所分析的图像文件夹中的Office电子表格程序打开文件"results.xls"。它包含了人的数据计算L值，包括所有micropost偏转和标准衍生的措施，如工作（ 即基底变形能量）的分析单元。

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结果

所描述的技术的主要优点在于它的简单性和潜在的快速和有效地纳入常规实验室工作。搭配开源软件的高品质的商业传感器阵列的组合提供了否则将需要获得洁净室设施和深入的图像分析和软件开发知识机械力敏感的信息。 图1说明了该方法的工作流程。它开始准备和种子细胞到micropost阵列。固定和染色细胞后的micropost阵列准备成像。该技术的核心部分是一个使用MechProfiler软件的图像...

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讨论

这项工作旨在通过大幅降低技术和实用的准入门槛，以推进牵引力显微镜领域。这些障碍来自两个方面。首先是必须克服可重复地制造和实验委托micropost阵列的许多非平凡的技术挑战。第二，是同样的非平凡需要单个细胞的力的可靠半自动分析 - 牢记典型的实验中，可能需要几百甚至几千个细胞的分析。上述技术被开发，以使不具有驻地工程专门细胞生物学实验室内micropost基于牵引力显微镜访问?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera