Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Özet

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Özet

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Giriş

Mekanik-duyarlı hücre bazlı deneyler mekaniği hücre biyolojisi oynayabileceği role yansıtan geniş bir uygulama yelpazesi ile, yapışık hücrelerin araştırmak için izin verir. Bu uygulamalar genellikle hücre içi süreçleri ya da tam hücreli davranışını sürücü altında yatan mekanizmalar odaklanın. Bir yandan, bu tür ekstra hücresel matris bileşiminin ya da matris sertlik gibi dış çevre faktörleri önemli ölçüde bir hücrenin mekanik ve biyolojik tepkiyi etkiler. ^1, aynı farmasötik olarak aktif bileşiklerin çoğu sınıflarının kullanımından sonra gözlenebilir, etkileri olan vardır genellikle hücre kültür modelleri kullanılarak karakterize edilmiştir. ² tür iskeleti yapısı ve fonksiyonu değişiklikler ile ilişkili hücre fenotipi işaretli değişiklikleri uyarabilir spontan veya deneysel genetik mutasyonların neden olduğu gibi diğer taraftan genotipik özellikleri üzerinde. ³ Bu örnekler vardır Birçok olası birkaçkonular hangi hücrelerin mekanik fenotiplendirilmesi ilgili olduğunu ve tüm bu yararlı micropost dizileri ile incelenmiştir.

Bu yazının yazıldığı, yaklaşık 200 makaleler hücre micropost etkileşimini anlatan yayınlanmıştır. Bu eserler micropost saptırma ilkeleri teorik yönlerini yanı sıra kendi imalatı pratik talimatlar tartışmak. Hücreler ve esnek micropost dizilerin etkileşimini anlatan ilk makale, sürekli yumuşak yüzeylerde Tan ve ark nanonewton ölçekli hücre kasılma, tahmin etmek için kullanılır, klasik çekme kuvvet mikroskobu (TFM) aksine 2003. ^4'te Tan ve arkadaşları tarafından yayımlandı. silikon elastomerden yapılmış çok yakın aralıklı dikey kirişler kullanılarak bir yöntem açıklamıştır. Bu tekniğin başlıca avantajları, iki ana özelliklerinden ortaya çıkmaktadır. Tutarken İlk hücre görünür substrat sertliği değiştirmek için yalnızca tek bir micropost boyutlarını değiştirmek gerekiyorAksi takdirde sürekli ve böylece yüzey topoloji ve kimya farklılıkları kaçınarak substrat bileşimi. İkinci microposts discretely bireysel odak yapışıklıklar sırasına kuvvet ve mekansal kararları ile analiz edilebilir ve standart TFM tarafından benzer analizler doğasında olan analitik zorlukları azaltabilir bireysel yaylar gibi hareket ederler.

Bugün micropost dizileri için uygulama aralığı büyük ölçüde birkaç tek hücreler için kuvvetlerin sadece haritalama aşıyor. Örneğin, Akiyama bir böcek kas gücünü bağımsız mikro robot geliştirmek amacıyla, bir micropost dizisi için bir harekete geçirici olarak güve tırtıl bir izole dorsal damar dokusu kullanımını bildirir. ⁵

Bununla birlikte, microposts en yayınlanmış başvurular enfeksiyon ya da kanser gibi tıbbi durumların çalışmalara yoğunlaşmıştır. Örneğin, micropost diziler Neisseria gonorrh ve paketlenmiş tip IV pili kuvvet nesil incelemek için kullanılmıştır. Sinyal kaskadları enfeksiyon artırılması ile ilişkili ⁶ Diğerleri hücre iskeleti hedefleyen ilaç bileşikleri ile tedavi meme kanseri hücrelerini incelemek için microposts kullandık OEA kolonileri. ⁷

Bir micropost sapması genellikle hücrenin varsayarak bir uç yük ile bir konsol için klasik ışın teorisi kullanılarak tarif edilir ancak micropost çok uç takılır. Bir saptırma ö neden İşte uygulanan kuvvet F micropost yönettiği "bükülme sertliği" k bağlıdır ve hesaplanır:

(1)

E, I, L ve varlık Young modülü, sırasıyla atalet ve kiriş uzunluğunun alan anı ile. Alt tabaka eğilmesi ac alınmadığı Ancak, bu denklemden sonuçlar sadece ışın kesme beri iş ve hem de eğilme kuvvetlerin genel yaklaşım vermeksaymak. Microposts tipik polidimetilsiloksan (PDMS) gibi yumuşak malzemelerden yapılmış olması dikkate alındığında bu faktörlerin dahil edilmesi gereken silikon kauçuk tabanlı. . Schoen ve arkadaşları micropost (L / D) ve karşılık gelen polimerin Poisson Oranı v oranına göre bir düzeltme faktörü olduğunu göstermiştir ⁸ O ile verilir.:

(2)

T _eğim (v) aynı maddede bulunabilir gibi uydurma parametre a = 1.3 içeren bir devirme katsayısı olma ile:

(3)

Bu bir micropost en düzeltilmiş sertlik k _corr saf eğilme sertliği k = k _viraj ürün ve düzeltme faktörü corr demektirtarafından verilen:

(4)

Bu nedenle, hücre kuvvet hesaplamaları şimdi okuma denklem (1) daha rafine varyasyon kullanılarak yapılmalıdır:

(5)

Düzeltme etkisi kısa sürede micropost boyutları için tipik değerler kullanılır gibi daha belirgin hale gelir. Örneğin, dairesel bir kesite ve PDMS bazlı silikon lastikten yapılmış 5 um'lik bir çapa sahip bir 15-mikronluk bir uzun micropost 0.77 bir düzeltme faktörü yol açar ve bu nedenle, düzeltilmemiş hesaplama% 23 tarafından uygulanan kuvvetleri hücre olduğundan fazla olacaktır. Bu daha şiddetli küçük boy oranları ile microposts için olur.

Geleneksel olarak, micropost görüntü analizi de idealize kiriş eğilme kuramına dayalı olmuştur. 2005 yılında MICR kullanımına öncülük grupOPOST diziler micropost analizi için uygun bir görüntü analiz yazılımı yayınlanan ⁹ yazılımı yazılım lisans gerektirir ve kullanıcı her pozisyon için üç görüntüleri almak zorundadır.; iletim modu ve lekeli hücre floresan modunda başka biri micropost üst ve alt uçakları birer. Her biri için üst ve alt pozisyonları karşılaştırarak sonra yazılım bir kuvvet vektör alanı belirler ve yazı başına kuvvet gibi ilgili parametreleri hesaplar micropost. Diğer yazılım paketleri var ve bunların analizleri prensipleri kısaca bunları açıklamak gelen maddelerde belirtilen, ancak bu analitik yazılım paketleri genellikle kamuya açık değildir. ^10,11

Eşleme hücre kuvvetleri için tasarlanmış micropost dizileri tüm komşu microposts arasında eşit mesafeli boşlukların avantajına sahip olan ikinci bir ortogonal micropost düzeni veya altıgen biri olmak ya da sınıflandırılabilir. Tipik microposts habir dairesel geçiş kısmına ziyaretinde ve boyutları oval ya da kare kesitli microposts de rapor edilmiştir, ancak uzunluğu 50 um ila 1,0 um çapında 10 um ve 2. ⁴ arasında değişir. ^12,13

Micropost malzemesi olarak PDMS bazlı silikon karışımlarının kullanılması karışımı içine nano-tanecikleri ilave sağlar. Kobalt nano çubuklar ekleyerek Örneğin micropost bir manyetik aktivasyon sağlayan ve böylece potansiyel deneysel tasarımlar özgürlük başka derecesini verir. ¹⁴ Çoğu grup kapak cam gibi veya Petri kabı içinde düz sert yüzeylerde kendi micropost dizileri üretmek. Bununla birlikte, Mann ve arkadaşları son bir gerilebilir zar üzerinde oluşturulmuş bir dizi micropost bildirmiştir. ^15, hücre kontraktilite açısından canlı hücre sub-hücresel dinamik yanıtları okurken bu yapışık hücreler hücre germe güçlerine uygulanmasını da mümkün kılar.

Yaygın olarak kullanılan ve çoğu estabSU8 fotorezist ile bir silikon gofret üstüne mikro üretmek için kullanılan temiz oda, kısa, standart işlemlerde SNIADECKI ve ark. ^16-18 arasında derinlemesine protokoller de tarif edildiği gibi micropost dizileri yapmak için yayımlanır işlemi, yumuşak litografi dayanmaktadır. Bu silikon kauçuk kalıplara aktarılması yapılar üzerinde döküm edildiği bir kopyalama işlemi ile takip edilir. İkinci bir aşamada, bu kalıplar, seçilen bir alt-tabaka üzerine bir silikon kauçuğun kullanımım başlangıç ​​mikro çoğaltmak için kullanılır. Ancak microposts için bir üretim sürecini kuran kendi uygulamasıyla ilgili yayınlar, büyük ve artan sayıda rağmen mikro mühendislik uzmanları için bile zaman önemli miktarda alır; kabul edilebilir bir kalite düzeyini elde etmek için belirli laboratuar ortamında ve micropost düzeni optimizasyon ve adaptasyon gerektiren birçok işlem basamakları vardır.

Ticari micropost dizileri hazır t artık mevcutsürekli yüksek kalite ile o-kullanım ("off-the-raf") biçimi. Bu nedenle onlar bünyesinde üretimi için gerekli olan karmaşık ve uzun üretim sürecinin bir alternatiftir. Bu yazıda, bir ticari olarak temin edilebilir micropost dizisi, tek bir aydınlık alan mikroskopi görüntü kullanılarak selüler kuvvetleri haritasını hazırlamak için kullanıldı. Daha da önemlisi, bu makalede açıklanan ve bu yazının tamamlayıcı malzeme olarak yüklenebilir MechProfiler adında bir tam fonksiyonlu açık kaynak yazılımlar, belgelemektedir. Yazılımın bir aktif tutulan versiyonu da http://www.orthobiomech.ethz.ch adresinde bulunabilir.

Bir "off-the-raf" tahlil ve uyumlu bir açık kaynak analiz yazılımı kombinasyonu belirgin doğru TFM deneyler gerçekleştirmek için giriş engel düşürür. Temiz oda tesisleri veya yazılım geliştirme uzmanlığı ya erişimi olmayan araştırmacılar başarıyla hücresel güçleri analiz edebilirsiniz. Bu mechanos odaklanmak için bir kullanıcı sağlayanensitivity tahlil çıktı ziyade teknoloji kendisi ve daha geniş bir topluluk için kullanılabilir çekiş gücü ölçümleri yapar. Ayrıca, bu micropost diziler tam otomatik tarama doğru yolunu açmak için önemli bir adımdır.

MechProfiler analiz yazılımı dosya biçimi tiff, png, bmp ve jpg görüntüleri işler. Görüntüler floresan, faz kontrast ya da parlak alan ışık mikroskobu kullanılarak alınabilir. Başına bir program (mevcut: Şekil 12) ücretsiz Matlab Derleyici Runtime ile birlikte çalışır ve temel algoritmaları yaklaşık 1 dakika içinde tek veya birden fazla hücreleri ile görüntüleri işlemek için kullanıcı sağlayan aerodinamik görüntü işleme, izin verir. Ayrıca, bu hücreler ya yaşayan olabilir ya da "sabit".

MechProfiler yazılım ölçüde kaliteli ticari micropost diziler tekrarlanabilirlik dayanarak veri analizi verimini artırmak mümkün, daha spesifik olarak, varsayılan & #8220 non-deflected "dizisindeki her yazının konumunu ideal ızgara karşı kabul edilebilir (bu çalışmada kullanılan dizilerde ızgara imalat sapmalar az 100 nm idi).

Kısacası birinde, ilgilenilen bölgeye onları ekinler, analiz için görüntü dosyaları bir seçim açar hücreler tarafından kapsanan mesajları tanımlar veya atılması gereken sonrası pozisyonları belirler deplasmanlar / İdeal ızgara karşı güçlerini hesaplar ve nihayet Standart ofis-tabloya dahil, ihracat için bir olasılık tüm hücre özel verileri kaydeder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Micropost Dizileri 1. Kültürleme Hücreler

Not: Tüm adımlar sterilite sağlamak için bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır. Burada verilen miktarlar T25 hücre kültürü şişeleri içindir. Hücre kültürü ortamı tarifi ve hücre tohum yoğunluğu, kemik kanseri hücre çizgileri HuO9 ve M132 için optimize edilmiştir.

1. Bir micropost dizisi üzerine tohumlama için hücre kültürü hazırlayın.
   1. Standart ışık mikroskobu kültür şişesi koyarak hücre kültürü kalitesini kontrol edin. Hücreler kaplıdır ne kadar kültür şişesi alt tahminine göre tipik bir büyüme ve morfoloji göstermektedir emin olun. % 70 -80% A kapsama sağlıklı bir büyüme oranını yansıtır. Onlar ölü hücreleri ve / veya büyümüş kültürünü temsil olarak hücrelerin yüzen miktarına dikkat edin.
   2. 4 mi 1x Fosfat ile orta ve yıkama kaldırarak Hücreleri tripsinize edin salin (PBS) tampon tamponlu. Hücre kadar oda sıcaklığında 0,8 ml 1 x tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilave edin ve inkübeyaklaşık 2-4 dakika sürer s sökülmüş. Mikroskop ile süreci kontrol ve bazen yerinden oynatmamaya desteklemek için hafifçe şişeyi hafifçe vurun.
   3. 5 ml hücre kültür ortamı (Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM)% 10 cenin sığır serumu (FBS ile / F12),% 1 penisilin / streptavidin (Pen / Strep)), reaksiyonu durdurmak için hala oturup bakiye hücrelerini yıkamak için ekleme balona en altta. Daha sonra homojen bir karışım elde etmek için yukarı ve aşağı birkaç kez bu süspansiyonu pipetle. Etkili bir yerinden oynatmamaya kazanmak için balonun orijinal büyüme alanı boyunca tüm çözümler pipetle emin olun.
   4. 15 ml'lik bir tüpe, hücre süspansiyonu aktarın ve 3 dakika boyunca 0,5 x g'de bir masa üstü santrifüj kullanılarak da santrifüj.
   5. Süpernatantı ve yukarı pipetleme ve 5 kat aşağı 5 ml ortamda hücre pelet yeniden askıya. Bunu yaparken kabarcıklarının oluşumunu önlemek için emin olun.
   6. Bir hücre sayımı odacığı ve bir ışık mikroskobik kullanılarak hücre yoğunluğu belirlemekpe. Hücre agrega için hücre sayım odasında hücre süspansiyonu kontrol ve sonraki deney için tek tek hücrelere sahip sağlamak. Pipet hücreleri onları ayırmak için agrega oluşturmak üzere tekrar ve birkaç kez aşağı eğilimi varsa.
   7. 25.000 hücre / ml hücre solüsyonu elde etmek için yeterli bir ortam maddesi ile bir hücre süspansiyonu ile seyreltilir. Kapalı tüpü birkaç kez ters yüz edilerek iyice karıştırın.
2. Hücre tohumlama için micropost dizisi hazırlayın.
   Kritik Not: Bu potansiyel microposts zarar verebilecek doğrudan gibi istenmeyen kabarcıklar tanıtıldı, özellikle micropost dizisi üzerine pipetle etmeyin. Ayrıca, micropost dizisi asla kılcal kuvvetler microposts çöken yol olarak oluşan kurur emin olun.
   1. Bir çift cımbız kullanarak bir 12 oyuklu plaka iyi yüzü yukarı bakacak şekilde ve 1 ml etanol (% 99) eklenmesi ile ıslatın micropost dizisi ile cam substratın yerleştirin. 20-30 saniye boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   2. Etanol seyreltinde tarafında yaklaşık 1 ml steril deiyonize su (DI su) ilave edilmesi ve bir transfer pipeti veya aspirasyon cihazı kullanılarak yaklaşık olarak 1 ml aspire aşamalı olarak gerçekleştirilebilir. Bu adımı en az 3 kez tekrarlayın.
   3. Ekleme ve yaklaşık olarak 1 ml aspire aynı şekilde PBS-tamponu ile DI-su değiştirin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
   4. Ekleme ve yaklaşık ortam 1 ml aspire ortam ile PBS-tampon değiştirin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
3. Hazırlanan her micropost dizinin üstünde pipetle 1 ml hücre solüsyonu (25.000 hücre). Çok-yuvalı plaka yakın ve bir kuluçka transfer (CO ₂ 5%, 37 ° C). Hücreler yapışır ve 6 -7 saat microposts üstünde büyümek edelim.
4. Bir ışık, bir mikroskop kullanarak bazen yapışma sürecini inceleyin. Hücrelerin en Birden microposts yayılmış görünür olduğunu kontrol edin.

2. Tespit ve Boyama Hücreleri

Not: Tüm adımları veBurada verilen miktarlar 12-çukurlu bir plaka tek bir oyuk içindir. Bu microposts çökmesi ile sonuçlanır herhangi bir sıvı, bir aspirasyon sonra kuyuların Bir kurumasını önlemek için bir seferde on iki kuyu dörtten fazla işleme sokulması tavsiye edilmektedir.

1. Kuyudan aspire orta ve yıkama hücreler 1 ml PBS tamponu ile 2x. Inkübasyon sırasında micropost dizisi üzerinde biriken hücre debrisini uzaklaştırmak için ve ölü hücreleri ayırmak için PBS ile yıkama sırasında hafif bir kuvvet uygulamak için emin olun.
2. 5 dakika boyunca 0.5 ml% 3.7 tamponlu formaldehit solüsyonu ile hücrelerin sabitleyin.
3. 1 ml steril DI su ile micropost dizi 2x yıkayarak formaldehit çözüm değiştirin.
4. Yaklaşık 90 sn için (% 50 su,% 40 etanol ve% 10 asetik asit içinde% 0.05 Coomassie Brilliant Blue) boya ile hücrelerin Leke. 1 ml steril DI su ile 2x kapalı aşırı boyama çözüm yıkayın. Dizi micropost 1 ml distile su ekleyin.
5. Bir ışık mikroskobu kullanılarak boyama sonucu kontrol edin. Tekrarlama tHücre gövdesi görüntülenmiştir çok sönük ise o adımı boyanarak.
6. 4 ° C 'de bir buzdolabında üzerine boyanan hücreler ile mağazası micropost dizileri. Her zaman su altında tutmak için emin olun.

3. Hücre Görüntüleme

Not: Adım 4 sadece sonsuzluk düzeltilmiş optik olmadan mikroskoplar için de geçerlidir.

1. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ince bir cam alt kısma sahip bir Petri kabı, 2 ml DI-su ilave edilir.
2. Microposts yukarı bakacak şekilde görüntüleme çanak içine bir cımbız kullanarak micropost dizi aktarın.
3. Işık mikroskobu bir hareketli sahnede görüntüleme Petri kabı yerleştirin.
4. Ölçekte sayı cam alt tabaka, silikon elastomer ve üstünde sıvı kırılma indeksleri uyumsuzluğu telafi etmek için optik yol boyunca tüm malzemelerin toplam kalınlığı temsil dek görüntüleme için kullanılan lensin tazminat halkasını çevirin. Bu microposts parlak bir görünüm gitmelidirçekirdekler.
5. Aşağı% 50 aydınlatma tarafında iris kapatın ve sıradan bir parlak alan modu sağlayan optik yol herhangi bir faz kontrast halkaları çıkartın.
6. Microposts gözlem tarlada yatay bir çizgi oluşturacak micropost dizi aynı hizaya getirin. Bir başlangıç ​​noktası (örneğin, sol üst) tanımlar ve sayısız görüntüleri çekerken micropost dizisi tarayarak sahne üzerinde Petri kabı adım adım hareket ettirin.
7. 20X veya 40X objektif kullanarak kamera için en yüksek çözünürlük ayarı ile tüm görüntüleri çekin. Görüntünün merkezinde tek bir hücreyi hedefliyoruz.
8. Micropost ipuçları odak kadar madde boyunca z ekseni boyunca hareket ettirin. Mikroskop ince ayar odak tekerleğini kullanın ve yaklaşık 2-3 um için micropost alt odaklanarak doğru çevirin.
9. (Bir seferde görüntüleme parametreleri tek doğru süpürme tek dizi bölümünün test görüntülerinin serisini alarak standart bir görüntüleme prosedürü oluşturulması, örneğin, maruz kalma süresi,iris ayarı, lamba ayarları vb.) MechProfiler görüntüleri analiz ve hızlı ve güvenilir bir analiz için uygun bir parametre setini belirler.

Açık Kaynak Yazılım "MechProfiler" 4. Görüntü Analizi

Not: Tüm yazılım fonksiyonları sol fare düğmesini kullanarak bir işaretleme cihazı ile aktif hale getirilebilir. Ancak, eğitimli operatör verimli iki elle görüntü işleme etkinleştirmek için klavyenin sol yarısında olacak şekilde tasarlanmıştır belgelenmiş kısayol tuşlarını kullanabilirsiniz olacaktır.

1. Görüntü analiz yazılımı MechProfiler başlatın ve "Aç" tıklayarak analiz edilmesi gerekir görüntülerin bir dizi açın.
2. Yazılım geliştiricisi tarafından verilen "Ayarlar" bölümüne tüm parametreleri yerleştirin. Özel yazılım el kitabında ayrıntılı olarak tarif edilen prosedürlere göre (örneğin, kontur eşiği ve minimal mesafe) yapılandırılmalıdır parametreleri belirleyin.
3. Görüntüyü analizs birer-one "Kırp" seçeneğini kullanarak, ilgi alanına bunları kırparak (tıklayın ve fare düğmesi ile sürükleyin basılı). Çizilmiş dikdörtgenin içine çift tıklayınız Bu eylemi tamamlamak için.
4. "Hücre hatlarını çizin" ve hücre bağlı olduğu tüm microposts dahil çizim için çapraz saç imleci kullanın tıklayarak her görünür hücre anahat tek-tek işaretleniyor.
5. "Sil Mesajlar" linkine tıklayarak istenmeyen microposts atın ve çizim çapraz saç imleci kullanın. Görüntü bölümü dışında bir hücreye ait veya başka herhangi bir nedenle değil, ilgi hücre tarafından deflected tüm microposts sarmalar.
6. Yazılım alt yordamı fare tıklaması ile "Sentroidler Find" başlayın. Hemen yanında kendi merkezinde kırmızı bir çarpı görünür tüm microposts kayıtlı kadar "Sentroidler Bul" düğmesi, ayarı filtreyi ayarlayın. Filtre ayarı çok ise çok yüksek mu eğer düşük microposts, göz ardı edilecektirltiple pozisyonları tek bir micropost için işaretlenir. Bir analiz oturumu sırasında sürekli ayar filtreyi tutun.
7. Birden veya cevapsız micropost pozisyonları ile centroids manuel düzenleme fonksiyonu "Manuel Düzenle" kullanın. Tıklatarak ve karşıdan karşıya sürükleyerek söz konusu micropost seçmek için fare çapraz saç kullanın. Dikdörtgenin içine çift tıklayın ve otomatik olarak kapanır büyütülmüş görüntü bölümünde, eksik kırmızı işaret yerleştirmek. Çizilmiş hücre anahat dışında ise böyle bir micropost atın devam etmeden önce (adım 4.5).
8. Bir fare tıklaması ile "Izgara üret" fonksiyonunu aktive ederek ideal bir micropost ızgara bulun. Pozisyon çizilmiş hücre anahat içinde mavi bir halka ile gösterilen gerçek micropost kafası, tekabül emin olun.
9. Bir fare tıklaması ile gelen "Manuel Edit" fonksiyonunu kullanarak gerekli hücre alanı içinde herhangi bir yanlış ızgara makinesi düzeltin. Qu micropost seçmek için çapraz saç kullanıntıklatarak ve karşıdan karşıya sürükleyerek Sorusuna. Görünen dikdörtgenin içine çift tıklayın ve otomatik olarak kapanır büyütülmüş görüntü bölümünde, eksik mavi işaret yerleştirmek.
10. Bir micropost görüntü bölümü içindeki pozisyon ve oluşturulan ideal bir ızgara arasındaki fark esas alınarak hesaplanan sapma değerleri bir histogram almak için fare tıklaması ile renkli "Hesapla sehim" kullanın.
11. "Kaydet" konulu bir fare tıklaması ile değerlerin tablolar dahil olmak üzere komple bir analiz kaydedin.
12. "Görünüm Reset" ve uygun doğru klavye curser tuşu kullanılarak yapılabilir "Next Image", başka bir görüntü bölümü veya klik analiz tıklayarak ya görüntü analizi devam edin.

5. Veri Analizi - Mechanoprofiling

1. Analiz görüntüleri ile klasörden bir ofis elektronik tablo programı ile dosya "results.xls" açın. Bu al veri içeriyoranaliz hücrenin bütün micropost sapması ve bu tür çalışmaların (yani, alt tabaka deformasyon enerjisi) gibi standart önlemler dahil olmak üzere türev l hesaplanan değerler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Açıklanan tekniğin ana avantajı rutin laboratuvar çalışmaları içine hızlı ve etkin entegrasyonu için sadeliği ve potansiyeli yatıyor. Açık kaynak yazılım ile eşleştirilmiş yüksek kalitede ticari sensör dizileri kombinasyonu olur, aksi takdirde görüntü analizi ve yazılım geliştirme bilgisine temiz oda tesislerine ve derinlemesine erişimi gerektirir mekano-hassasiyeti hakkında bilgi vermektedir. 1 sunulan yöntemin iş akışını gösterir Şekil. Bu microp...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışma esas olarak giriş teknik ve pratik engellerin düşürerek çekiş kuvvet mikroskobu alanını ilerletmek istiyor. Bu engeller iki taraftan geliyor. Öncelikle çoğaltılabilir imalatları ve deneysel bir micropost dizisi komisyon için aşılması gereken çok sayıda önemsiz olmayan teknik zorluklar bulunmaktadır. Tipik bir deney yüzlerce veya hücrelerin hatta binlerce analizini gerektirebilir akılda tutarak - İkincisi, benzer olmayan önemsiz tek hücre güçlerinin güvenilir bir yarı otomatik...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera