Легкая и точная механотерапии профилирование на Micropost массивов

Резюме

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Аннотация

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Введение

Механотерапии чувствительные основе клеток анализы позволяют расследование прилипшие клетки, с широким спектром применения, которые отражают центральную роль, которую может играть механика в клеточной биологии. Эти приложения часто сосредоточиться на основных механизмов, которые управляют субклеточные процессы или поведение цельноклеточную. С одной стороны, внешние факторы окружающей среды, такие как дополнительное состава матрикса или матрицы жесткости может существенно влиять на механические и биологические реакции в клетке. ¹ То же самое можно было наблюдать после использования многих классов фармацевтически активных соединений, воздействие которых являются часто характеризуется использованием модели клеточной культуры. ² С другой стороны, генотипических свойств, таких как те, которые вызваны спонтанным или экспериментально индуцированных генетических мутаций, могут вызвать заметные изменения в клеточной фенотипа, которые связаны с изменениями в структуре цитоскелета и функции. ³ Эти примеры лишь немногие из многих возможныхТемы, по которым механические фенотипирование клеток является актуальной, и все из них были с пользой разбираться с micropost массивов.

На момент написания этой статьи, примерно 200 статей были опубликованы описания клеток micropost взаимодействия. Эти работы обсуждаются теоретические аспекты micropost принципов отклонения, а также практические инструкции по их производству. Первая статья, описывающая взаимодействие клеток и гибких массивов micropost была опубликована Тан и его коллеги в 2003 году ⁴ В отличие от классической тяги силовой микроскопии (TFM), где непрерывные мягкие субстраты, используемой для оценки сократительной клеток nanonewton масштабе, Тан и др. описан способ с использованием нескольких близко расположенных вертикальных балок из силиконового эластомера. Основные преимущества этого метода возникают из двух основных функций. Во-первых, с тем, чтобы изменить жесткость подложки клеток-очевидно нужно только изменить размеры, сохраняя micropostкомпозиция в противном случае постоянной и, таким образом, избежать различия в топологии и химии поверхности подложки. Второй microposts действовать как отдельные источники, которые могут быть дискретно анализируемых с силой и пространственным разрешением порядка отдельных координационных спаек и может уменьшить аналитические проблемы, которые присущи с аналогичным анализа по стандарту МТФ.

На сегодняшний день ассортимент приложений для micropost массивов значительно превышает только отображение сил в течение нескольких одиночных клеток. Например, Акияма сообщает об использовании изолированной Спинной сосуд ткани от моли гусеницы в качестве привода для массива micropost, для того, чтобы разработать мышцы насекомых питанием автономный микро-робота. ⁵

Тем не менее, большинство опубликованных приложения microposts сосредоточились на изучении медицинских условиях, таких как инфекции или рака. Например, micropost массивы были использованы для изучения поколения силовое комплекте типа IV пили Neisseria gonorrhОЕА колонии, который связан с сигналом каскадов повышения инфекции. ⁶ Другие используемые microposts изучать клетки рака молочной железы, получавших фармацевтических соединений, направленных цитоскелета. ⁷

Прогиб micropost часто описывается с помощью классической теории света для консоли с конечным нагрузки, предполагая ячейку придает только самый кончик micropost. Здесь приложенная сила F, что вызывает отклонение б зависит от "жесткости" изгиба к этой micropost и вычисляется по формуле:

(1)

с Е, I, L и будучи модуля Юнга, момент инерции площадей и длина пучка соответственно. Тем не менее, результаты этого уравнения дают лишь общее приближение сил на работе, так как балки стрижки и изгиб, а также подложки деформации не учитываются переменного токарассчитывать. Учитывая, что microposts как правило, сделаны из мягких материалов, таких как полидиметилсилоксановой (PDMS) основе силиконового каучука эти факторы должны быть включены. . Шон и др показали, что существует такой фактор коррекции на основе соотношения сторон micropost (L / D) и соответствующие полимера коэффициент Пуассона ^V 8 Оно дается.:

(2)

С Т _{наклона} (v) является коэффициент наклона, что включает в себя подходящий параметр а = 1,3, как можно найти в той же статье:

(3)

Это означает, что жесткость исправлена ​​micropost в K _корр является продуктом чистого изгибной жесткости к = к _изгибу и поправочный коэффициент корропределяется по формуле:

(4)

Таким образом, расчеты клеток сила должна быть выполнена с использованием более совершенной изменение уравнения (1) сейчас читаете:

(5)

Влияние коррекции становится более очевидным, как только типичные значения для размеров micropost используются. Например, 15-микронный пор micropost с круглым поперечным сечением и диаметром 5 мкм из ПДМС основе силиконового каучука приводит к поправочный коэффициент 0,77 и, следовательно, без поправки расчет будет переоценить оказываемое клеток силы на 23%. Это становится еще более тяжелой для microposts с меньшими пропорциями.

Традиционно, micropost анализа изображений также были основаны на идеализированной пучка теории изгиба. В 2005 году группа, которая является пионером в использовании MICROPOST массивы опубликовал программное обеспечение для анализа изображений подходит для анализа micropost ⁹ программное обеспечение требует лицензии на программное обеспечение, а пользователь должен принять три изображения для каждой позиции. по одному из верхних и нижних плоскостей micropost в режиме передачи в и другой в режиме флуоресценции с окрашенных ячейки. После сравнения верхние и нижние позиции для каждого micropost программное обеспечение определяет вектор силы поля и вычисляет соответствующие параметры, как сила на должность. Другие пакеты программного обеспечения существуют и их принципы анализа кратко упоминается в соответствующих статьях, описывающих их, но эти аналитические программные пакеты, как правило, не является общедоступной. ^10,11

Массивы micropost, предназначенные для отображения ячеек сил может быть классифицированы как будучи в ортогональной планировки micropost или гексагональную, последний из которых имеют то преимущество, равноудаленных зазоры между соседними всех microposts. Типичные microposts гаве круглое поперечное сечение и их размеры в диапазоне от 1,0 до 10 мкм в диаметре и от 2 до 50 мкм в длину. ⁴ Однако microposts с эллиптической или квадратным поперечным сечением также сообщалось. ^12,13

Использование силиконовых смесей ПДМС основе как micropost материала позволяет добавлять наночастиц в смеси. Например добавки кобальта нано-стержней обеспечивает магнитную активацию micropost и таким образом дает еще степень свободы для потенциальных экспериментальных образцов. ¹⁴ Большинство групп произвести их массивы micropost на плоских жестких материалах, таких как стекло или крышка внутри чашки Петри. Тем не менее, Манн и его коллеги недавно сообщили массив micropost сформированный на раст мембраны. ¹⁵ Это позволяет приложению клеточных растягивающих сил в адгезивных клеток при изучении живых клеток внутриклеточное динамические характеристики с точки зрения клеточной сократимости.

Широко используются и наиболее Estabчания способ получения micropost массивов на основе мягкой литографии, как описано в глубокие протоколов Sniadecki и коллег. ^16-18 коротких стандартных процессов в чистых помещениях используются для создания микроструктур на вершине кремниевой пластины с использованием SU8 фоторезиста. Это сопровождается копировального процесса, в котором силиконовый каучук отливают над структуры передачи их в формы. На втором этапе эти формы используются для репликации исходной микроструктуры с использованием силиконового каучука на вершине выбранного субстрата. Однако, несмотря на большой и растущего числа публикаций, связанных с их применением, устанавливающих производственный процесс для microposts занимает значительное количество времени, даже для микро-инженерных специалистов; Есть много шагов процесса, которые требуют оптимизации и адаптации к конкретной тестовой среде и макет micropost с получением приемлемого уровня качества.

Коммерческие массивы micropost теперь доступны в готовом-то-использование ("вне-шельф") формат с неизменно высоким качеством. Как таковые, они являются альтернативой сложной и длительной производственного процесса, необходимого для производства на месте. В этой статье коммерчески доступный массив micropost был использован для отображения клеточные силы с помощью одного ярко-микроскопии изображение. Что еще более важно эта статья описывает и документирует полностью функциональное программное обеспечение с открытым исходным кодом под названием MechProfiler, которая доступна для скачивания в виде дополнительного материала к этой рукописи. Активно поддерживается версия программного обеспечения также можно найти на http://www.orthobiomech.ethz.ch.

Сочетание "вне-шельф" анализа и совместимым программным обеспечением для анализа с открытым исходным кодом заметно снижает барьер входа для достижения точных экспериментов TFM. Исследователи не имеют доступа к либо чистых помещений или опыт разработки программного обеспечения может анализировать клеточные силы успешно. Это позволяет пользователю сосредоточиться на mechanosensitivity анализ выход, а не сама технология, и делает измерения силы тяги, доступные для более широкого сообщества. Кроме того, это важный шаг, чтобы проложить путь к полностью автоматической скрининга micropost массивов.

Программное обеспечение MechProfiler анализ процессов изображения в формате TIFF-файл, PNG, BMP и JPG. Изображения могут быть приняты с использованием флуоресценции, фазового контраста или яркие поля световой микроскопии. Автономная программа работает вместе с бесплатным Matlab Compiler Runtime (доступной по адресу: Рисунок 12) и основные алгоритмы позволяет упорядочить обработку изображений, что позволяет пользователю обрабатывать изображения с одной или нескольких ячеек в 1 мин. Кроме того, эти клетки могут быть либо жить или "фиксированной".

Программное обеспечение MechProfiler способен значительно повысить пропускную способность анализа данных, опираясь на воспроизводимость качества коммерческой micropost массивов, более конкретно, по умолчанию & #8220; без отклоняется "положение каждой должности в массиве можно предположить с идеальной сетки (производственные отклонения для сетки в массивах, используемых в данном исследовании были меньше, чем 100 нм).

В короткой открывает выбор файлов изображений для анализа, культуры их интересующей области, определяет сообщения, покрытые клетками, или которые должны быть отброшены, определяет пост позиции, вычисляет отклонения / силы против идеальной сетки, и, наконец, сохраняет все данные клеточные конкретных, с возможностью для экспорта, в том числе в стандартном офисном таблицы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. культивирования клеток на Micropost массивов

Примечание: Все шаги должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности, чтобы обеспечить стерильность. Объемы приведенные здесь для культивирования клеток Т25 колб. Культуры клеток среднего рецепт и посева клеток плотность оптимизированы для линий рака костных клеток HuO9 и M132.

1. Подготовка клеточной культуры для посева на массив micropost.
   1. Проверка качества клеточной культуры путем размещения культуральной колбы на стандартном оптическом микроскопе. Убедитесь, что клетки показывают типичную морфологию роста и путем оценки, сколько из культуральной колбы дна покрыта. Охватом 70% -80% отражает здоровый рост. Обратите внимание на количество плавающих клеток, как они представляют отмершие клетки и / или заросший культуры.
   2. Trypsinize клетки путем удаления среды и промыванием 4 мл 1x фосфатным буферным солевым раствором (PBS) буфере. Добавить 0,8 мл 1x трипсин / этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и инкубируют при комнатной температуре в клетке дос сместить, который занимает около 2-4 мин. Проверьте процесс с микроскопом, а иногда и нажмите колбу осторожно, чтобы поддержать оплывание.
   3. Добавьте 5 мл клеточной культуральной среды (модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), / F12 с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина / стрептавидин (Pen / Strep)), чтобы остановить реакцию, и смыть остаточных клеток, которые еще сидят на дне колбы в. Впоследствии пипетки этой суспензии вверх и вниз несколько раз, чтобы получить однородную смесь. Убедитесь, что пипетки все решения по всей первоначальной площади роста колбы, чтобы получить эффективную оплывание.
   4. Передача клеточной суспензии в 15 к трубке и мл центрифуге его использовании настольную центрифугу при 0,5 мкг в течение 3 мин.
   5. Удалить супернатант и повторно приостанавливать осадок клеток в 5 мл среды с помощью пипетки вверх и вниз 5 раз. Убедитесь, чтобы избежать поколение пузырьков, делая так.
   6. Определить плотность клеток с помощью подсчета клеток камеру и легкий microscoфиз ра. Проверьте клеточной суспензии в счетной камере клеток для сотовых агрегатов и обеспечить, чтобы только отдельные клетки для последующего эксперимента. Внесите снова вверх и вниз несколько раз, если клетки имеют тенденцию образовывать агрегаты для разделения их.
   7. Развести клеточной суспензии с достаточной среде, чтобы получить клеточный раствор 25000 клеток / мл. Смешайте это хорошо, переворачивая закрытой трубе несколько раз.
2. Подготовьте массив micropost для посева клеток.
   Критическая Примечание: Не пипетки на массив micropost непосредственно, так как это может нанести вред на microposts, особенно когда нежелательные пузырьки вводятся. Кроме того, убедитесь, что массив micropost никогда не высыхает, как происходит капиллярные силы приводят к рушится из microposts.
   1. Поместите стеклянную подложку с массивом micropost лицевой стороной вверх в скважине 12-луночного планшета с помощью пинцета и влажный это путем добавления 1 мл этанола (99%). Выдержите при комнатной температуре в течение 20-30 сек.
   2. Развести этаноластупенчатое добавление приблизительно от 1 мл стерильной деионизированной воды (ДИ воды) на стороне скважины и аспирации приблизительно 1 мл, с помощью пипетки передачи или отсасывающего устройства. Повторите этот шаг, по крайней мере в 3 раза.
   3. Заменить ди-вода с PBS-буфере таким же образом, добавляя и аспирации приблизительно до 1 мл. Повторите этот шаг 3 раза.
   4. Замените PBS-буфер с добавлением среды и аспирационных примерно 1 мл среды. Повторите этот шаг 3 раза.
3. Внесите решение 1 мл клеточной (25000 клеток) в верхней части каждой подготовленный массив micropost. Закрыть мульти-луночный планшет и перенести его на инкубаторе _(СО 2 5%, 37 ° С). Пусть клетки придерживаться и расти поверх microposts для 6 -7 часов.
4. Проверьте процесс адгезии иногда с помощью света микроскопа. Убедитесь, что большинство клеток появляются разбросаны по нескольким microposts.

2. Крепежные и окрашивания клеток

Примечание: Все действия иОбъемы приведены здесь для одной лунке 12-луночного планшета в. Рекомендуется обрабатывать не более четырех из двенадцати скважин на время, чтобы избежать высыхания колодцев после аспирации любой жидкости, которая приведет к краху microposts.

1. Отберите среду из скважины и промыть клетки 2x 1 мл PBS-буфера. Убедитесь, что применить нежный силу при промывании PBS, чтобы удалить сотовый мусора, которые, накопленный в массиве micropost во время инкубации и отсоединить мертвые клетки.
2. Зафиксировать клетки с 0,5 мл 3,7% забуференном растворе формальдегида в течение 5 мин.
3. Замените раствор формальдегида промывкой micropost массива 2x с 1 мл стерильной дистиллированной воды.
4. Пятно клеток с красителем (0,05% кумасси бриллиантовым синим в 50% воды, 40% этанола и 10% уксусной кислоты) в течение приблизительно 90 сек. Вымойте избыток окрашивания решение выключить 2x с 1 мл стерильной дистиллированной воды. Добавить 1 мл DI воды в micropost массив.
5. Проверка окрашивания результат с помощью светового микроскопа. Повторите тон окрашивания шаг, если тело клетки слишком слабы, чтобы быть визуализированы.
6. Магазин micropost массивы с окрашенных клеток на вершине в холодильнике при 4 ° С. Убедитесь, чтобы держать их под водой на все времена.

3. изображений сотовый

Примечание: Шаг 4 относится только к микроскопов без бесконечности исправлены оптики.

1. Добавить 2 мл ДИ-вода в чашку Петри с тонким стеклянным дном для изображения с высоким разрешением.
2. Перевести micropost массив, используя пинцет в визуализации блюдо с microposts вверх.
3. Поместите изображения чашки Петри на стадии подвижного светового микроскопа.
4. Включите компенсации кольцо объектива, используемого для получения изображения, пока число на шкале не представляет собой общую толщину всех материалов вдоль оптического пути, чтобы компенсировать несоответствие в показателях преломления стеклянной подложки, силиконового эластомера и жидкости сверху. Это должно привести к яркому внешнему виду micropostsЯдра.
5. Закройте диафрагму на освещение стороне до 50% и удалите фазового контраста кольца из оптического пути благоприятной обычный режим светлого поля.
6. Совместите массив micropost что microposts сформировать горизонтальную линию поперек поля наблюдения. Определить начальную точку (например, верхний левый) и переместите блюдо ступенчато Петри по сцене сканирования массива micropost, принимая многочисленные изображения.
7. Возьмите все изображения с самой высокой настройке разрешения для камеры с использованием 20X 40X или цели. Цель иметь одну ячейку в центре изображения.
8. Развертки по оси через подложку, пока кончики micropost не в фокусе. Используйте тонкую настройку фокусировки колесо микроскопа и поверните ее к упором на micropost нижней около 2-3 мкм.
9. Установите стандартную процедуру формирования изображения, принимая ряд тестовых изображений одной секции массива охвативший параметров изображений по одному за раз (например, время экспозиции,настройки диафрагмы, настройки лампы и т.д.). Анализ изображений с MechProfiler и определить подходящий набор параметров для быстрого и надежного анализа.

Анализ 4. Изображение с Open Source Software »MechProfiler"

Примечание: Все функции программного обеспечения могут быть активированы с указательным устройством, используя левую кнопку мыши. Тем не менее, подготовленный оператор будет использовать документированные сочетания клавиш, предназначенные, чтобы быть на левой половине клавиатуры, чтобы позволить эффективную двуручный обработки изображения.

1. Начните анализа изображений программное обеспечение MechProfiler и открыть ряд изображений, которые должны быть проанализированы, нажав кнопку "Открыть".
2. Вставьте все параметры в разделе "Настройки", заданной разработчиком программного обеспечения. Определить параметры, которые должны быть специально сконфигурирован (т.е. контур порогового и минимальное расстояние) в соответствии с процедурами, описанными подробно в руководстве по программному обеспечению.
3. Анализ изображенияс одной на один обрезка их области интересов с помощью "Crop" (нажмите и перетащите с нажатой кнопкой мыши вниз). Двойной щелчок внутри нарисованной прямоугольника, чтобы закончить эту акцию.
4. Маркировка каждого видимого клеток контур один за одним, нажав на "Draw клеток очертания" и использовать кросс курсор волос для рисования, включая все microposts клетка, прикрепленных к.
5. Откажитесь от любых нежелательных microposts, нажав кнопку "Не сохранять сообщения" и используйте кросс курсор волос для рисования. Приложить все microposts, которые принадлежат к клетке за пределами той части изображения или отклоняются по любой другой причине, но не в клетке, представляющей интерес.
6. Запустите программное обеспечение подпрограммы "Найти центроидов" с помощью мыши. Отрегулируйте настройки фильтра рядом с кнопкой «Найти центроидов", пока все microposts не зарегистрировано, который виден по красным крестом в центре. Если настройка фильтра слишком низкие microposts будут игнорироваться, если она слишком высока муltiple позиции будут отмечены для одного micropost. Держите фильтр установка постоянной во время сессии анализа.
7. Используйте функцию ручной редактирование "Ручная Edit" для центроидами с несколькими или пропущенных позиций micropost. Используйте мышь кросс волосы, чтобы выбрать micropost в вопросе, нажав и перетащив его поперек. Двойной щелчок внутри прямоугольника и поместите недостающую красный маркер в разделе увеличенное изображение, которое автоматически закрывается. Откажитесь такой micropost, если он находится за пределами нарисованной клеток контура (см шаг 4,5) до начала.
8. Найти идеальный micropost сетку путем активации функции "Создать сетку" с помощью мыши. Убедитесь, что положение соответствует с истинным micropost головы, показанной синим кольцом, внутри нарисованной клеток контуром.
9. Исправьте неуместны сетки производителя внутри области клеточной где это необходимо, используя соответствующую функцию "Редактировать" Мануэль с помощью мыши. Используйте перекрестие, чтобы выбрать micropost в Куestion нажав и перетащив его поперек. Дважды щелкните в открывшемся прямоугольника и поместите недостающую синий маркер в разделе увеличенное изображение, которое автоматически закрывается.
10. Используйте кнопку "Рассчитать" Прогибы щелчком мыши, чтобы получить гистограмму значений отклонения рассчитанных на основе разницы между положение А micropost внутри секции изображения и генерируемого идеальной сетки.
11. Сохраните полный анализ, включая таблицы значений с помощью мыши на кнопку "Сохранить".
12. Продолжить анализ изображения, нажав на "Сброс Фото" и проанализировать еще один раздел изображения или щелчок мыши на "Следующее изображение", который можно удобно сделать с помощью правой клавиши клавиатуры curser.

5. Анализ данных - Mechanoprofiling

1. Откройте файл "results.xls" с электронными таблицами офис программы из папки с анализируемых изображений. Он содержит данные с Альл расчетные значения в том числе всех micropost отклонений и стандартных производных мер, таких как работы (т.е. деформации подложки энергии) анализируемой ячейке.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Основным преимуществом описанной методике заключается в его простоте и потенциал для быстрого и эффективного интеграции в повседневную лабораторных работ. Сочетание высокого качества коммерческих массивов датчиков в паре с программным обеспечением с открытым исходным кодом предос...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Эта работа направлена ​​на продвижение поле тяги силовой микроскопии существенно снижая технические и практические барьеры для входа на рынок. Эти барьеры приходят с двух сторон. Прежде всего это многочисленные нетривиальные технические проблемы, которые необходимо преодолеть, что...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera