幕式柱:效率和灵敏度的优化

摘要

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

摘要

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

引言

近年来色谱柱技术的高效液相色谱法（HPLC），极大地推进;峰容量大大增加在很大程度上要归功于使用更小的颗粒尺寸和更高效的核壳粒子。因为分离通常是更有效的，因为峰现在更清晰，因此高^1-8的流上作用已在敏感性的增加。

然而，径向床异质仍然在所有列的性能的一个限制因素，但是这不是一个新的故事，因为色谱已经知道这个多年。柱床有两个沿径向^9-12异类，和沿列轴^10,12-15。壁效应尤其是分离性能^7,16-18损失的一个重要因素。 Shalliker和Ritchie ⁷最近审查柱床异质性方面，因此这不一定是discusseð这里进一步。虽然我只想说，在柱床堆积密度和变化的壁效应导致溶质插头的扭曲，使得乐队通过列塞类似于部分填充汤洗脱碗，而不是薄平固盘⁷通常是在基础教学文本描述。当实验进行，使得通过该床的溶质迁移可以被可视化的柱内的插头剖面是部分中空和带的拖尾部分主要是样品插头的壁组件。最终的结果是，它需要更多的板，以隔开比如果盘是固体和平面^12,14,17将需要这些"部分空心'插头。为了克服乐队扩大与壁效应和径向填充密度的变化有关的问题，被称为主动流动技术（AFT）柱技术的一种新形式的设计^7,19。这种设计的目的是通过溶剂洗脱的沿着壁区域中的物理分离除去壁效果，从该流动相在柱¹⁹的径向中心区域洗脱。有两种主要类型的AFT列;并行分段流动（PSF）列和窗帘流量^（CF）7列。由于该协议的目的是CF列的使用和优化，PSF列将不作进一步讨论。

幕流（CF）

幕流（CF）柱格式利用在两个入口和柱的出口AFT端部附件。 AFT端部附件包括位于一个多件内的环形熔块。玻璃料是由三部分组成:与端部的中心孔嵌合，与该端部接头的外周端口对准的多孔外部部分，和一个不渗透环对准的多孔径向中央部，其分离防止任何交叉的两个多孔部分玻璃料¹⁹的径向中心和外部区域之间-flow。 图1示出的AFT玻璃料的设计与图2示出在CF列格式。在此模式下操作的（CF）的样品被注入到入口配件的径向中央端口，而额外的移动相通过的径向中心区域通过所述入口到"帘"溶质的迁移的圆周口导入柱。因此，样品进入与具有流动相仅通过它的列的外部区域的列的径向中心区域的床。有研究表明，大约40:60的体积流率比（中央:周边端口），用于在入口4.6内径（ID）柱的端部配合的是最佳的^6,7,16。在CF塔的AFT出口允许中枢和外周流量的调节其相对部分，并且可以被改变以几乎任何期望的拉提通过压力管理o。在CF列的优化可以显著改善塔技术的各种功能方面，例如分离效率或检测灵敏度。以这种方式，"无壁"，"无限直径"或"虚拟"列建立^{6,10,18,20。} CF列的目的是为了通过该柱主动管理样品的迁移，以防止样品在到达壁区域。因此，在出口到检测器中的溶质浓度为最大，当使用紫外线（UV）检测^16，以及即使使用质谱检测⁶时更大的增加的比常规列格式更大约2.5倍的灵敏度。

CF列非常适合于低浓度的样品中，由于检测灵敏度增加。此外，联接到流率受限探测器，诸如质谱仪（MS）的⁶时它们是理想的。一个AFT柱在4.6毫米内径的格式，例如可以调整为标准2.1 mm内径格式列时在同一线速度操作时，通过调整中央流动退出到21％，提供的溶剂相同体积到检测器。同样，AFT列也可以调整，通过调整核心流程退出到43％，提供相同的容积负荷的检测器，3.0 mm内径柱。事实上任何"虚拟"列格式可以生产以满足需求分析^6,18,22。在入口使用这些专门设计的端部附件和出口确保真正的无壁列成立。

有两种方法来设置溶剂输送系统入口的中心和周边港口:分流系统⁶和两个泵系统^6,7 图3说明每个CF系统设置窗口中。

分流系统

一世呐分流系统（ 图3A）的泵的流量通向喷射器是使用零死体积T型件，其中流动相的一个流动流被连接到喷射器，其然后连接到分裂预喷射柱的入口端，嵌合的中央端口。流动相的第二流动流通过绕过喷射器，并连接到外围端口上的柱的入口。中流动的分割，在流动流百分比调节至40:60（中心:外围设备）的线连接到列之前， 即从喷射器到中心和泵外围。

双泵系统

在CF列需要在塔的入口端拟合两个流动流。根据高效液相色谱仪，分流设置的自动进样器/喷射器的类型，可能无法进行，所以CF然后可以通过两个泵（ 图3B ^21）来实现。每个泵被分配，选择连接到中央或外围端口和流率被设定为表示流量为中央口的40％，为外围端口60％。例如，如果总流速1.0毫升分钟^-1，中央泵流量被设为0.4毫升分钟^-1和外围泵被设置为0.6毫升分钟^-1。

其中操作方式的选择在很大程度上取决于该HPLC仪器和操作色谱模式。例如，在一些自动进样器中的样品装载位置和样品之间的压力的变化注入，可能会发生位置扰乱分流比，因此在这种情况下，一个双泵设置将被推荐为最佳的CF性能。无论设置溶剂输送系统选择用于CF柱的入口，在CF出口优化保持相同。在CF柱出口中央端口附连到与SMAL的紫外可见（UV-VIS）检测器免得体积可能管以减少柱后死体积的影响。因为，CF列模拟窄径柱，柱出口和检测器之间的死体积是不利的CF柱的分离性能。关键是要确保中央端口和UV-Vis检测以减少死体积的如带展宽，损失在效率和灵敏度的影响之间管容积的最小量。因此，使用窄口径管材（0.1毫米）的建议，以轻易让调整的压力不增加不适当的死体积。管也连接到所述外围端口，并指示浪费。当在CF柱的出口，所述分割比可以调节到适合分析者的目的的任何比率。当使用4.6 mm内径的CF，例如，它常常是方便设置的比率为要么43:57或21:79（中心:周），以模拟一个"虚拟"3.0毫米内径柱或2.1毫米内径柱，尊敬。这样的分离性能是容易长凳标记。分割比由称重流从连接到中央端口和流动离开该外围端口经过一段时间的检测器排出的量来测量。的百分比流量通过每个端口可以被确定，并且该比率可以通过改变管附着的长度或用具有不同的内部直径（ID）管进行调整。

此视频协议细节增强色谱性能CF塔的运行和优化程序。

研究方案

注意:请参考所有材料和试剂材料安全数据表（MSDS）使用前（ 即 MSDS甲醇）。处理溶剂和高效液相色谱法（HPLC）洗脱时，确保使用的所有适当的安全措施。确保适当使用高效液相色谱仪，分析天平和检测仪器仪表工程控制，保证使用个人防护用品（防护眼镜，手套，实验室外套，全长裤，封闭趾鞋）。

注意:此协议包含如何耦合用UV-Vis检测器HPLC系统上使用CF列的指令。该协议已被写入假设读者已经在色谱基础知识和经验。

1. HPLC仪器的安装

注意:本节可以改变，以适应分析人员的需求， 即，选择的溶剂中，检测器波长和流动速率适合于所关心的样本。

1. 制备具有100％的超纯水为线，一种用于线B的高效液相色谱仪（ 例如 Milli-Q水）和100％甲醇作为流动相和吹扫泵按照制造商的要求。
2. 在UV-Vis检测设定为254纳米。
3. 选择的设置任一个预喷射流分割模式，或一个双泵流量设置。对于分流模式进行第2步，为双泵模式继续执行步骤3。

2.分流系统设置

1. 断开从自动取样器的喷射器阀的泵线。
2. 附加一个T型件到泵线。
3. 附上15厘米的一块0.13毫米ID管到T型件的每一个端口。
4. 从T型件连接一管喷射器自动取样的阀。
5. 泵设置至1.0ml分钟^-1。
6. 流的分割比连接泵线到CF柱的入口，调谐到40％之前:6 0％（中线:外围线）在步骤如下2.7。
7. CF的比例入口分流系统的调整
   1. 用分析天平测量两个空收集容器的质量和标签一个收集容器的中心和另一外围设备（一个用于从自动取样器行居中端口，一个用于从T型件到外围端口的线） 。
   2. 为1.0分钟，收集排出的流动相从所述喷射器（在将被连接到所述列中的点）进入收​​集容器中，在2.7.1测定其质量来的行。
   3. 重新称量在分析级的收集容器中，并确定所收集的流动相的质量。
   4. 重复步骤2.7.2至2.7.3用于退出从T型件就是要连接到外围端口行洗脱剂。
   5. 确定流量的比例（毫升分钟^-1）从根据下列等式流的每个行:
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   6. 调整流量比例为40％:60％（±2％）（线从注射器到中央端口:T-片外围端口线）。如果从喷射器到中央端口的流量百分比的线是40％以上，提高通过减小管的内直径或增加其长度的压降。如果从喷射器到中央端口的流量百分比的线是在40％以下，提高了管子的内径或减小管的长度。
   7. 一旦流动比率调整转向泵的流量了。
   8. 从喷油器线路连接到柱入口的中心港口，从T-片柱入口的外设端口的线。
   9. 缓慢上升流速至1.0ml分钟^-1在100％B线。
   10. 通过允许平衡所述柱（4.6毫米内径×100毫米长）100％甲醇（B线）流动相以1.0ml分钟通过该柱流^-1 10分钟。这个时间是根据用户可以使用其他列的尺寸缩放。
   11. 对于CF出口的调谐转到步骤4"CF出口流量的调整"。

3.双泵系统设置

1. HPLC系统泵连接到喷射器，然后从喷射器连接线到该列的中央进气口。
2. 直接连接的附加泵到柱的入口外围端口。注意，该第二泵由绕过喷射器。
3. 斜坡连接到中央口系统泵的流速0.4毫升分钟^-1（代表为1.0ml分钟^-1的总流速的40％），在100％甲醇（B线）。
4. 同时如步骤3.3，坡道的周边泵的流速0.6毫升分钟^-1（代表的总流量的60％1.0毫升分钟^-1），在100％甲醇（B线）。
5. 通过允许100％甲醇（B线）的流动相以1.0ml分钟通过该柱流^-1 10分钟平衡的柱（4.6毫米内径×100毫米长）。这个时间是根据用户可以使用其他列的尺寸缩放。
6. 对于CF出口的调谐转到步骤4"CF出口流量的调整"。

4.调整CF出口气流

1. 中央出口端口连接到使用15厘米的一块0.13毫米ID管的UV-Vis检测。
2. 15厘米的一块0.13毫米ID管连接到CF柱的外周出口。
3. 权衡的分析天平上两个空收集容器的质量和标签一个容器的中心和其他外围设备。
4. 为1.0分钟，收集从UV-Vis检测器（中央流动）排出的流动相进入收集容器标签的中心，在4.2测定其质量。
5. 重新称量含有关于分析级所收集的洗脱剂在收集容器中，并确定所收集的流动相的质量。
6. 重复步骤退出从外围出口线路洗脱液4.4至4.5。
7. 确定流从根据下列等式流中的每一行的百分比:
   
8. 调整的流量比至21％:79％（±2％）（从紫外可见中心出口流量:从管线外围出口流），如果从紫外可见中央流百分比为21％以上，提高压降通过减少附着到UV-Vis检测的出口管道的内部直径或增加其长度。如果从紫外可见的中心流动百分比低于21％，增加内径附着在UV-Vis检测出口处的管道，或减小管子的长度。每次管的长度被改变，重复步骤4.3至4.7。
   注:"虚拟"2.1 mm内径模式CF柱为分析做好准备。

结果

AFT柱使用在多端口柱端部附件的专用料设计（ 图1）克服了柱床异质性和改善的分离性能的发展。上的CF层析柱（ 图2）的分离性能的实验室间研究用成立（ 图3B）作为在该协议²³的第3节中描述的双泵系统进行的。三组分测试混合物通过一个"虚拟"2.1 mm内径其中CF塔的中心出口流量的21％被定向到检测器下进行分析。三组分测试?...

讨论

这项研究涉及CF色谱柱的实验室间分析测试效率和灵敏度方面的分析性能。在CF柱在节'3的描述设置了双泵系统。双泵系统设定"来实现的40:60的流量比:在CF柱的入口（中心周）。的40:60（中心:外设）流量比通过设定各泵分别代表40％，总流量的60％，该值的流率实现的。在CF塔出口用以下在部分"中描述的方法调谐到为2.1毫米的ID的"虚拟"塔4。 CF出口流量的调整"。使用含有苯乙醚，丁基苯和戊基苯?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC instrument
Additional Pump			Required if 2 pump CF system set up is to be used.
Curtain Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialized
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels
T-piece	Any brand