Rideau Colonne Débit: Optimisation de l'efficacité et sensibilité

Résumé

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Résumé

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Introduction

Au cours des dernières années, la technologie de colonne pour chromatographie liquide haute performance (HPLC) a beaucoup progressé; les capacités de pointe ont considérablement augmenté en grande partie grâce à l'utilisation de tailles de particules plus petites et les particules de coquille de base plus efficaces. Depuis les séparations sont généralement plus efficaces, un flux sur l' effet a été une augmentation de la sensibilité depuis les pics sont maintenant plus nette et donc plus grand ^1-8.

Néanmoins, l'hétérogénéité radiale de lit est toujours un facteur limitant dans l'exécution de toutes les colonnes, mais ce n'est pas une nouvelle histoire depuis chromatographistes ont connu depuis de nombreuses années. Lits de colonne sont hétérogènes tant dans la direction radiale ^12/09, et le long de la colonne axe ^10,12-15. L'effet de paroi est particulièrement un important contributeur à la perte de ^7,16-18 performance de séparation. Shalliker et Ritchie ⁷ récemment passé en revue les aspects de lit de la colonne hétérogénéité et donc ce ne sont pas nécessairement discussed ici plus loin. Bien qu'il suffise de dire, que la variation de densité de tassement de lit colonne et les effets de paroi conduisent à une déformation de la fiche de soluté, de telle sorte que les bandes éluent à travers la colonne dans les bouchons qui ressemblent partiellement remplis soupe bols plutôt que de minces disques solides plates ⁷ qui sont généralement représenté dans les textes de l'enseignement de base. Quand les expériences ont été réalisées de telle sorte que la migration des solutés à travers le lit peut être visualisé les profils de bouchon à l'intérieur de la colonne ont été partiellement creuse et la section de queue de la bande est en grande partie l'élément de paroi de la prise d'échantillon. Le résultat final est que cela prend beaucoup plus de plaques pour séparer ces bouchons «partiellement creux» que ce qui serait nécessaire si les disques ont été solides et plat ^12,14,17. Pour surmonter la bande d' élargir les questions associées à des effets de paroi et la variation de densité de tassement radiale, une nouvelle forme de technologie de colonne appelée Active Technology Flow (AFT) a été conçu ^7,19. Le but de cette conception étaitpour éliminer les effets de paroi à travers la séparation physique du solvant d' élution le long de la zone de paroi, de celle de la phase mobile d' élution dans la zone centrale radiale de la colonne ^19. Il existe deux principaux types de colonnes AFT; Segmented Flow (PSF) colonnes parallèles et flux de rideau (CF) colonnes ^7. Depuis ce protocole vise à l'utilisation et l'optimisation des colonnes des FC, des colonnes PSF ne seront pas examinées plus avant.

Rideau Flow (CF)

Rideau Flow (CF) formats de colonne utilisent embouts AFT à la fois l'entrée et la sortie de la colonne. embouts AFT se composent d'un fritte annulaire situé à l'intérieur d'un raccord multiport. La fritte est constituée de trois parties: une partie centrale radiale poreuse qui est aligné avec l'orifice central de l'embout, une partie extérieure poreuse qui est aligné avec le port de périphérique (s) de l'embout et une bague imperméable, sépare les deux parties poreuses empêchant toute croix-Flow entre les régions centrales et extérieures radiales de la ¹⁹ fritte. La figure 1 illustre la conception de la fritte AFT et la figure 2 illustre le format de colonne FC. Dans ce mode de fonctionnement (CF), l'échantillon est injecté dans l'orifice central radial du raccord d'entrée, tandis que la phase mobile supplémentaire est introduit à travers l'orifice périphérique de l'entrée vers «rideau» de la migration des solutés à travers la zone centrale radiale de la colonne. D'où l'échantillon pénètre dans le lit dans la zone centrale radiale de la colonne avec la zone extérieure de la colonne ayant une phase mobile seulement passée à travers elle. Des études ont montré que le rapport volumétrique de débit d'environ 40:60 (central: port périphérique) pour l'entrée embout d'une colonne de 4,6 mm de diamètre interne (id) est ^6,7,16 optimale. La sortie AFT de la colonne de CF permet le réglage de l'écoulement central et périphérique à leur part relative et peut varier à presque toutes les rati souhaitéeo grâce à la gestion de la pression. L'optimisation d'une colonne de CF peut considérablement améliorer divers aspects fonctionnels de la technologie de colonne, tels que l'efficacité de la séparation ou de la sensibilité de détection. De cette manière , un «mur», «infini diamètre» ou la colonne «virtuelle» est établie ^6,10,18,20. Le but de colonnes des FC est de gérer activement la migration de l'échantillon à travers la colonne pour empêcher l'échantillon d'atteindre la zone de paroi. Ainsi, la concentration de soluté à la sortie du détecteur est maximisée, ce qui augmente la sensibilité d'environ 2,5 fois plus grand que le format de colonne classique pour l'utilisation de rayons ultraviolets (UV) , la détection ^16, et encore plus pour l'utilisation de la détection par spectrométrie de masse ^6.

colonnes des FC sont idéales pour les échantillons de faible concentration, car la sensibilité de détection est augmentée. En outre, elles sont idéales lorsqu'il est couplé à DÉBIT détecteurs limités, tels que le spectromètre de masse (MS) ^6. un Acolonne FT dans un format identifiant de 4,6 mm, par exemple, peut être réglé pour délivrer le même volume de solvant à un détecteur comme une colonne de format identifiant norme 2,1 mm lorsqu'il est utilisé dans les mêmes vitesses linéaires, en ajustant la sortie de flux central à 21%. De même, la colonne AFT pourrait également être réglé pour délivrer le même volume de charge à un détecteur comme une colonne id 3,0 mm, en ajustant la sortie de flux central à 43%. En fait , tout format de colonne «virtuel» pourrait être produit en fonction de l'exigence analytique ^6,18,22. L'utilisation de ces embouts spécialement conçus à l'entrée et la sortie assure qu'une colonne de paroi moins vrai est établie.

Il y a deux façons de mettre en place le système de distribution de solvant aux ports centraux et périphériques de l'entrée:. Split system-flux ⁶ et deux ^6,7 système de pompe figure 3 illustre chacun de ces systèmes de CF set ups.

Système Split-débit

jena split system-flow (figure 3A) le débit de la pompe menant à l'injecteur est pré-injecteur split en utilisant un mort zéro volume de pièce en T, où un flux de phase mobile d'écoulement est relié à l'injecteur, qui est ensuite relié à la orifice central de l'embout d'entrée de la colonne. Le second flux de phase mobile d'écoulement passe par l'injecteur et est connecté au port périphérique à l'entrée de la colonne. Au cours de la séparation de l' écoulement, le pourcentage de flux d'écoulement est ajusté à 40/60 (centre: périphérique) avant que les lignes sont raccordées à la colonne, soit de l' injecteur au centre et à la pompe périphérique.

Système à deux de la pompe

La colonne CF requiert deux courants d'écoulement à l'entrée embout de la colonne. Selon le type d'échantillonneur automatique / injecteur de l'instrument de HPLC, split-débit mis en place ne peut pas être possible, et ainsi CF peut alors être réalisé par 2 pompes (figure 3B) ²¹. Chaque pompe est allouée et reliée soit à l'orifice central ou périphérique et le débit est réglé pour représenter 40% du débit pour le port central et 60% pour le port périphérique. Par exemple, si le débit total est de 1,0 ml min ^-1, le débit de la pompe centrale est réglée à 0,4 ml min - ¹ et la pompe périphérique est réglé à 0,6 ml min ^-1.

Le choix du mode de fonctionnement est largement dépendante de l'instrumentation par HPLC et le mode de fonctionnement chromatographique. Par exemple, dans certains autosamplers un changement de pression entre l'échantillon position de charge et de l'échantillon injecter position peut se produire perturber le rapport d'écoulement divisé et donc dans ce cas une double pompe mis en place serait recommandé pour des performances optimales des FC. Quel que soit le système de distribution de solvant mis en place choisie pour l'entrée de la colonne CF, l'optimisation de sortie CF reste le même. L'orifice central de sortie de la colonne CF est fixé au détecteur ultraviolet-visible (UV-VIS) avec le Smalde peur que le volume possible de tubes pour réduire au minimum les effets de post-colonne volume mort. Depuis, les colonnes des FC émulent colonnes étroites calibre, volume mort entre la sortie de la colonne et le détecteur est préjudiciable à la performance de séparation de la colonne CF. Il est essentiel d'assurer la plus petite quantité de volume du tube entre l'orifice central et le détecteur UV-Vis pour minimiser les effets du volume mort, tels que l'élargissement de bande, une perte de l'efficacité et de la sensibilité. Par conséquent, l'utilisation de tubes de forage étroit (0,1 mm id) est conseillé pour permettre facilement les ajustements de pression sans ajouter de volume mort inappropriée. Tubing est également attaché au port périphérique et dirigé à perdre. A la sortie de la colonne CF, le rapport de segmentation peut être ajusté à n'importe quel rapport qui correspond à la fin de l'analyste. Quand un id CF de 4,6 mm est utilisé, par exemple, il est souvent commode de régler le rapport comme étant soit 43:57 ou 21:79 (centre: périphérique) pour émuler une colonne «virtuelle» de 3,0 mm id ou colonne id 2,1 mm,avec respect. De cette façon, les performances de séparation est facilement banc marqué. Le rapport de segmentation est mesurée par pesée de la quantité d'écoulement sortant du détecteur qui est relié à l'orifice central et le débit sortant du port périphérique pendant une période de temps. Le flux de pourcentage à travers chaque orifice peut alors être déterminée et le rapport peut être ajusté en modifiant la longueur du tube attaché ou en utilisant un tube ayant un diamètre intérieur différent (id).

Ce protocole vidéo détaille les procédures d'exploitation et d'optimisation d'une colonne CF pour une meilleure performance chromatographique.

Protocole

Attention: S'il vous plaît se référer à des fiches de données de sécurité (FDS) pour tous les matériaux et réactifs avant utilisation (c. -à- FS pour le méthanol). Assurer l'utilisation de toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de la manipulation des solvants et chromatographie liquide haute performance (HPLC) éluant. Veiller à l'utilisation appropriée des contrôles techniques de HPLC analytique équilibre et détecteur instrumentation, et d'assurer l'utilisation des équipements de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse, pantalon de longueur, et des chaussures fermées).

Remarque: Ce protocole contient des instructions sur la façon d'utiliser une colonne de CF sur un système de CLHP couplée à un détecteur UV-Vis. Le protocole a été écrit en supposant que le lecteur a des connaissances de base et de l'expérience en chromatographie.

1. Mise en place d'HPLC Instrument

Remarque: Cette section peut être modifiée pour répondre aux besoins des analystes, à savoir, le choix des solvants, détecteur de longueur d' onde et le débit quisont appropriées pour l'échantillon d'intérêt.

1. Préparer l'instrument de HPLC avec 100% d' eau ultrapure (par exemple, l' eau Milli-Q) pour la ligne A et 100% de méthanol pour la ligne B comme phase mobile et purger les pompes selon les exigences du fabricant.
2. Réglez le détecteur UV-Vis à 254 nm.
3. Choisissez soit un mode de répartition du flux pré-injection de set-up, ou un double débit de la pompe set-up. Pour le mode split-flow passer à l'étape 2, pour le mode de pompe double passez à l'étape 3.

Configuration du système 2. Split-débit

1. Débrancher la ligne de pompe de la valve d'injection de l'échantillonneur automatique.
2. Joindre une pièce en T à la ligne de la pompe.
3. Fixer un morceau de 0,13 mm id tube de 15 cm à chaque port de la pièce en T.
4. Connecter un tube de la pièce en T à l'injecteur valve d'auto-échantillonneur.
5. Réglez la pompe à 1,0 ml min ^-1.
6. Avant la connexion des lignes de pompe à l'entrée de la colonne CF, régler le rapport de segmentation de l'écoulement à 40%: 6 0% (ligne médiane: ligne périphérique) comme suit dans l'étape 2.7.
7. Tuning du rapport d'entrée CF sur le système d'écoulement divisé
   1. Mesurer la masse de deux collecte des récipients vides en utilisant une balance analytique et étiqueter un récipient collecteur central et une autre périphérique (un pour la ligne de l'auto-échantillonneur pour centrer le port et l'autre pour la ligne de la pièce en T au port périphérique) .
   2. Pour 1,0 min, recueillir la phase mobile sortant de la ligne venant de l'injecteur (au point qui sera relié à la colonne) dans le récipient de collecte, dont la masse a été mesurée en 2.7.1.
   3. Peser le récipient de collecte à l'échelle analytique et déterminer la masse de phase mobile recueillies.
   4. Répéter les étapes 2.7.2 à 2.7.3 pour l'éluant sortant de la ligne à partir de la pièce en T qui doit être raccordé au port périphérique.
   5. Déterminer le pourcentage d'écoulement (ml.min ^-1) à partir de chaque ligne d'écoulement selon les équations suivantes:
      1 "src =" / files / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg "/>
   6. Réglez le rapport de débit à 40%: 60% (± 2%) (ligne de l' injecteur à orifice central: la ligne de T-pièce au port périphérique). Si la ligne de l'injecteur vers le centre du pourcentage d'écoulement d'orifice est supérieure à 40%, d' augmenter la perte de charge en diminuant le diamètre intérieur du tube, ou en augmentant sa longueur. Si la ligne de l' injecteur central de pourcentage d'écoulement d'orifice est inférieur à 40%, d' augmenter le diamètre interne du tube ou de diminuer la longueur du tube.
   7. Une fois que les rapports de débit sont réglés tourner la pompe, hors tension.
   8. Connecter la ligne de l'injecteur à l'orifice central de l'entrée de la colonne et la ligne de la pièce en T vers le port périphérique de l'entrée de la colonne.
   9. Rampe lentement le débit à 1,0 ml min ^-1 à 100% en ligne B.
   10. Équilibrer la colonne (4,6 mm de longueur id x 100 mm) en laissant100% de methanol (ligne B) de la phase mobile de circuler à travers la colonne à 1,0 ml min - ¹ pendant 10 min. Ce temps est mis à l'échelle en fonction des dimensions des autres colonnes, l'utilisateur peut employer.
   11. Pour le réglage de la sortie CF passez à l'étape 4. «Tuning du flux de sortie CF '.

Configuration 3. Système de pompe double

1. Brancher la pompe du système de HPLC à l'injecteur, puis connectez la ligne de l'injecteur à l'orifice d'entrée central de la colonne.
2. Brancher la pompe supplémentaire directement au port périphérique d'entrée de la colonne. Notez que cette deuxième pompe-circuite l'injecteur.
3. Rampe du débit de la pompe du système connecté au port central de débit à 0,4 ml min ^-1 (représentant 40% du débit total de 1,0 ml min ^-1) à 100% de méthanol (ligne B).
4. En même temps que l' étape 3.3, augmente ou diminue la vitesse de la pompe à écoulement périphérique de 0,6 ml min ^-1 (représentant 60% du débit total de1,0 ml min ^-1) à 100% de méthanol (ligne B).
5. Équilibrer la colonne (4,6 mm de longueur id x 100 mm) en permettant à 100% de methanol (ligne B) de la phase mobile à circuler à travers la colonne à 1,0 ml min - ¹ pendant 10 min. Ce temps est mis à l'échelle en fonction des dimensions des autres colonnes, l'utilisateur peut employer.
6. Pour le réglage de la sortie CF passez à l'étape 4. «Tuning du flux de sortie CF '.

4. Tuning des FC Outlet Débit

1. Connecter le port de sortie centrale vers le détecteur UV-visible à l'aide d'un morceau de 0,13 mm id tube 15 cm.
2. Connecter un morceau de 0,13 mm id tube de 15 cm de l'orifice de sortie périphérique de la colonne FC.
3. Peser la masse de deux navires de collecte vides sur la balance analytique et étiqueter un récipient central et l'autre périphérique.
4. Pour 1,0 min, recueillir la phase mobile sortant du détecteur (écoulement central) UV-Vis dans l'étiquette de récipient de collecte central, dont la masse a été mesurée en 4.2.
5. Peser le récipient de collecte contenant l'éluant recueilli à l'échelle analytique et déterminer la masse de phase mobile recueillies.
6. Répéter les étapes 04.04 à 04.05 pour l'éluant sortant de la ligne à partir de l'orifice de sortie périphérique.
7. Déterminer le pourcentage de l'écoulement de chaque ligne d'écoulement selon les équations suivantes:
   
8. Régler le rapport d'écoulement à 21%: 79% (± 2%) (débit de sortie central de l' UV-Vis: Débit de sortie périphérique de la ligne). Si le pourcentage d'écoulement central de l'UV-Vis est supérieure à 21%, d' augmenter la chute de pression en diminuant le diamètre intérieur du tube fixé à la sortie du détecteur UV-Vis, ou en augmentant sa longueur. Si le pourcentage d'écoulement central de l'UV-visible est inférieure à 21%, d'augmenter le diamètre intérieur du tube fixé à la sortie du détecteur UV-Vis, ou diminuer la longueur du tube. A chaque fois que la longueur du tube a été changé, répéterétapes 04/03 à 04/07.
   Remarque: La colonne CF en mode id 2.1 mm «virtuel» est prêt pour l'analyse.

Résultats

Colonnes AFT ont été développés en utilisant une conception de fritte spécialisée (figure 1) dans la colonne multiport embouts pour surmonter la colonne lit hétérogénéité et d' améliorer les performances de séparation. Une étude inter-laboratoire sur les performances de séparation des colonnes de chromatographie FC (figure 2) a été réalisée avec un double système de pompe mis en place (figure 3B) comme décrit dan...

Discussion

Cette étude a porté sur l'analyse inter-laboratoires des colonnes de chromatographie des FC pour tester les performances d'analyse en termes d'efficacité et de sensibilité. La colonne CF a été mis en place avec un système de pompage double comme décrit dans la section «3. Système de pompe à double mis en place "pour obtenir un rapport d'écoulement de 40:60 (centre: périphérique) à l'entrée de la colonne FC. Le 40:60 (centre: périphérique) rapport de débit a été atteint en r?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC instrument
Additional Pump			Required if 2 pump CF system set up is to be used.
Curtain Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialized
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels
T-piece	Any brand