Vorhang-Flow-Säule: Optimierung der Effizienz und Empfindlichkeit

Zusammenfassung

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Zusammenfassung

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Einleitung

In den letzten Jahren Säulentechnologie für High Performance Liquid Chromatography (HPLC) hat große Fortschritte gemacht; Spitzenleistungen haben sich vor allem dank der Verwendung von kleineren Partikelgrößen und den effizienteren Kern-Schale-Teilchen erhöht. Da Trennungen im Allgemeinen effizienter sind, einen Strömungs-Effekt der Steigerung der Empfindlichkeit seit Peaks nun schärfer sind und somit höher ^1-8.

Dennoch ist das radiale Bett Heterogenität immer noch ein limitierender Faktor bei der Erfüllung aller Spalten, aber dies ist keine neue Geschichte seit chromatographers dies seit vielen Jahren bekannt. Spalte Betten sind heterogen in sowohl radialer Richtung ^9-12 und entlang der Spaltenachse ^10,12-15. Die Wand-Effekt vor allem ist ein wichtiger Faktor für den Verlust der Trennleistung ^7,16-18. Shalliker und Ritchie ⁷ kürzlich Aspekte der Säulenbett Heterogenität überprüft und daher muss dies nicht sein discussed hier weiter. Obwohl es genügt zu sagen, dass die Variation in Säulenbettpackungsdichte und die Wandeffekte zu einer Verzerrung des gelösten Stoffes Stecker führen, so dass Bänder durch die Säule in Stecker eluieren , die Suppe teilweise gefüllt ähneln Schalen anstatt dünne flache feste Scheiben ^7, die in der Regel in grundlegende Lehre Texte dargestellt. Wenn Versuche unternommen wurden, so dass der gelöste Stoff Wanderung durch das Bett in der Säule die Steckprofile sichtbar gemacht werden konnten, waren teilweise hohl und der Tailing Abschnitt des Bandes ist weitgehend die Wandkomponente des Beispiel-Plug. Das Endergebnis ist , dass es viel mehr Platten zu trennen , diese 'teilweise hohl' Stecker nimmt als erforderlich wäre , wenn die Scheiben waren solide und flach ^12,14,17. Um die Bandenverbreiterung Fragen im Zusammenhang mit Wandeffekte und der Variation der Radialpackungsdichte, eine neue Form der Säulentechnologie bekannt als Aktive Flow Technology (AFT) überwunden wurde ^7,19 entworfen. Der Zweck dieser Konstruktion warWandeffekte durch die physische Trennung von Lösungsmittel eluierenden entlang der Wandbereich, von der der mobilen Phase eluiert wird in der radialen Mittelbereich der Säule ¹⁹ zu entfernen. Es gibt zwei Haupttypen von AFT Spalten; Parallel Segmented Flow (PSF) Spalten und Curtain Flow (CF) Spalten ^7. Da dieses Protokoll bei der Verwendung und Optimierung von CF Spalten ausgerichtet ist, wird nicht PSF Spalten weiter diskutiert.

Curtain Flow (CF)

Curtain Flow (CF) -Säule Formate verwenden AFT End-Fittings sowohl dem Einlass und dem Auslass der Säule. AFT End-Armaturen bestehen aus einer ringförmigen Fritte innerhalb eines Multiport-Fitting befindet. Die Fritte besteht aus drei Teilen: einem porösen radial zentralen Abschnitt, der mit dem zentralen Anschluss der Endarmatur, einem porösen äußeren Teil ausgerichtet ist, die mit der Peripherieschnittstelle (n) des Endstückes und einer undurchlässigen Ring ausgerichtet ist, dass trennt die beiden porösen Teile irgendwelche Quer verhindern-flow zwischen den radial zentralen und äußeren Bereichen der Fritte ^19, Fig . 1 die Konstruktion der AFT Fritte zeigt und Figur 2 veranschaulicht die CF Spaltenformat. In dieser Betriebsart (CF) wird die Probe in die radiale zentrale Öffnung des Einlasses injiziert Einbau, während zusätzliche mobile Phase wird durch die Umfangsöffnung des Einlaß einzuführenden "Vorhang" die Wanderung der gelösten Stoffe durch den radial mittleren Bereich des Spalte. Daher tritt die Probe das Bett in der radialen Mittelbereich der Säule mit dem äußeren Bereich der Kolonne mobilen Phase nur durchströmt ist. Studien haben gezeigt , dass ein Volumenstrom - Verhältnis von etwa 40:60 (central: Peripherie - Anschluss) für das Einlassende sitz eines 4,6 mm Innendurchmesser (id) Spalte optimale ^6,7,16 ist. Die AFT Ausgang der CF-Säule ermöglicht die Anpassung des zentralen und peripheren Strömungs ihrem relativen Anteil und kann auf fast jede gewünschte rati variiert werdeno durch Druckmanagement. Die Optimierung einer CF Säule kann verschiedene funktionale Aspekte der Säulentechnologie, wie Abscheidegrad oder Nachweisempfindlichkeit signifikant verbessern. Auf diese Weise wird eine "wandlosen", "unendlich-Durchmesser" oder "virtuelle" Spalte ^6,10,18,20 etabliert. Der Zweck CF Spalten ist aktiv, die Migration von Probe durch die Säule zu verwalten, die Probe zu verhindern, dass der Wandbereich erreicht. Somit wird die Konzentration des gelösten Stoffes beim Austritt zu dem Detektor maximiert, Erhöhung der Empfindlichkeit von etwa 2,5 mal größer als die herkömmlichen Säulenformat wenn ultraviolette (UV) Detektion unter Verwendung von ^16, und noch mehr , wenn ⁶ Massenspektralanalyse Detektion.

CF Säulen sind ideal für niedrige Konzentration Proben geeignet, da die Nachweisempfindlichkeit erhöht wird. Sie sind ferner ideal , wenn gekoppelt Rate begrenzt Detektoren, wie beispielsweise das Massenspektrometer (MS) ⁶ fließen. Ein AFT-Säule in einem 4,6 mm-ID-Format, kann beispielsweise abgestimmt werden, um das gleiche Volumen Lösungsmittel zu einem Detektor als Standard 2,1 mm ID-Format Spalte, wenn an den gleichen linearen Geschwindigkeiten betrieben zu liefern, durch Verlassen zentralen Strömungs auf 21% eingestellt wird. Ebenso ist die AFT Spalte auch abgestimmt werden, um das gleiche Volumen Belastung auf einen Detektor als 3,0 mm ID-Säule, durch die Einstellung Verlassen zentralen Strömungs auf 43% zu liefern. In der Tat könnte eine "virtuelle" Spaltenformat erzeugt werden ^6,18,22 die analytische Anforderung gerecht zu werden . Unter Verwendung dieser speziell End-Armaturen am Einlass und dem Auslass sorgt dafür, dass eine wahre wandlosen Säule hergestellt wird.

Es gibt zwei Möglichkeiten , um die Lösungsmittelfördersystem an die zentralen und peripheren Ports des Einlasses einzurichten:. Split-Flow - System ⁶ und zwei Pumpsystem ^6,7 Abbildung 3 jedes dieser Satz ups CF - System zeigt.

Split-Flow - System

ichna split-Strömungssystem (3A) die Strömungspumpe mit dem Injektor führende gespalten pre-Injektor einen Null-Totvolumen - T-Stückes, wo der mobilen Phase einen Fließstrom mit dem Injektor verbunden ist, die dann an den verbundenen zentrale Öffnung des Einlaßendes sitz der Säule. Der zweite Durchflussstrom der mobilen Phase-Bypässe den Injektor und an die Peripherieschnittstelle an dem Einlass der Säule verbunden. Während des Spaltströmungs wird der Strömungsstrom Prozentsatz bis 40:60 (Mitte: peripher) eingestellt , bevor die Leitungen mit der Säule verbunden sind, dh von Injektors peripher zu zentrieren und zu pumpen.

Zwei Pumpsystem

Die CF-Säule erfordert zwei Fließströme an dem Einlaßende sitz der Säule. Je nach Art der Probengeber / Injektor des HPLC - Instrument, Split-Flow einrichten kann nicht möglich sein, und so CF kann dann durch zwei Pumpen (3B ²¹⁾ erreicht werden ,. Jede Pumpe zugeordnet ist und die entweder mit dem zentralen oder peripheren Anschluss und die Strömungsgeschwindigkeit wird 40% der Strömung für die zentrale Port und 60% für die Peripherieschnitt darzustellen. Wenn beispielsweise die Gesamtdurchflussrate von 1,0 ml min ^-1 ist, wird die zentrale Pumpenströmungsrate auf 0,4 ml min ^-1 eingestellt und die Umfangs Pumpe auf 0,6 ml min ^-1 eingestellt.

Die Wahl des Betriebsmodus ist weitgehend abhängig von der HPLC Instrumentierung und chromatographische Wirkungsweise. Zum Beispiel in einigen Autosampler eine Druckänderung zwischen den Probenladeposition und Probe injizieren Position des Split-Flow-Verhältnis zu stören und somit in diesem Fall eine Doppelpumpe aufgebaut werden würde für eine optimale Leistung CF auftreten kann empfohlen. Unabhängig von der Lösungsmittelabgabesystem eingerichtet gewählt für den Einlass der CF-Säule, die CF-Ausgang Optimierung bleibt gleich. Der Auslass zentralen Port des CF Spalte wird der UV-VIS (UV-Vis) -Detektor mit der Smal befestigtdamit Volumen möglich Rohr die Auswirkungen der säulennachgeordneten Totvolumen zu minimieren. Da CF Säulen mit enger Bohrung Spalten emulieren Totvolumen zwischen dem Säulenausgang und dem Detektor ist die Trennleistung der Säule CF schädlich. Es ist entscheidend, die kleinste Menge an Volumen des Schlauchs zwischen dem zentralen Anschluss und dem UV-Vis-Detektor zur Minimierung der Auswirkungen von Totvolumen wie Bandverbreiterung, Verlust an Effizienz und Empfindlichkeit zu gewährleisten. Daher ist die Verwendung von engen Bohrung Schlauch (0,1 mm ID) empfohlen, leicht Druckeinstellungen ermöglichen, ohne unangemessene Totvolumen hinzufügen. Tubing ist auch an den Peripherieanschluss und gerichtet angebracht zu verschwenden. Nach dem Austritt der CF-Säule kann das Segmentierungsverhältnis zu jedem Verhältnis eingestellt werden, die den Zweck des Analytikers passt. Wenn ein 4,6 mm-ID CF verwendet wird, zum Beispiel, ist es oft praktisch ist das Verhältnis als entweder 43:57 oder 21:79 (Mitte: periphere) zur Einrichtung einer "virtuellen" 3,0 mm ID-Säule oder 2,1 mm ID-Säule zu emulieren,respektvoll. Auf diese Weise die Trennleistung ist leicht Bank markiert. Der Segmentierungsverhältnis wird durch Wiegen der Menge des Flusses gemessen von dem Detektor austritt, die mit dem zentralen Anschluss verbunden und fließen, um die Peripherieschnittstelle über einen Zeitraum Zeit verlassen. Der Prozentsatz Fluss durch jeden Port kann dann bestimmt werden, und die Verhältnisse durch Änderung der Länge der Rohrleitung befestigt oder mit Hilfe von Schläuchen, die einen unterschiedlichen Innendurchmesser (id) hat eingestellt werden.

Dieses Video-Protokoll beschreibt die Bedienung und Optimierungsverfahren von einer CF-Säule für eine verbesserte chromatographische Leistung.

Protokoll

Achtung: Bitte beachten Sie Sicherheitsdatenblätter (MSDS) für alle Materialien und Reagenzien vor der Verwendung (dh MSDS für Methanol). Achten Sie darauf, den Einsatz aller geeigneten Praktiken Sicherheit bei Lösungsmitteln und High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Eluent Handhabung. Stellen Sie sicher, angemessene Nutzung von Engineering-Kontrollen von HPLC, Analysenwaage und Detektor Instrumentierung, und sorgen für die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe).

Hinweis: Dieses Protokoll enthält Anweisungen, wie eine CF-Säule auf einem HPLC-System mit einem UV-Vis-Detektor gekoppelt zu verwenden. Das Protokoll geschrieben wurde unter der Annahme der Leser grundlegende Kenntnisse und Erfahrung in der Chromatographie hat.

1. Aufbau von HPLC-Instrument

Hinweis: Dieser Abschnitt kann geändert werden Bedürfnisse der Analysten zu entsprechen, das heißt, die Wahl der Lösungsmittel, Detektorwellenlänge und Geschwindigkeit Fluss,sind auf die Probe von Interesse geeignet ist.

1. Bereiten Sie die HPLC - Instrument mit 100% Reinstwasser (zB Milli-Q - Wasser) für die Linie A und 100% Methanol Linie B als mobile Phase und reinigen die Pumpen nach Hersteller Anforderung.
2. Stellen Sie die UV-Vis-Detektor auf 254 nm.
3. Wählen Sie entweder eine Voreinspritzung Flow Split-Modus von Set-up oder eine Doppelpumpenfluss Set-up. Für die Split-Flow-Modus gehen Sie zu Schritt 2, für die Doppelpumpenmodus mit Schritt 3 fortfahren.

2. Split-Flow-System-Setup

1. Trennen Sie die Pumpenleitung vom Einspritzventil des Autosampler.
2. Bringen Sie ein T-Stück an die Pumpenleitung.
3. Bringen Sie ein 15 cm großes Stück von 0,13 mm id Schlauch an jeden Port des T-Stück.
4. Schließen Sie ein Rohr aus dem T-Stück Ventil der Autosampler zu Injektor.
5. Stellen Sie die Pumpe auf 1,0 ml min ^-1.
6. Vor dem Anschluss Pumpenleitungen mit dem Einlass der CF-Säule, tune das Segmentierungsverhältnis der Strömung zu 40%: 6 0% (Mittellinie: Umfangslinie) wie folgt in Schritt 2.7.
7. Tuning von CF Einlass-Verhältnis auf Split-Flow-System
   1. Messen Sie die Masse von zwei leeren Sammelbehältern einer Analysenwaage mit und beschriften ein Sammelgefäß zentrale und die andere Peripherie (eine für die Zeile aus dem Autosampler-Port und eine für die Linie von dem T-Stück zu Peripherie-Anschluss zum Zentrum) .
   2. Für 1,0 min, sammeln den austretenden mobilen Phase von der Linie aus dem Injektor kommen (an der Stelle, die mit der Säule verbunden wird) in den Auffangbehälter, dessen Masse in 2.7.1 gemessen.
   3. Erneut wiegen die Sammelbehälter im analytischen Maßstab und bestimmen die Masse der mobilen Phase gesammelt.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 2.7.2 für den Eluenten 2.7.3 die Zeile aus dem T-Stück austritt, die an den Peripherieanschluss verbunden werden soll.
   5. Bestimmen den Anteil der Strömung (ml min ^-1) aus jeder Zeile der Strömung gemäß den folgenden Gleichungen:
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   6. Stellen Sie den Stromverhältnis auf 40%: 60% (± 2%) (Leitung vom Injektor zum zentralen Anschluss: Linie von T-Stück zu Peripherie - Anschluss). Wenn die Zeile von dem Injektor zu dem zentralen Lochströmungs Prozentsatz über 40% ist, erhöhen den Druckabfall durch den Innendurchmesser des Schlauchs abnimmt, oder die Erhöhung seiner Länge. Wenn die Linie von Injektors zentralen Port Strömungs Prozentsatz unter 40% ist, erhöhen Innendurchmesser des Schlauchs oder der Länge des Rohrs zu verringern.
   7. Sobald die Strömungsverhältnisse abgestimmt setzen Sie die Pumpe fließen.
   8. Schließen Sie die Leitung vom Injektor zum zentralen Anschluss des Säuleneingang und der Leitung vom T-Stück an den Peripherieanschluss des Säuleneingang.
   9. Rampe langsam die Fließgeschwindigkeit auf 1,0 ml min ^-1 bei 100% Linie B.
   10. Äquilibrieren der Säule (4,6 mm ID x 100 mm Länge), indem100% Methanol (Linie B) mobile Phase fließt durch die Säule bei 1,0 ml min ^-1 für 10 min. Diese Zeit wird skaliert entsprechend den Abmessungen anderer Spalten der Benutzer verwenden kann.
   11. Gehen Sie für die Abstimmung des CF-Auslass 4 'Tuning von CF Abstrom' zu Schritt.

3. Dual-Pump System-Setup

1. Schließen Sie das HPLC-System Pumpe zum Injektor und schließen dann die Leitung vom Injektor zum zentralen Einlassöffnung der Säule.
2. Schließen Sie die zusätzliche Pumpe direkt mit dem Einlass Peripherieschnittstelle der Kolonne. Beachten Sie, dass diese zweite Pumpe den Injektor-Bypässe.
3. Rampe die Strömungsgeschwindigkeit des Systempumpe mit dem zentralen Anschluss angeschlossen bis 0,4 ml min ^-1 (repräsentativ für 40% der Gesamtströmungsrate von 1,0 ml min ^-1) bei 100% Methanol (Linie B).
4. Zur gleichen Zeit wie Schritt 3.3, Rampe der Flussrate des peripheren Pumpe auf 0,6 ml min ^-1 (repräsentativ für 60% der Gesamtströmungsgeschwindigkeit von1,0 ml min ^-1) bei 100% Methanol (Linie B).
5. Äquilibrieren der Säule (4,6 mm ID x 100 mm Länge) , indem sie 100% Methanol (Linie B) mobile Phase durch die Säule fließen bei 1,0 ml min ^-1 für 10 min. Diese Zeit wird skaliert entsprechend den Abmessungen anderer Spalten der Benutzer verwenden kann.
6. Gehen Sie für die Abstimmung des CF-Auslass 4 'Tuning von CF Abstrom' zu Schritt.

4. Tuning von CF Ausgang Fluss

1. Schließen Sie den zentralen Austrittsöffnung mit dem UV-Vis-Detektor ein 15 cm großes Stück von 0,13 mm id Schlauch verwenden.
2. Verbinden eines 15 cm Stück von 0,13 mm id Schlauch an der peripheren Austrittsöffnung der CF-Säule.
3. Wiegen Sie die Masse von zwei leeren Sammelbehältern auf der Analysenwaage und beschriften Sie ein Gefäß zentrale und die anderen Peripherie.
4. Für 1,0 min, sammeln den austretenden mobilen Phase aus dem UV-Vis-Detektor (Mittelfluss) in den Auffangbehälter Etikett zentrale, dessen Masse in 4,2 gemessen.
5. Erneut wiegen die Sammelbehälter des gesammelten Eluenten im analytischen Maßstab und bestimmen die Masse der mobilen Phase gesammelt enthält.
6. Wiederholen Sie die Schritte 4,4-4,5 für das Eluierungsmittel die Leitung von der peripheren Austrittsöffnung austritt.
7. Bestimmen den Prozentsatz der Strömung von jedem Strömungslinie gemäß den folgenden Gleichungen:
   
8. Stellen Sie den Stromverhältnis auf 21%: 79% (± 2%) (zentrale Abstrom von UV-Vis: periphere Abstrom aus der Leitung). Wenn der zentrale Strömung Prozentsatz von der UV-Vis von über 21%, erhöhen Sie den Druckabfall durch den Innendurchmesser der Rohrleitung zum Ausgang des UV-Vis-Detektor angebracht Verringern oder Erhöhen seiner Länge. Wenn der zentrale Strömungs Prozentsatz vom UV-Vis unter 21% ist, erhöhen Innendurchmesser der Rohrleitung zum Ausgang des UV-Vis-Detektor angebracht ist, oder die Länge des Rohres zu verringern. Jedesmal, wenn die Rohrlänge geändert wurde, repeatSchritte 4,3-4,7.
   Hinweis: Die CF-Spalte in "virtuellen" 2,1 mm-ID-Modus für die Analyse bereit ist.

Ergebnisse

AFT Säulen wurden mit einem speziellen Fritte Design (Abbildung 1) in den Multiport - Säulenende-Armaturen entwickelt , um die Säulenbett Heterogenität überwinden und Trennleistung zu verbessern. Ein Interlabor - Studie über die Trennleistung von CF - Chromatographiesäulen (Abbildung 2) wurde mit einem Doppelpumpensystem eingerichtet (3B) durchgeführt , wie in Abschnitt 3 dieses Protokolls ²³ beschrieben. Ein Drei-Komp...

Diskussion

Diese Studie umfasste die Inter-Laboranalyse von CF Chromatographiesäulen die analytische Leistungsfähigkeit in Bezug auf Effizienz und Empfindlichkeit zu testen. Die CF-Säule wurde mit einem Doppelpumpsystem eingerichtet, wie im Abschnitt '3 beschrieben. Doppelpumpensystem eingerichtet 'ein Stromverhältnis von 40:60 zu erreichen (Mitte: periphere) am Einlass der CF-Säule. Das 40:60 (Mitte: periphere) Flussverhältnis wurde durch Einstellen der Flussrate jeder Pumpe auf den Wert erreicht, 40% und 60% der Ge...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC instrument
Additional Pump			Required if 2 pump CF system set up is to be used.
Curtain Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialized
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels
T-piece	Any brand