高分辨率定量免疫膜受体在视网膜带状突触分析

摘要

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

摘要

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

引言

谷氨酸是在视网膜^1中的主要兴奋性神经递质。视网膜神经节细胞（RGC）中，从双极^电池 2接收的谷氨酸突触输入，是视网膜的输出神经元发送视觉信息到大脑。生理学研究表明，视网膜神经节细胞突触激励是通过NMDA受体（NMDA受体）和AMPA受体（的^{AMPARs）3,4,5}突触后介导的。虽然在视网膜神经节细胞兴奋性突触后电流（EPSCS）通过的AMPARs NMDA受体和介导视网膜神经节细胞^{-1,3,5,6,7,8-，}自发微型EPSCS（mEPSCs）只呈现一个的AMPARs介导的分量^4,5,9。然而，减少摄取谷氨酸自发EPSCS ⁵透露出一股NMDA受体成分，这表明在研资局树突NMDA受体可能位于兴奋性突触之外。膜相关鸟苷酸激酶（MAGUKs）如PSD-95该集群神经递质受体，包括谷氨酸盐受体和离子通道■在突触部位，也表现出明显的subsynaptic表达模式^{10,11,12,13,14。}

近几十年来，共焦免疫组织化学和预嵌入型电子显微镜（EM）的免疫组化已被用于研究膜受体的表达。虽然共焦免疫染色揭示受体表达的宽图案，其较低的分辨率使得不可能使用来区分的亚细胞位置。在哺乳动物视网膜预嵌入-EM研究表明NMDA受体亚基存在于视锥双极细胞带状突触^15,16,17突触后的元件。这是明显的对比，以生理学证据。然而，反应产物的扩散是在预嵌入免疫过氧化物酶方法的公知的构件。因此，这种方法通常不会给统计上可靠的数据和可以排除国产化的区分突触膜与膜突触外^{18,19,20,21。}上另一方面，生理和解剖数据与的AMPARs对视网膜神经节细胞^3,5,7,9,22突触定位相一致。因此，谷氨酸受体和MAGUKs在视网膜色带突触本地化不仅对突触后也给perisynaptic或突触外膜隔室。然而，仍然需要在视网膜色带突触这些膜蛋白的高分辨率定量分析。

在这里，我们开发了一种postembedding EM免疫技术检测​​NMDA受体亚基，AMPAR亚基和PSD-95接着在突触到大鼠视网膜神经节细胞估算这些蛋白的数量，密度和可变性的subsynaptic定位用霍乱毒素B亚基标记的（CTB）逆行追踪方法。

研究方案

保养和动物的处理均符合NIH动物护理和使用委员会的准则。产后天（P）15-21 SD大鼠，通过双边上丘用1-1.2％CTB注入，维持在12:12小时光照:黑暗周期。

1.视网膜组织固定

1. 组装以下材料和工具:解剖显微镜，2钳很细的技巧，剪刀，纤维素滤纸，塑料吸管和显微镜载玻片。
2. 麻醉大鼠与2.0毫升氟烷（吸入剂麻醉剂）的密闭室。确定由这些方法适当麻醉:缺少脚趾捏，或缺乏瞬目反射的后爪后撤回。然后用断头台斩首立即。有一对虹膜剪的并发生在在pH7.4含0.1M磷酸盐缓冲液（PB）的4％多聚甲醛的玻璃培养皿中移除眼睛。
3. 使用解剖显微镜，取出玉米通过切断眼球的前面EA。移除钳的内视网膜表面的晶状体和玻璃体。
4. 剥离与两个镊子巩膜直至视网膜被从眼罩隔离。
5. 立即切断视网膜为100 - 200微米厚的带用剃刀，并受pH值移固定。
6. 在20 pH 6.0的固定在4％低聚甲醛视网膜条在0.1M PB - 30分钟，然后在4％多聚甲醛加0.01％戊二醛在10 pH值10.5 - 在RT 20分钟。
7. 在PB中几次洗涤用0.15毫_氯化钙 （pH为7.4，在4℃）后，加入（每次60分钟，在10％，20％，30％，然后在30％的O / N）的cryoprotect与甘油视网膜带M在0.1 PB冻结取代前。

2.冻结替代

注:此冷冻替代法从早期公布的协议^19,20修改。此外，它是至关重要的工具是非常冷（戴手套） Øtherwise，当与文书触摸的组织可以部分解冻。所有这些步骤都在AFS室中完成，该仪器是决不允许移动腔室的边缘的上方。同样地，在AFS中使用的所有化学品的适当的冷却是必要的。

1. 切入冻结在冷冻保存EM仪（CPC）的液态丙烷视网膜条在-184℃。用细刷，放置在小片双面胶带附着到去推插杆的端部的金属短截线的样品（使用刷子灯芯关闭额外缓冲液）。
2. 扎杆进入液体丙烷，并保持在那里大约5秒，然后转移到使用填充有液氮的小传输室中的自动冷冻替代仪（AFS）（'LN ₂冷却冷冻传送容器'）。
3. 将冷冻的样品和仪器（镊子和手术刀）进入AFS后，冷却仪器在室本身veral分钟触摸组织，或通过将仪器的提示几秒钟到小型运输腔冷却之前（充满液氮（"LN ₂冷却冷冻集装箱转移'））。
4. 一旦在AFS，用细手术刀去除存根样品和磁带。另外，保持氮气流控制，TF（TF被描述为"调节器控制为LN ₂汽化器'）在这些过程中打开。
5. 之前放置冷冻组织成平嵌入持有者（即，设置在AFS之前），切细圆由透明塑料片材，将其放入保持器的底部，以便行的每个孔的底部。这使得相对容易去除聚合标本块完成时。
   注意:在此之前，我们使用的另一种方法的扁平包埋持有者，并采用双赖克特+明胶胶囊（见佩特拉里亚和Wenthold，1999） ^20。
6. 使用在AFS（使用仪器术语）以下自动序列:T 1 = -90℃，32小时，S1 =增加温度由4℃/小时（11.3小时），T 2 = -45℃，50小时，S2 =增加温度由5℃/小时（9小时），T3 = 0℃下40小时（总共= 142.3小时）。它可能需要2 - 4小时放置在AFS样品（在-90℃）开始的定时序列之前。
7. 沉浸在甲醇1.5％乙酸双氧铀的冷冻切片在-90℃下，在与AFS> 32小时。将组织（典型值）在每一个七口井在平嵌入铝制支架的两片（三级融入AFS）。
   1. 放置组织+磁带入孔中的乙酸双氧铀/甲醇和后来除去胶带，只是之前开始包埋介质（如Lowicryl HM20）渗透，如果太难以从磁带除去组织。
8. 然后增加温度逐步提高至-45°C（+ 4°每个小时Ç;在自动序列）。
9. 洗样品三次在预冷的甲醇，通过使用细尖塑料吸管除去从每个平嵌入支架旧溶液，然后使用另一标准塑料吸管添加预冷新鲜甲醇。
10. 1和2:然后，用同样的方法，用低温包埋树脂，例如在1包埋介质（HM20 /甲醇逐渐渗入试样1，每2小时，接着纯树脂2小时，然后改变树脂并保持O / N）。
11. 第二天再次改变树脂，调整树脂的水平，以达到刚好至孔的顶部边缘。
12. 聚合样品（-45℃至0℃下在自动序列;每小时+ 5℃）用UV光40小时。
13. 然后从AFS样本。通常情况下，样本块仍然显示的颜色一定的粉红色。放置靠近的荧光在化学通风橱的样品中，在室温O / N或更长，直到它们的应用耳朵完全清楚。

3. Postembedding EM免疫免疫细胞化学

如上所述^23,24,25进行Postembedding免疫组化:注意 。

1. 切1微米的部分具有超薄，染色切片用1％甲苯胺蓝，检查是否有部分定位;东方的组织块，实现切片的最佳横向平面。
2. 削减70纳米厚的超薄切片与超薄和收集他们对涂层的Formvar碳镍槽网格。
3. 洗涤栅格在蒸馏水_{2 O}一次后跟的Tris缓冲盐水三次（TBS，0.05M的Tris缓冲液，0.7％氯化钠，pH值7.6）洗涤。
4. 孵育在TBS中的5％牛血清白蛋白的20微升液滴栅格30分钟，然后在含有山羊抗CTB的混合物的20微升液滴（1:3,000）和抗体的一个NMDA受体亚基（抗兔GluN2A一点50分，GluN2B 1:30），或抗兔GluA2 / 3（1:30）在TBS-的Triton（TBST，0.01％的Triton X-100，pH值7.6），用2％BSA和0.02M的_NaN 3的O / N在室温。
5. 在TBS的三个独立的滴（20微升）（pH为7.6）为10，10和20分钟的洗涤网格，随后的TBS（pH为8.2）中5分钟。
6. 孵育网格包含耦合到耦合到在TBST 18nm的金颗粒为10nm的金颗粒和驴抗山羊IgG（1:20）驴抗兔IgG（1:20）的混合物中的上滴2小时（20微升） （pH值8.2），用2％BSA和0.02M的_NaN 3的。
7. 洗网格在TBS的20微升液滴（pH为7.6）为5,5，和10分钟，然后在超纯水中，然后干燥。
8. 染液电网用5％的醋酸铀和0.3％的柠檬酸铅蒸馏水_{2 O}分别为黑暗条件下8和5分钟。
9. 为三重标记实验，孵化网格O / N在室温用抗山羊CTB的混合物20微升滴（1:3000），抗小鼠的PSD-95（1:100），和抗 - 兔GluN2A（1 :50）。然后孵育电网为2 2小时0的IgG耦合至18，10和5纳米的金颗粒在TBST（pH值8.2），用2％BSA和0.02M的_NaN 3的混合物的微升液滴。保持相同的程序作为双标记用于洗涤和之间和抗体孵育后复染。
10. 进行控制，其中二次抗体单独施用。
11. 在一个EM查看网格和数字化图像。处理在Adobe Photoshop 6.0 ​​最后数字仅用于亮度和对比度如果需要^24。

4.量化

1. 手动将内网层（IPL），而不在8,000X放大小孔或裂缝选择区域，然后随机蒙太奇IPL在25,000X放大倍率的全部深度。
2. 确定RGC树突在锥双极二人组合时，他们一）含有逆向转移CTB信号（大的金颗粒），B）表现出明确的膜裂，和突触后密度，C）至少包含两个小部分黄金PSD内icles，或沿突触外质膜多个小的金颗粒。
3. 收集45 - 55 RGC树突，根据上述条件，进行定量分析。
4. 测量PSD和个人RGC树突与美国国立卫生研究院的ImageJ软件的突触外质膜的长度。该膜作为10nm内计数的金颗粒膜结合的基础上，7的平均厚度- 9纳米为质膜^26。
5. 计算颗粒密度为每线性微米（金/微米）的金颗粒的数量。测量每个金颗粒的中心，并在PSD的中间（突触位置）或PSD的边缘（对于突触外位置）之间的距离。
6. 通过软件进行统计分析。使用双尾t检验来比较的手段。总结意义时，P <0.05。除非另有说明，报告值作为平均±SEM ^18。

结果

此处呈现的结果表明对大鼠视网膜RGC树突GluA 2/3的显着的不同subsynaptic本地化模式和NMDA受体，如先前^24,25说明。在RGC树突型材GluA 2/3免疫颗粒的77％分别位于所述PSD（图1A）内，类似于大多数中央突触。然而，NMDA受体都位于突触两种或extrasynaptically。 GluN2A免疫颗粒的83％在PSD分别定位（图1C，2A，2B），优先在关突触，而金颗粒更?...

讨论

我们已经描述了四种技术对于成功的定量后包埋免疫EM:1）短和弱固定，2）冷冻取代，3）后包埋免疫染色，以及4）定量。

EM免疫允许在超薄组织切片的特定蛋白质的检测。标记有金颗粒的抗体可以用EM直接可视化。而在检测细胞膜受体的subsynaptic本地化功能强大，EM免疫可以技术上具有挑战性，并要求组织固定和加工方法严谨的优化。

罢工膜的完整性和?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	EMS	15710
Glutaraldehyde	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glycerol	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	Dilution 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	Dilution 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	Dilution 1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1–046	Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles	EMS	25704	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles	EMS	25814	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles	EMS	25812	Dilution 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	Dilution 1/20
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids.	EMS	FCF2010-Ni
Uranyl acetate	EMS	22400-1
Methanol	EMS	67-56-1
Lead citrate	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultramicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
liquid nitrogen	Roberts Oxygen
Propane	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1 - 1.2%
Anti-CTB	List Biological Laboratories	703	Dilution 1/4,000