Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

Resumen

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Resumen

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

Introducción

El glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio en la retina ^1. Las células ganglionares de la retina (CGR), que reciben la entrada sináptica glutamatérgica a partir de células bipolares ^2, son las neuronas de salida de la retina que envían información visual al cerebro. Los estudios fisiológicos mostraron que la excitación sináptica de CGR está mediado por los receptores NMDA postsináptico (NMDAR) y los receptores de AMPA (AMPAR) ^3,4,5. Aunque las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) en CGR están mediados por AMPAR y NMDAR EPSCs ^3,5,6,7,8, miniatura espontáneas (mEPSCs) en CGR exhiben solamente un componente mediada por AMPAR ^4,5,9. Sin embargo, la reducción de la captación de glutamato reveló un componente NMDAR EPSCs en ⁵ espontáneas, lo que sugiere que los NMDAR en las dendritas de CGR, pueden estar situados fuera de las sinapsis excitatorias. guanilato quinasas asociadas a la membrana (MAGUKs) como PSD-95 que los receptores de neurotransmisores clúster, incluidos los receptores de glutamato y del canal iónicos en los sitios sinápticos, también presentan distintos patrones de expresión subsináptica ^{10,11,12,13,14.}

En las últimas décadas, la inmunohistoquímica confocal y pre-incrustación de microscopio electrónico de inmunohistoquímica (EM) se han empleado para estudiar la expresión del receptor de membrana. Aunque inmunotinción confocal revela patrones amplios de la expresión del receptor, su resolución más baja hace que sea imposible utilizar para distinguir localización subcelular. EM estudios pre-incrustación en la retina de mamíferos indican que las subunidades NMDAR están presentes en elementos postsinápticos en el cono bipolares sinapsis cinta celular ^15,16,17. Esto está en contraste con aparente evidencia fisiológica. Sin embargo, la difusión de producto de reacción es un artefacto bien conocido en el método de inmunoperoxidasa pre-incrustación. Por lo tanto, este enfoque no suele dar datos estadísticamente fiables y puede excluir distinción entre la localización en la membrana sináptica frente ^18,19,20,21 membrana extrasynaptic. EnPor otro lado, los datos fisiológicos y anatómicos son consistentes con una localización sináptica de AMPARs en CGR ^3,5,7,9,22. Por lo tanto, los receptores de glutamato y MAGUKs en sinapsis cinta de la retina se localizan no sólo a la postsináptica, pero también a los compartimentos de membrana perisynaptic o extrasinápticos. Sin embargo, aún es necesario un análisis cuantitativo de alta resolución de estas proteínas de membrana en una sinapsis cinta de la retina.

Aquí, hemos desarrollado una técnica postembedding EM inmunoelectrónica para examinar la localización subsináptica de subunidades NMDAR, subunidades de AMPAR y PSD-95, seguido de la estimación del número, la densidad y la variabilidad de estas proteínas en las sinapsis Onto CGR de rata marcado utilizando la toxina del cólera subunidad B (CTB) métodos de rastreo retrógrado.

Protocolo

El cuidado y manejo de los animales estaban en conformidad con el NIH Cuidado de Animales y directrices del Comité de Uso. el día postnatal (P) 15-21 ratas Sprague-Dawley, inyectados con 1-1,2% CTB bilateral a través del colículo superior, se mantuvieron en un 12: 12 horas de luz: oscuridad ciclo.

1. Fijación tejido de la retina

1. Reúna los siguientes materiales y herramientas: un microscopio de disección, 2 fórceps con puntas muy finas, tijeras, papel de filtro de celulosa, pipeta de plástico y un portaobjetos de microscopio.
2. Anestesiar la rata en una cámara cerrada con 2,0 ml halotano (un anestésico por inhalación). Determinar la anestesia adecuada por estos métodos: la falta de retirada de la pata trasera después pizca dedo del pie, o la falta de reflejo de parpadeo. Entonces decapitar inmediatamente con una guillotina. Quitar los ojos con un par de tijeras de iris y colocar en un recipiente de vidrio que contenía paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M (PB) a pH 7,4.
3. Utilizando el microscopio de disección, retire el maízea cortando la parte frontal del globo ocular. Retire la lente y el vítreo de la superficie de la retina interna con fórceps.
4. Pelar la esclerótica con las dos pinzas hasta que la retina se aísla de la copa ocular.
5. Cortar la retina inmediatamente en 100 - 200 tiras micras de espesor con una navaja de afeitar, y sujeto a la fijación cambio de pH.
6. Fijar tiras retina en 4% de paraformaldehído en 0,1 M PB a pH 6,0 para 20 - 30 min y después en paraformaldehído al 4% más 0,01% de glutaraldehído a pH 10,5 para 10 a 20 min a TA.
7. Después de varios lavados en PB con 0,15 mM CaCl ₂ (pH 7,4 a 4 ° C), cryoprotect las tiras de la retina con glicerol (60 min cada uno en 10%, 20%, 30%, a continuación, O / N en 30%) en 0,1 M PB antes de congelar sustitución.

2. Congelación de sustitución

NOTA: Este método de congelación-sustitución es una modificación de un protocolo publicado anteriormente ^19,20. Además, es fundamental que los instrumentos son muy fríos (use guantes); otherwise, el tejido puede descongelarse parcialmente cuando se toca con los instrumentos. Todos estos pasos se ejecutan dentro de la cámara de AFS y los instrumentos no se les permite moverse por encima del borde de la cámara. Del mismo modo, una refrigeración adecuada de todos los productos químicos utilizados en la AFS es necesario.

1. Sumir a congelar las tiras en la retina de propano líquido a -184 ° C en un instrumento de EM criopreservación (CPC). Usando un pincel fino, colocar las muestras en pequeños trozos de cinta adhesiva de doble cara unidos a los trozos de metal que van en el extremo de las barras se hunden (absorbe y expulsa fuera de amortiguación adicional con el pincel).
2. Sumir las varillas en el propano líquido y mantenerlo allí durante aproximadamente 5 segundos, y luego transferir al instrumento de congelación-sustitución automática (AFS), utilizando una pequeña cámara de transporte que se llena con nitrógeno líquido ( 'LN ₂ enfrió recipiente de transferencia crio').
3. Después de colocar la muestra congelada e instrumentos (fórceps y bisturí) en el AFS, enfriar los instrumentos en la cámara para SEminutos Veral antes de tocar el tejido, o enfriarlas mediante la colocación de las puntas de los instrumentos durante unos segundos en la cámara de transporte pequeño (lleno de nitrógeno líquido ( 'LN ₂ enfrió recipiente de transferencia crio')).
4. Una vez en la AFS, retire la muestra y el precinto de la colilla utilizando un bisturí fino. Además, mantener el control de flujo de gas de nitrógeno, TF (TF se describe como un "control regulador de LN ₂ vaporizador ') abierta durante estos procedimientos.
5. Antes de colocar el tejido congelado en los soportes-incrustación planas (es decir, antes de configurar el AFS), cortar un círculo delgada de una hoja de plástico transparente y colocarlo en la parte inferior del soporte de manera que se cubra el fondo de cada pocillo. Esto permite la eliminación relativamente fácil de los bloques de muestras polimerizadas cuando haya terminado.
   NOTA: Anteriormente, hemos utilizado un método alternativo a los titulares de incrustación planas, y el empleo de dobles cápsulas de gelatina + Reichert (véase Petralia y Wenthold, 1999) ^20.
6. Utilice la siguiente secuencia automática en el AFS (usando la terminología de instrumentos): T1 = -90 ° C durante 32 h, S1 = aumento de la temperatura en un 4 ° C / h (11,3 horas), T2 = -45 ° C durante 50 h, S2 = aumento de la temperatura en 5 ° C / h (9 horas), T3 = 0 ° C durante 40 horas (total = 142,3 horas). Se puede tomar de 2 - 4 horas para colocar muestras en el AFS (a -90 ° C) antes de comenzar la secuencia cronometrada.
7. Sumergir las secciones congeladas en acetato de uranilo al 1,5% en metanol a -90 ° C durante> 32 h en la AFS. Coloque dos piezas de tejidos (por lo general) en cada uno de los siete pozos en el soporte de aluminio-incrustación plana (tres encajar en el AFS).
   1. Coloque el tejido + cinta en la uranilo de etilo / metanol en los pocillos y se retire la cinta más tarde, justo antes de comienzo medio de inclusión (tales como Lowicryl HM20) infiltración, si es demasiado difícil de eliminar el tejido de la cinta.
8. A continuación, aumentar la temperatura por etapas a -45 ° C (+ 4 ° C por hora; en la secuencia automática).
9. Lavar las muestras tres veces en metanol preenfriada, mediante el uso de una pipeta de plástico de punta fina para eliminar la solución de edad de cada soporte de la incrustación de plano, y a continuación, utilizando otra pipeta de plástico estándar de añadir el metanol fresco enfriado previamente.
10. Luego, utilizando el mismo método, infiltrarse en las muestras progresivamente con resinas incrustación de baja temperatura como medio de inclusión (HM20 / metanol a 1: 1 y 2: 1, cada uno por 2 hr, seguido de resina pura durante 2 horas y a continuación, cambiar las resinas y mantener O / N).
11. Cambie la resina de nuevo el día siguiente, el ajuste del nivel de la resina para alcanzar sólo para el borde superior de los pocillos.
12. Polimerizar las muestras (-45 ° C a 0 ° C en secuencia automática; + 5 ° C por hora) con luz UV durante 40 h.
13. A continuación, retire las muestras de la AFS. Normalmente, los bloques de muestras todavía muestran cierta coloración rosada en color. Colocar las muestras cercanas a la luz fluorescente en la campana de humos química, a TA S / N o más tiempo hasta que la aplicaciónoído del todo claro.

3. Postembedding EM Inmunoelectrónica La inmunocitoquímica

NOTA: inmunocitoquímica Postembedding se lleva a cabo como se describe ^23,24,25.

1. Cortar 1 micras secciones con ultramicrotomo, secciones de la mancha con un 1% de toluidina-azul, y examinarlas para la orientación de la sección; orientar el bloque de tejido para alcanzar el plano transversal óptima de corte.
2. Cortar 70 cortes ultrafinos nm de grosor con ultramicrotomo y recogerlos en rejillas de ranura de níquel recubiertas de Formvar-carbono.
3. Lavar las rejillas una vez en _H2O destilada seguido de una solución salina tamponada con Tris (TBS tres veces, tampón Tris 0,05 M, NaCl al 0,7%, pH 7,6) de lavado.
4. Incubar rejillas en 20 gotas mu l de BSA al 5% en TBS durante 30 min, y después en 20 gotas mu l de una mezcla que contiene de cabra anti-CTB (1: 3.000) y un anticuerpo para GluN2A una subunidad NMDAR (anti-conejo de 1:50 , GluN2B 1:30), o un anti-conejo GluA2 / 3 (1:30)en TBS-Triton (TBST, 0,01% de Triton X-100, pH 7,6) con 2% de BSA y 0,02 M NaN ₃ O / N a TA.
5. rejillas de lavado en tres gotas separadas (20 l) de TBS (pH 7,6) para 10, 10, y 20 min, seguido de TBS (pH 8,2) durante 5 min.
6. Incubar rejillas durante 2 horas en gotas (20 l) de una mezcla que contiene IgG anti-conejo de burro (01:20) acoplado a 10 partículas nm de oro y IgG de burro anti-cabra (1:20) acoplados a partículas de oro 18 nm en TBST (pH 8,2) con 2% de BSA y 0,02 M NaN _3.
7. Lávese las rejillas en 20 gotas l de TBS (pH 7,6) durante 5, 5 y 10 minutos, a continuación, en agua ultrapura y luego secarlos.
8. Rejillas contratinción con acetato de uranilo al 5% y 0,3% de citrato de plomo en H ₂ O destilada para 8 y 5 min en condiciones de oscuridad, respectivamente.
9. Para los experimentos de etiquetado triple, incubar las redes de O / N a TA con 20 gotas mu l de una mezcla de anti-cabra de CTB (1: 3.000), anti-ratón de PSD-95 (1: 100) y anti-conejo GluN2A (1 : 50). A continuación se incuban las redes durante 2 horas el 2 de0 gotas mu l de una mezcla de IgG acoplado a 18, 10, y 5 partículas de oro nm en TBST (pH 8,2) con 2% de BSA y 0,02 M NaN _3. Mantener los mismos procedimientos que el doble etiquetado para el lavado y tinción de contraste entre y después de la incubación del anticuerpo.
10. Los controles se realizaron en el que los anticuerpos secundarios se aplicaron solos.
11. Ver cuadrículas en una EM y digitalizar imágenes. Procesar cifras finales en Adobe Photoshop 6.0 ​​sólo por el brillo y el contraste si es necesario ^24.

4. Cuantificación

1. Seleccione manualmente las zonas de la capa plexiforme interna (IPL) y sin agujeros o grietas en la ampliación 8,000X, a continuación, el fotomontaje al azar en toda la profundidad del IPL con una ampliación 25,000X.
2. Identificar las dendritas de RGC en diadas cono bipolares cuando a) contienen la señal CTB retrógradamente transportado (partículas de oro de gran tamaño), b) las membranas exhiben bien definido, hendiduras, y las densidades postsinápticas, c) contienen al menos dos pequeña parte del oroicles dentro del PSD, o más de una partícula de oro a pequeña a lo largo de la membrana plasmática extrasináptico.
3. Recoger 45 - 55 dendritas de CGR, en base a criterios anteriores, para el análisis cuantitativo.
4. Medir las longitudes de la PSD y la membrana plasmática de las dendritas extrasynaptic RGC individuales con software ImageJ NIH. Contar partículas de oro dentro de 10 nm de la membrana como asociada a membrana, en base a un espesor promedio de 7-9 nm para la membrana de plasma ^26.
5. Calcular la densidad de partícula como el número de partículas de oro por micrómetro lineal (oro / m). Medir la distancia entre el centro de cada partícula de oro y el centro de la PSD (para la localización sináptica) o el borde de la PSD (para la ubicación extrasynaptic).
6. Realizar análisis estadísticos mediante el software. Utilice dos colas pruebas t para comparar las medias. La conclusión de significación de p <0,05. A menos que se indique lo contrario, los valores del informe como media ± SEM ^18.

Resultados

Los resultados presentados aquí demuestran sorprendentemente diferentes patrones de localización subsináptica de GluA 2/3 y NMDARs en dendritas de CGR en retina de rata, como se describe previamente ^24,25. 77% de GluA 2/3 partículas de inmunomarcaje en los perfiles dendríticas RGC se encuentra dentro de la PSD (Figura 1A), similar a la mayoría de las sinapsis centrales. Sin embargo, NMDARs estaban ubicadas sinápticamente o extrasynaptically. 83% de las ...

Discusión

Hemos descrito cuatro técnicas para el éxito post incrustar inmunoelectrónica EM cuantitativa: 1) la fijación corta y débil, 2) congelación-sustitución, 3) 4) la cuantificación posterior a la incorporación de tinción inmunoelectrónica, y.

EM inmunoelectrónica permite la detección de proteínas específicas en las secciones de tejido ultrafinas. Anticuerpos marcados con partículas de oro se pueden visualizar directamente mediante EM. Mientras potente en la detección de la local...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	EMS	15710
Glutaraldehyde	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glycerol	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	Dilution 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	Dilution 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	Dilution 1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1–046	Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles	EMS	25704	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles	EMS	25814	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles	EMS	25812	Dilution 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	Dilution 1/20
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids.	EMS	FCF2010-Ni
Uranyl acetate	EMS	22400-1
Methanol	EMS	67-56-1
Lead citrate	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultramicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
liquid nitrogen	Roberts Oxygen
Propane	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1 - 1.2%
Anti-CTB	List Biological Laboratories	703	Dilution 1/4,000