Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Zusammenfassung

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Zusammenfassung

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

Einleitung

Glutamat ist der hauptsächliche exzitatorische Neurotransmitter im Netzhaut ^1. Retinalen Ganglienzellen (RGC), glutamatergen synaptischen Input von bipolaren Zellen ² sind die Ausgangsneuronen der Netzhaut erhalten, die visuelle Information an das Gehirn senden. Physiologische Untersuchungen zeigten, dass die synaptische Erregung von RGCs vermittelt wird postsynaptisch von NMDA-Rezeptoren (NMDARs) und AMPA-Rezeptoren (AMPARs) ^3,4,5. Obwohl exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) in RGCs durch AMPARs und NMDARs ^3,5,6,7,8, zeigen spontane Miniatur EPSCs (mEPSCs) auf RGCs vermittelt werden nur eine AMPARs vermittelte Komponente ^4,5,9. Allerdings ergab Glutamataufnahme Reduktion eines NMDAR Komponente in spontanen EPSCs ^5, was darauf hindeutet, dass NMDARs auf RGC Dendriten können außerhalb von Synapsen befinden. Membranassoziierten Guanylat-Kinasen (MAGUKs) wie PSD-95, dass Cluster Neurotransmitter-Rezeptoren, einschließlich Glutamat-Rezeptoren und Ionenkanals bei synaptischen Websites, auch deutliche subsynaptischen Expressionsmuster ^{10,11,12,13,14} aufweisen.

In den letzten Jahrzehnten konfokalen Immunhistochemie und Pre-Einbettung Elektronenmikroskop (EM) Immunhistochemie wurden zu studieren Membran-Rezeptor-Expression eingesetzt. Obwohl konfokalen Immunfärbung breites Muster der Rezeptorexpression offenbart, macht seine geringere Auflösung unmöglich subzellulären Ort zu unterscheiden zu können. Pre-Einbettung EM-Studien in Säugernetzhaut zeigen, dass NMDAR Untereinheiten in postsynaptischen Elemente bei Konus Bipolarzelle Band Synapsen ^15,16,17 vorhanden sind. Dies ist in der scheinbaren Gegensatz zu physiologischen Beweise. Jedoch Diffusion von Reaktionsprodukt ist ein bekannter Artefakt in der Pre-Einbettungs Immunperoxidase-Verfahren. Daher ist dieser Ansatz nicht in der Regel statistisch verlässliche Daten geben und Unterscheidung zwischen Lokalisierung zu synaptischen Membran gegen extrasynaptischen Membran ^18,19,20,21 ausschließen. Aufdie andere Hand, physiologischen und anatomischen Daten sind mit einem synaptischen Lokalisation von AMPARs auf RGCs ^3,5,7,9,22 konsistent. Somit Glutamatrezeptoren und MAGUKs bei Netzhautband Synapse nicht nur lokalisiert der postsynaptischen sondern auch auf die perisynaptic oder extrasynaptischen Membran Fächern. Jedoch ist ein hochauflösender quantitative Analyse dieser Membranproteine ​​in einer Netzhautband Synapse wird noch benötigt.

Hier entwickelten wir ein postembedding EM Immunogold Technik die subsynaptischen Lokalisierung von NMDAR-Untereinheiten, AMPAR Untereinheiten und PSD-95, gefolgt von der Schätzung der Anzahl, Dichte und die Variabilität dieser Proteine ​​an Synapsen auf Ratten RGCs untersucht markierten Choleratoxin-Untereinheit B mit (CTB) Rückverfolgung Methoden.

Protokoll

Pflege und Betreuung von Tieren waren nach NIH Animal Care und Use Committee Guidelines. 12-Stunden-Licht: postnatalen Tag (P) 15-21 Sprague-Dawley-Ratten injiziert mit 1-1,2% CTB bilateral durch den Colliculus superior, wurden auf einem 12 gehalten Dunkel-Zyklus.

1. Netzhautgewebe Fixation

1. Setzen Sie die folgenden Materialien und Werkzeuge: einem Binokular, 2 Zangen mit sehr feinen Spitzen, Schere, Zellulosefilterpapier, Plastikpipette und einem Objektträger.
2. Anesthetize die Ratte in einer geschlossenen Kammer mit 2,0 ml Halothan (ein Inhalationsanästhesie). Bestimmen ausreichende Betäubung mit diesen Methoden: Mangel Zurücknahme der Hinterpfote nach Zeh Prise, oder das Fehlen von Blinkreflex. Dann enthaupten sofort mit einer Guillotine. Entfernen Sie die Augen mit einem Paar von Iris Schere und in eine Glasschale mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) bei pH 7,4.
3. das Binokular Entfernen Sie mit den Maisea durch die Vorderseite des Augapfels abzuschneiden. Entfernen Sie die Linse und Glas von der inneren Netzhautoberfläche mit einer Pinzette.
4. Ziehen Sie die Lederhaut mit den beiden Zangen, bis die Netzhaut von der Augenmuschel isoliert ist.
5. Schneiden Sie die Netzhaut sofort in 100 bis 200 & mgr; m-dicke Streifen mit einer Rasierklinge, und je nach pH-Shift-Fixierung.
6. Fix Retina Streifen in 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PB bei pH 6,0 für 20 - 30 min und dann in 4% Paraformaldehyd und 0,01% Glutaraldehyd bei pH 10,5 für 10 - 20 min bei RT.
7. Nach mehrmaligem Waschen in PB mit 0,15 mM CaCl ₂ (pH 7,4 bei 4 ° C), cryoprotect die Netzhautstreifen mit Glycerin (60 min jeweils in 10%, 20%, 30%, dann O / N in 30%) in 0,1 M PB vor Substitution einzufrieren.

2. Gefriersubstitution

HINWEIS: Diese gefrierSubstitutionsMethode aus einer früheren veröffentlichten Protokoll ^19,20 modifiziert wird. Auch ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Instrumente sehr kalt sind (Handschuhe); Otherwise, kann das Gewebe teilweise aufzutauen, als mit den Instrumenten berührt. Alle diese Schritte werden in der AFS Kammer und der sie durchgeführt werden niemals über den Rand der Kammer bewegen kann. In ähnlicher Weise eine ausreichende Kühlung aller im AFS verwendeten Chemikalien notwendig.

1. Stech einfrieren die Netzhautstreifen in flüssigem Propan bei -184 ° C in einem EM Kryokonservierung Instrument (CPC). Mit einem feinen Pinsel, legen Sie die Proben auf kleine Stücke von doppelseitigem Klebeband auf die Metallstümpfe befestigt, die auf dem Ende der Eintauchstangen gehen (Docht aus zusätzlichen Puffer mit dem Pinsel).
2. Tauchen Sie die Stangen in die flüssige Propan und halten es für ca. 5 sec, und dann übertragen auf die automatische gefrier Substitution Instrument (AFS) ein kleines Transportkammer verwenden, die mit flüssigem Stickstoff ( "LN ₂ gekühlt Kryo Transferbehälter ') gefüllt ist.
3. die gefrorene Probe und Instrumente (Zange und Skalpell) in den AFS, kühlen die Instrumente in der Kammer nach der Platzierung für seVeral Minuten, bevor Sie das Gewebe zu berühren, oder sie kühlen, indem die Spitzen der Instrumente für ein paar Sekunden in die kleine Transportkammer platzieren (gefüllt mit flüssigem Stickstoff ( "LN ₂ gekühlt Kryo Transferbehälter ')).
4. Einmal in der AFS, entfernen Sie die Probe und das Klebeband von der Stummel einer feinen Skalpell. Auch halten die Stickstoffgasflusssteuerung, TF (TF wird als "Regler-Steuerung für _LN2 Verdampfer" bezeichnet) geöffnet während dieser Vorgänge.
5. Vor dem gefrorenen Gewebe in die Flach Einbettung Halter zu platzieren (dh vor den AFS-Einrichtung), Schnitt einen dünnen Kreis aus einem klaren Kunststofffolie und legen Sie sie in den unteren Teil der Halterung, um den Boden jeder Vertiefung zu füllen. Auf diese Weise können relativ leichteres Entfernen der polymerisierten Blöcken Probe, wenn Sie fertig.
   HINWEIS: Früher haben wir genutzt, ein alternatives Verfahren zu den flachen Einbettung Halter und Doppel Reichert + Gelatinekapseln unter Verwendung (siehe Petralia und Wenthold, 1999) ^20.
6. Verwenden Sie die folgende automatische Sequenz in der AFS (unter Verwendung Instrument Terminologie): T1 = -90 ° C für 32 h, S1 = Zunahme Temperatur von 4 ° C / h (11,3 h), T2 = 45 ° C für 50 h, S2 = Temperaturanstieg von 5 ° C / h (9 hr), T3 = 0 ° C für 40 Stunden (gesamt = 142,3 h). 4 Stunden Proben in der AFS zu platzieren (bei -90 ° C), bevor die Zeitabfolge beginnen - Es kann 2 nehmen.
7. Tauchen die Gefrierschnitte in 1,5% Uranylacetat in Methanol bei -90 ° C für> 32 Stunden in dem AFS. Legen Sie zwei Stücke von Gewebe (in der Regel) in jedem der sieben Brunnen im Flach Einbettung Aluminiumhalter (drei passen in die AFS).
   1. Platzieren der Gewebe + Band in das Uranylacetat / Methanol in den Vertiefungen und entfernen das Band später, unmittelbar vor dem Beginn Einbettungsmedium (zB Lowicryl HM20) Infiltration, wenn es zu schwierig ist, das Gewebe von dem Band zu entfernen.
8. Dann wird die Temperatur schrittweise erhöhen bis -45 ° C (+ 4 ° C pro Stunde; in der automatischen Sequenz).
9. Waschen Sie die Proben dreimal in vorgekühlte Methanol, um einen spitzen Plastikpipette mit der alten Lösung von jedem Flach Einbettung Halter, und dann mit einem anderen Standard-Kunststoff-Pipette zu entfernen Sie die vorgekühlt frischem Methanol hinzuzufügen.
10. Dann mit der gleichen Methode, infiltrieren die Proben schrittweise mit niedriger Temperatur Einbettung Harze wie Einbettungsmedium (HM20 / Methanol im Verhältnis 1: 1 und 2: 1, jeweils für 2 Stunden, gefolgt von Reinharz für 2 Stunden und dann die Harze ändern und halten O / N).
11. Ändern Sie den Harz am nächsten Tag wieder, das Niveau des Harzes Einstellung nur bis zur Oberkante der Brunnen zu erreichen.
12. Polymerisation der Proben (-45 ° C bis 0 ° C in automatischer Folge; + 5 ° C pro h) mit UV-Licht für 40 Stunden.
13. Dann entfernen Sie die Proben aus der AFS. Typischerweise zeigen Probenblöcke noch etwas rosa Haut und in Farbe. Legen Sie die Proben der Nähe des Leuchtstofflampe in der chemischen Abzugshaube, bei RT O / N oder mehr, bis sie AppOhr ganz klar.

3. Postembedding EM Immungold Immunzytochemie

HINWEIS: Postembedding Immunzytochemie wird wie beschrieben durchgeführt ^23,24,25.

1. Cut 1 & mgr; m Abschnitte mit Ultramikrotoms, Fleck Abschnitte mit 1% Toluidin-Blau, und untersuchen sie für Abschnitt Orientierung; Ausrichten der Gewebeblock, um die optimale Querebene Schnitt erreichen.
2. Cut 70 nm dicke Ultradünnschnitten mit Ultramikrotoms und sammeln sie auf Formvar-Kohlenstoff beschichteten Nickel-Spiel Gitter.
3. Wash Gitter einmal in destilliertem H _{2 O} durch eine Tris-gepufferte Kochsalzlösung, gefolgt dreimal (TBS, 0,05 M Tris-Puffer, 0,7% NaCl, pH 7,6) waschen.
4. Inkubieren Gitter in 20 ul Tropfen 5% BSA in TBS für 30 min und dann in 20 ul Tropfen einer Mischung Ziegen-Anti-CTB (1: 3000) enthält, und ein Antikörper gegen ein NMDAR-Untereinheit (anti-rabbit GluN2A 1.50 , GluN2B 1:30) oder ein Anti-Kaninchen GluA2 / 3 (1:30)in TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) mit 2% BSA und 0,02 M NaN _{& sub3; O} / N bei RT.
5. Wash Gitter auf drei getrennte Tropfen (20 ul) von TBS (pH 7,6) für 10, 10 und 20 min, gefolgt von TBS (pH 8,2) für 5 min.
6. Inkubieren Gitter für 2 h auf Tropfen (20 ul) einer Mischung Esel-anti-Kaninchen-IgG (1:20), der mit 10 nm Goldpartikel und Esel anti-Ziege IgG (1:20), der mit 18 nm Goldpartikel in TBST enthaltend (pH 8,2) mit 2% BSA und 0,02 M NaN _3.
7. Waschen Sie Netze in 20 ul Tropfen TBS (pH 7,6) für 5, 5 und 10 Minuten, dann in ultrareinem Wasser und trocknen Sie sie dann.
8. Gegenfärbung Gitter mit 5% Uranylacetat und 0,3% Blei Citrat in destilliertem _{H 2 O} 8 und 5 min bei schlechten Lichtverhältnissen auf.
9. Für Dreifachmarkierungsexperimente, inkubieren Gitter O / N bei RT mit 20 ul Tropfen einer Mischung von Anti-Ziege-CTB (1: 3000), anti-Maus-PSD-95 (1: 100) und anti-Kaninchen GluN2A (1 : 50). Dann brüten Gitter für 2 Stunden auf 20 ul Tropfen einer Mischung von IgGs gekoppelt bis 18, 10 und 5 nm Goldpartikel in TBST (pH 8,2) mit 2% BSA und 0,02 M NaN _3. Halten Sie die gleichen Verfahren wie Doppelmarkierung zum Waschen und Gegenfärbung zwischen und nach Antikörper-Inkubation.
10. Die Kontrollen wurden in dem die sekundären Antikörpern durchgeführt wurden allein aufgebracht.
11. Ansicht Gitter auf einem EM und digitalisieren Bilder. Prozess endgültigen Zahlen in Adobe Photoshop 6.0 ​​nur für Helligkeit und Kontrast, wenn es notwendig ist ^24.

4. Quantifizierung

1. Zur manuellen Einstellung der Bereiche der inneren plexiformen Schicht (IPL), ohne Löcher oder Risse an 8,000X Vergrößerung, dann Fotomontage zufällig die volle Tiefe von IPL in 25,000X Vergrößerung.
2. Identifizieren RGC Dendriten an Konus bipolaren Dyaden, wenn sie a) enthalten die retrograd transportiert CTB Signal (große Goldpartikel), b) zeigen wohldefinierte Membranen, Spalten und postsynaptischen Dichte, c) mindestens zwei kleine Gold Teil enthaltenicles innerhalb des PSD, oder mehr als eine kleine Goldpartikel entlang der extrasynaptischen Plasmamembran.
3. Sammeln Sie 45 - 55 RGC Dendriten, basierend auf obigen Kriterien, für die quantitative Analyse.
4. Messen der Längen der PSD und dem extrasynaptischen Plasmamembran von einzelnen RGC Dendriten mit NIH ImageJ Software. Graf Goldpartikel innerhalb von 10 nm der Membran als Membran-assoziierte, basierend auf einer durchschnittlichen Dicke von 7-9 nm für die Plasmamembran ^26.
5. Berechnen Partikeldichte als die Anzahl von Goldpartikeln pro linearem Mikrometer (gold / um). Den Abstand zwischen der Mitte jedes Goldpartikel und der Mitte des PSD (für synaptische Ort) oder den Rand des PSD (für extrasynaptischen location).
6. Führen Sie eine statistische Analyse von Software. Verwenden zweiseitigen t-Tests Mittel zu vergleichen. Folgern Bedeutung, wenn P <0,05. Wenn nicht anders angegeben, Bericht Werte als Mittelwert ± SEM ^18.

Ergebnisse

Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen deutlich unterschiedliche subsynaptischen Lokalisierungsmuster GluA 2/3 und NMDARs auf RGC Dendriten in Rattennetzhaut, wie zuvor ^24,25 beschrieben. 77% der GluA 2/3 Immunogold Partikel in RGC dendritischen Profile wurden in der PSD (1A) befindet, ähnlich wie die meisten zentralen Synapsen. Allerdings wurden NMDARs sich entweder synaptisch oder extrasynaptically. 83% der GluN2A Immunogold Teilchen wurden in dem PSD lok...

Diskussion

Wir haben vier beschriebenen Techniken für eine erfolgreiche quantitative Post-Einbettung Immun EM: 1) kurze und schwache Fixierung, 2) Gefriersubstitution, 3) nach dem Einbetten von Immunfärbung und 4) Quantifizierung.

EM Immunogold ermöglicht den Nachweis von spezifischen Proteinen in ultradünne Gewebeschnitten. Markierte Antikörper mit Goldpartikeln kann direkt unter Verwendung von EM visualisiert werden. Während mächtig in die subsynaptischen Lokalisierung eines Membranrezeptors z...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	EMS	15710
Glutaraldehyde	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glycerol	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	Dilution 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	Dilution 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	Dilution 1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1–046	Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles	EMS	25704	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles	EMS	25814	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles	EMS	25812	Dilution 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	Dilution 1/20
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids.	EMS	FCF2010-Ni
Uranyl acetate	EMS	22400-1
Methanol	EMS	67-56-1
Lead citrate	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultramicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
liquid nitrogen	Roberts Oxygen
Propane	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1 - 1.2%
Anti-CTB	List Biological Laboratories	703	Dilution 1/4,000