Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

Riepilogo

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Abstract

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

Introduzione

Il glutammato è il principale neurotrasmettitore eccitatorio nella retina ^1. Cellule gangliari della retina (RGCs), che ricevono in ingresso sinaptica glutammatergica da cellule bipolari ^2, sono i neuroni di uscita della retina che inviano le informazioni visive al cervello. Studi fisiologici hanno mostrato che l'eccitazione sinaptica di RGCs è mediata da recettori NMDA postsinaptica (NMDARs) e recettori AMPA (AMPARs) ^3,4,5. Anche se le correnti post-sinaptiche eccitatorie (EPSCs) in RGCs sono mediate da AMPARs e NMDARs ^3,5,6,7,8, EPSCs miniatura spontanee (mEPSCs) su RGCs mostrano solo una componente AMPARs mediata ^4,5,9. Tuttavia, la riduzione del glutammato captazione rivelato una componente NMDAR in EPSCs spontanee ^5, suggerendo che NMDARs su dendriti RGC possono essere situati al di fuori delle sinapsi eccitatorie. Associata alla membrana guanilato chinasi (MAGUKs) come PSD-95 che i recettori grappolo neurotrasmettitori, tra cui i recettori del glutammato e canale ionicos nei siti sinaptici, mostrano anche diversi modelli di espressione subsinaptico ^{10,11,12,13,14.}

Negli ultimi decenni, immunoistochimica confocale e l'incorporamento di pre-microscopio elettronico immunoistochimica (EM) sono stati impiegati per studiare l'espressione del recettore di membrana. Anche se immunostaining confocale rivela ampi schemi di espressione dei recettori, la sua risoluzione più bassa rende impossibile l'utilizzo di distinguere posizione subcellulare. -Embedding Pre studi EM in retina di mammifero indicano che subunità NMDAR sono presenti negli elementi post-sinaptici a cono bipolari sinapsi nastro cellule ^15,16,17. Questo è in evidente contrasto con prove fisiologica. Tuttavia, la diffusione del prodotto di reazione è un artefatto noto nel metodo dell'immunoperossidasi pre-embedding. Quindi, questo approccio di solito non dà dati statisticamente affidabili e può escludere distinzione tra la localizzazione di membrana sinaptica contro ^18,19,20,21 membrana extrasinaptica. SopraD'altra parte, i dati fisiologici e anatomici sono coerenti con una localizzazione sinaptica di AMPARs su RGCs ^3,5,7,9,22. Così, i recettori del glutammato e MAGUKs a sinapsi nastro retinica sono localizzate non solo al postsinaptica ma anche ai compartimenti di membrana perisynaptic o extrasinaptica. Tuttavia, è ancora necessaria una ad alta risoluzione analisi quantitativa di queste proteine ​​di membrana in una sinapsi nastro della retina.

Qui, abbiamo sviluppato una tecnica postembedding EM immunogold per esaminare la localizzazione subsinaptico di subunità NMDAR, subunità Ampar e PSD-95 seguita da stimare il numero, la densità e la variabilità di queste proteine ​​a livello delle sinapsi Onto RGCs ratto etichettati utilizzando tossina colerica subunità B (CTB) metodi di tracciamento retrogrado.

Protocollo

Cura e trattamento degli animali erano in conformità con NIH cura degli animali e linee guida del Comitato Usa. Postnatale giorno (P) 15-21 ratti Sprague-Dawley, iniettati con 1-1,2% CTB bilateralmente attraverso il collicolo superiore, sono stati mantenuti su un 12: luce 12-hr: ciclo scuro.

1. Fissazione tessuto retinico

1. Montare i seguenti materiali e strumenti: un microscopio da dissezione, 2 pinze con punte molto fini, forbici, carta da filtro di cellulosa, pipetta di plastica e un vetrino da microscopio.
2. Anestetizzare ratto in una camera chiusa con 2,0 ml alotano (un anestetico inalante). Determinare un'adeguata anestesia con questi metodi: la mancanza di ritiro della zampa posteriore dopo pizzico punta, o la mancanza di riflesso corneale. Poi decapitare immediatamente con una ghigliottina. Rimuovere gli occhi con un paio di forbici iris e mettere in un piatto di vetro contenente 4% paraformaldeide in tampone fosfato 0,1 M (PB) a pH 7,4.
3. Utilizzando il microscopio da dissezione, rimuovere il maisEA tagliando la parte anteriore del bulbo oculare. Rimuovere la lente e vitreale dalla superficie della retina interna con una pinza.
4. Sbucciare la sclera con le due pinze fino a quando la retina è isolato dal oculare.
5. Tagliare la retina immediatamente in 100 - 200 strisce micron di spessore con un rasoio, e soggetti a fissaggio variazione del pH.
6. Fix strisce retina in 4% paraformaldeide in 0.1 M PB a pH 6,0 per 20 - 30 min e poi in 4% paraformaldeide più 0,01% glutaraldeide a pH 10,5 per il 10 - 20 min a temperatura ambiente.
7. Dopo alcuni lavaggi in PB con 0.15 mM CaCl ₂ (pH 7,4 a 4 ° C), cryoprotect le strisce retinici con glicerolo (60 min ogni a 10%, 20%, 30%, poi O / N a 30%) in 0,1 M PB prima di congelare la sostituzione.

2. Fermo-sostituzione

NOTA: Questo metodo freeze-sostituzione viene modificato da un precedente protocollo pubblicato ^19,20. Inoltre, è fondamentale che gli strumenti sono molto freddi (indossare guanti); otherwise, il tessuto può scongelare parzialmente quando viene toccato con gli strumenti. Tutti questi passaggi sono fatti all'interno della camera di AFS e gli strumenti sono mai permesso di passare sopra il bordo della camera. Allo stesso modo, il corretto raffreddamento di tutte le sostanze chimiche utilizzate nella AFS è necessario.

1. Tuffatevi-congelare le strisce della retina in propano liquido a -184 ° C in uno strumento EM crioconservazione (CPC). Utilizzando un pennello fine, posizionare i campioni su piccoli pezzi di nastro biadesivo attaccato ai mozziconi di metallo che vanno sulla fine delle aste a strapiombo (stoppino off tampone usando il pennello).
2. Plunge le aste in propano liquido e tenere lì per circa 5 secondi, e poi il trasferimento allo strumento freeze-sostituzione automatica (AFS) con una piccola camera di trasporto che viene riempito con azoto liquido ( 'LN ₂ raffreddato contenitore di trasferimento crio').
3. Dopo aver posizionato il campione congelato e strumenti (pinze e bisturi) nel AFS, raffreddare gli strumenti nella camera per SEminuti veral prima di toccare il tessuto, o raffreddarli ponendo le punte degli strumenti per pochi secondi nella piccola camera di trasporto (riempito con azoto liquido ( 'LN ₂ raffreddata contenitore di trasferimento crio')).
4. Una volta in AFS, togliere il campione e nastro dalla stub usando una multa bisturi. Inoltre, mantenere il controllo del flusso di gas di azoto, TF (TF è descritto come un 'controllo del regolatore per LN ₂ vaporizzatore') aperto durante queste procedure.
5. Prima di posizionare il tessuto congelato nei supporti piatti incorporamento (cioè, prima di impostare la AFS), tagliare un cerchio sottile da un foglio di plastica trasparente e posizionarlo nella parte inferiore del supporto in modo da far corrispondere il fondo di ciascun pozzetto. Questo permette relativamente facile rimozione dei blocchi campione polimerizzati quando finito.
   NOTA: In precedenza, abbiamo utilizzato un metodo alternativo per i titolari di incorporamento piatte, e impiegando doppi Reichert + capsule di gelatina (vedi Petralia e Wenthold, 1999) ^20.
6. Utilizzare la seguente sequenza automatica in AFS (usando la terminologia strumento): T1 = -90 ° C per 32 ore, S1 = aumento di temperatura di 4 ° C / ora (11,3 ore), T2 = -45 ° C per 50 ore, S2 = aumento di temperatura di 5 ° C / ora (9 ore), T3 = 0 ° C per 40 ore (totale = 142,3 ore). Si può prendere 2 - 4 ore di inserire campioni nel AFS (a -90 ° C) prima di iniziare la sequenza temporizzata.
7. Immergere le sezioni congelate di 1,5% di acetato di uranile in metanolo a -90 ° C per> 32 ore in AFS. Mettere due pezzi di tessuti (in genere) in ciascuno dei sette pozzi nel supporto di alluminio piatto embedding (tre assemblata nel AFS).
   1. Posizionare il tessuto + nastro nella acetato di uranile / metanolo nei pozzetti e rimuovere il nastro dopo, appena prima dell'inizio mezzo di inclusione (ad esempio Lowicryl HM20) infiltrazione, se è troppo difficile rimuovere il tessuto dal nastro.
8. Poi aumentare la graduale della temperatura a -45 ° C (+ 4 ° C per ora; in sequenza automatica).
9. Lavare i campioni per tre volte in metanolo pre-raffreddata, utilizzando una pipetta di plastica a punta fine per rimuovere la vecchia soluzione da ciascun titolare piatta-embedding, e quindi utilizzando un'altra pipetta di plastica standard per aggiungere il metanolo fresco preraffreddato.
10. Poi, usando lo stesso metodo, infiltrarsi campioni progressivamente con basse resine temperatura incorporamento come mezzo di inclusione (HM20 / metanolo 1: 1 e 2: 1, ciascuno per 2 ore, seguita da resina pura per 2 ore e quindi modificare le resine e mantenere O / N).
11. Cambiare la resina nuovamente il giorno successivo, regolando il livello della resina per raggiungere solo al bordo superiore dei pozzetti.
12. Polimerizzare i campioni (-45 ° C a 0 ° C in sequenza automatica; + 5 ° C per ora) con luce UV per 40 hr.
13. Quindi rimuovere i campioni dal AFS. In genere, i blocchi di esempio mostrano ancora un po 'di colore rosa a colori. Posizionare i campioni vicini alla luce fluorescente nella cappa, a RT O / N o più a lungo fino a quando non apporecchio del tutto chiaro.

3. Postembedding EM Immunogold Immunocitochimica

NOTA: Postembedding immunocitochimica viene eseguita come descritto ^23,24,25.

1. Tagliare 1 micron sezioni con ultramicrotomo, sezioni macchia con 1% toluidina-blu, e li esaminerà per l'orientamento sezione; orientare il blocco di tessuto per ottenere il piano trasversale ottimale di sezionamento.
2. Tagliare 70 nm sezioni ultrasottili di spessore con ultramicrotomo e alla loro raccolta di nichel di slot griglie Formvar-carbonio rivestite.
3. Lavare griglie una volta in H ₂ O distillata O seguita da una soluzione salina tamponata con Tris tre volte (TBS, 0,05 M di tampone Tris, 0.7% NaCl, pH 7,6) lavaggio.
4. Incubare griglie 20 gocce microlitri di 5% BSA in TBS per 30 minuti, e poi in 20 gocce microlitri di una miscela contenente capra anti-CTB (1: 3.000) ed un anticorpo per un NMDAR subunità (anti-rabbit GluN2A 01:50 , GluN2B 1:30), o un anti-rabbit GluA2 / 3 (1:30)in TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) con 2% BSA e 0,02 M NaN ₃ O / N a RT.
5. griglie Lavare su tre gocce separate (20 microlitri) di TBS (pH 7,6) per 10, 10, e 20 minuti, seguiti da TBS (pH 8,2) per 5 min.
6. Incubare griglie per 2 ore in gocce (20 mL) di una miscela contenente asino IgG anti-coniglio (1,20) accoppiata a 10 nm particelle d'oro e IgG asino anti-capra (1:20) accoppiata a particelle d'oro 18 nm in TBST (pH 8.2) con 2% BSA e 0,02 M NaN _3.
7. Lavare griglie in 20 gocce microlitri di TBS (pH 7,6) per 5, 5, e 10 min, poi in acqua ultrapura e poi asciugare.
8. Griglie di contrasto con il 5% di acetato di uranile e lo 0,3% di piombo citrato di H _{2 O} distillata per 8 e 5 minuti in condizioni di oscurità, rispettivamente.
9. Per gli esperimenti triple-etichettatura, incubare le griglie O / N a temperatura ambiente con 20 gocce microlitri di una miscela di anti-capra CTB (1: 3.000), anti-topo PSD-95 (1: 100), e anti-coniglio GluN2A (1 : 50). Poi incubare griglie per 2 ore su 20 gocce microlitri di una miscela di IgG accoppiata a 18, 10 e 5 particelle di oro nm in TBST (pH 8.2) con 2% BSA e 0,02 M NaN _3. Mantenere le stesse procedure doppia marcatura per il lavaggio e controcolorazione tra e dopo l'incubazione degli anticorpi.
10. I controlli sono stati eseguiti in cui gli anticorpi secondari sono stati applicati solo.
11. Vedi griglie su un EM e digitalizzare immagini. Elaborare dati definitivi in Adobe Photoshop 6.0 ​​solo per la luminosità ed il contrasto se necessario ^24.

4. Quantificazione

1. Selezionare manualmente aree del livello plessiforme interno (IPL), senza buchi o crepe a 8,000X ingrandimento, quindi fotomontaggio a caso tutta la profondità di IPL a 25,000X ingrandimento.
2. Identificare dendriti RGC a cono diadi bipolari quando a) contengono il segnale CTB retrograda trasportato (grandi particelle d'oro), b) mostrano ben definito membrane, crepacci, e densità post-sinaptici, c) contengono almeno due piccola parte in oroicles all'interno del PSD, o più di una piccola particella d'oro lungo la membrana plasmatica extrasinaptica.
3. Raccogliere 45 - 55 dendriti RGC, sulla base di criteri di cui sopra, per l'analisi quantitativa.
4. Misurare le lunghezze del PSD e la membrana plasmatica extrasinaptica dei singoli dendriti RGC con il software NIH ImageJ. Conteggio particelle d'oro entro 10 nm della membrana come associata alla membrana, basato su uno spessore medio di 7 - 9 nm per la membrana plasmatica ^26.
5. Calcolare la densità di particelle come il numero di particelle d'oro per micrometro lineare (oro / micron). Misurare la distanza tra il centro di ogni particella oro e la metà del PSD (per la posizione sinaptica) o il bordo del PSD (per la posizione extrasinaptica).
6. Effettuare analisi statistiche da parte del software. Utilizzare due code t-test per confrontare le medie. Concludere significato quando P <0,05. Se non diversamente indicato, i valori di rapporto come media ± SEM ^18.

Risultati

I risultati qui presentati dimostrano sorprendentemente diversi modelli di localizzazione subsinaptico di GluA 2/3 e NMDARs sui dendriti RGC in retina di ratto, come descritto in precedenza ^24,25. 77% di GluA 2/3 particelle immunogold in RGC profili dendritiche erano situati all'interno del PSD (Figura 1A), simile alla maggior sinapsi centrali. Tuttavia, NMDARs erano situati sia sinapticamente o extrasynaptically. 83% di particelle immunogold GluN2A stati ...

Discussione

Abbiamo descritto quattro tecniche per il successo post-embedding immunogold EM quantitativa: 1) fissazione breve e debole, 2) freeze-sostituzione, 3) post-embedding colorazione immunogold, e 4) la quantificazione.

EM immunogold permette il rilevamento di proteine ​​specifiche in sezioni di tessuto ultrasottili. Gli anticorpi marcati con particelle d'oro possono essere visualizzati direttamente usando EM. Mentre potente nel rilevare la localizzazione subsinaptico di un recettore di m...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	EMS	15710
Glutaraldehyde	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glycerol	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	Dilution 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	Dilution 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	Dilution 1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1–046	Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles	EMS	25704	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles	EMS	25814	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles	EMS	25812	Dilution 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	Dilution 1/20
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids.	EMS	FCF2010-Ni
Uranyl acetate	EMS	22400-1
Methanol	EMS	67-56-1
Lead citrate	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultramicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
liquid nitrogen	Roberts Oxygen
Propane	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1 - 1.2%
Anti-CTB	List Biological Laboratories	703	Dilution 1/4,000