形成用凝胶辅助补液巨型的聚合物囊泡

摘要

We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

摘要

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (> 4 µm) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (>4 µm) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (>100 µm).

引言

合成细胞大小，巨单层囊泡（GUVs）的创建是在不同的细胞过程的体外重建越来越大的兴趣，以建立用于人造细胞样系统^1,2的产生的框架。而脂膜组成GUVs是天然的，生物膜的优良模拟物，它们对环境波动的不稳定，并具有相当短的货架寿命。由于这些限制，两亲性嵌段共聚物已经被用作脂质模拟物以形成聚合物囊泡，或聚合物囊泡。在此范围内，聚合物囊泡是在仿生细胞系统的发展有利，因为它们增加的稳定性^3，化学多功能^4,5和修改的物理性状^{6 - 8。}

以形成目前的方法巨型的聚合物囊泡包括electroformation ⁹和模板补液^10，两个W的HICH是费时，劳动强度大，需要专门的设备和产生完好巨型聚合物囊泡的产量低。一个简单的凝胶辅助补液方法最近被用于生产脂质GUVs ¹¹的研制。这里，我们描述了凝胶辅助补液技术的适应来创建具有不同的聚合物组合物巨聚合物囊泡，受控的大小，和在各种缓冲组合物。

简言之，将1％w / v的标准DNA凝胶电泳琼脂糖膜脱水到玻璃盖玻片。在氯仿制备的聚合物溶液然后通过脱水琼脂糖膜扩散并且使其蒸发。以下完全去除溶剂，聚合物膜被再水化中选择的，在温和加热（40-70℃）和巨（> 4微米）大小的聚合物囊泡都在30分钟内形成的缓冲。这种方法产生快速使用标准实验室设备和reagen数百完全完好，结构良好的聚合物囊泡TS以最低的成本。

图1原理图描绘了凝胶辅助补液方法。二嵌段共聚物组成的巨聚合物囊泡是补液的约30分钟后形成的。亲水块表示在品红和疏水块在绿色表示。 请点击此处查看该图的放大版本。

研究方案

1.聚合物和琼脂糖准备

注:手套和白大褂在任何时候都应在本协议佩戴。护目镜与任何有机溶剂或可能飞溅任何一步工作中同样需要。

1. 制备在氯仿中的5mg / ml的聚合物溶液。 1毫升氯仿添加至5mg固体聚（环氧乙烷）的- B-聚（丁二烯）（PEO-PBD，EO ₂₂ -BD _37）在玻璃小瓶中并涡旋充分溶解二嵌段共聚物。执行化学通风柜用氯仿所有步骤。
2. 在99.5％（摩尔）未标记的聚合物的0.5％（摩尔）的最终浓度混合在荧光标记的脂质（购已经溶解在氯仿）。
   1. 例如，吸管〜12微升的氯仿1毫克/毫升的荧光标记的脂质成997.58微升的PEO-PBD，EO ₂₂ -BD ₃₇聚合物的氯仿（与2950道尔顿的分子量）为0的最终浓度。5摩尔％标记的脂质混合，99.5摩尔％的聚合物。
   2. 与在-20℃的耐氯仿 - 盖密封的管形​​瓶中商店溶液。裹在瓶边缘水管工的磁带，其中盖子拧在小瓶中并固定盖子小瓶。包裹在盖的外侧另一块管道工胶带的最后缠绕在带的外封口膜，以确保最小的蒸发。
3. 通过在250毫升锥形瓶中的50毫升水（或者50μL的100mM蔗糖）中混合0.5毫克标准的琼脂糖制成1％w / v琼脂糖溶液。沸腾在标准微波〜1分钟的琼脂糖溶液（或直至完全溶解作为由溶液的结算说明）。
   注意:琼脂糖溶液可以冷却几分钟后使用，或者使其固化，储存和使用相同的过程再次熔化。

2.琼脂糖膜的制备

1. 切到底掀起了1000微升枪头，以防止堵塞。使用切尖，吸管300微升融化的琼脂糖溶液到25平方毫米的玻璃直接从制造商盖玻片。
2. 允许琼脂糖冷却至65-75〜℃下之前沉积。如果琼脂糖太酷了，就开始在传播过程中表面上聚集。相反，如果琼脂糖太热，这将需要更多的扩频粘附琼脂糖到表面。
3. 持用戴手套的手指盖玻片只是边缘，并使用另一个1000微升枪头的长边均匀地横跨盖玻片的表面上扩散的琼脂糖。移动枪头来回盖玻片直到琼脂糖完全附着并覆盖盖玻片。
4. 放置琼脂糖涂覆盖玻片到一张封口膜的与琼脂糖朝上。一旦盖玻片所需数量的涂覆，放置封口膜与盖玻片成37℃培养箱脱水琼脂糖到表面上至少1小时。
   注:脱水通过琼脂糖的可见层的消失来确定;盖玻片应看平，清晰。一旦电影完全脱水，储存与琼脂糖面朝上的一次性塑料培养皿盖玻片。

3.高分子成膜

1. 吸移管将30μl制备的聚合物溶液到琼脂糖膜。
2. 持用戴手套的手指盖玻片只是边缘并使用18G的针的长边跨使用圆形扩频运动琼脂糖膜散布溶液。继续传播，直到溶液蒸发。
   注意:请小心针的尖底的。
3. 放置在一个塑料培养皿聚合物面朝上的聚合物膜，并把培养皿成覆盖铝箔标准室内真空干燥器（防止标记的脂质的漂白）至少1小时，以完全除去任何残留的溶剂。

4.波尔的形成ymersomes

1. 坚持一个coverwell，无论是自制聚二甲基硅氧烷（PDMS）以及（与中间的约1cm直径固化的PDMS的约0.5厘米厚的块冲压出）或市售很好地涂覆有聚合物膜的盖玻片。轻轻按下coverwell到朝上直到紧密密封在coverwell和盖玻片之间形成的聚合物的聚合物涂覆的盖玻片。要小心，不要太用力按下，打破盖玻片。
2. 添加200-500微升补液溶液（水是好的，但缓冲剂或媒体的阵列也作品）至腔室（补液体积取决于附着在coverwell的大小）。
3. 创建一个湿度室以降低补液溶液的蒸发。放置沿着玻璃培养皿的边缘的轧制，湿的Kimwipe。与附着coverwell聚合物薄膜放入湿度室中，并用盖子覆盖。盖培养皿用铝箔，以尽量减少漂白。地点培养皿上热板设定为40℃至少30分钟。
4. 从24-70℃，调整加热板的再水化过程中的温度来调整所形成的小泡（ 图5）的大小。 70℃继续超出这个温度时，靠近琼脂糖的Tm _值所以应谨慎使用。

5.漂白后表征荧光恢复聚合物囊泡（FRAP）

1. 移动盖玻片与附着coverwell直接到达摄像倒置显微镜。
2. 选择基于包含在聚合物溶液中的荧光脂质适当滤波器集合。罗丹明标记的脂质掺杂到聚合物溶液中，使用一个二十五分之五百六十零激发滤光器和三十六分之六百零七nm发射滤波器，或类似过滤器组。
3. 用100X油物镜聚焦，其中聚合物囊泡将附着在盖玻片的顶表面上。如果聚合物囊泡特别大（> 20微米），或者如果聚合物膜太厚，较低功率的目标（ 例如，40X）应该被用于更好地可视化的聚合物囊泡。
4. 识别使用荧光显微镜的聚合物囊泡。由特性中空，球形囊泡直径> 5微米的识别聚合物囊泡。
5. 表征利用荧光恢复细胞膜的流动性含有一个可调节冷凝器的荧光显微镜漂白（FRAP）之后。由于附着的性质和基材聚合物囊泡严密包装，聚合物囊泡的自然运动是有限的，增加FRAP成像质量。
   1. 专注于感兴趣的聚合物囊泡显微镜。关闭冷凝器的小区域，并确保一个聚合物囊泡的边缘是感兴趣的成像区域内。
   2. 增加相机曝光，并确保所有的中性密度过滤器除去以有效光漂白的感兴趣的区域。允许膜FL荧光强度光漂白30-60秒或直至荧光强度显著降低。
   3. 关闭灯泡并完全打开冷凝器。减少曝光回到起始设置立即开始捕获图像，每30秒3分钟。
   4. 计算使用标准方法¹²膜扩散系数。如果漂白区域重新获得3-5分钟内的荧光强度，这表明该膜是流体。

6.表征聚合物囊泡尺寸

图6.使用映像软件的聚合物囊泡的大小分析过程。一步一步如何测量形成的小泡的直径指令。用户必须知道使用的显微镜​​的像素/微米的校准单元。ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

1. 打开聚合物囊泡的所获取的图像中的图像分析软件^13。
2. 通过点击分析下拉框，并在点击"设置规模"设置为图像的规模。
   1. 校准刻度使用标准方法显微镜（即微米）。
   2. 填写校验台，并单击"确定"。
3. 点击在线工具盒，画一条线跨越泡的直径。
4. 通过点击分析下拉框，并点击"测量"收集长度测量。
5. 继续测量遵循上面的程序和每一个新的测量将被添加到测量数据窗口个别囊泡。
6. 按"Ctrl + D"绘制每一行，并测量长度，印画上线后，图像使其更容易追踪这些囊泡进行了分析。

结果

聚合物囊泡用上述（ 图1）和图2中所示的普通实验室设备所概述的程序形成。聚合物囊泡用去离子水（ 图3）再水合和上成像用100X油物镜在落射荧光倒置显微镜。请注意，如果聚合物囊泡是不可见的，他们可能在规模过大与100X油目标捕捉形成;较低的功率目标可能需要被替代使用。之一的使用凝胶辅助补液的优点是在各种补液溶液形成聚合物囊泡的多功能性。被成功地形成在去离子水中，一个完整的哺乳动物细胞培养基，如在图4中所示的蔗糖溶液和两个生理学相关的缓冲液（磷酸盐缓冲的盐水（PBS）或Tris缓冲盐水（TBS）），聚合物囊泡。在标准条件下（补液与在40℃下1小时）水，大于〜70聚合物囊泡通常每视图40×40微米²区域中。虽然从表面上看生产聚合物囊泡是不是均匀的，有几十个与该销售代表产量的视场。此外，聚合物囊泡是在溶液中稳定至少24小时。

聚合物囊泡大小很容易通过在不同温度下再水化聚合物膜调谐。在RT形成在去离子水聚合物囊泡具有2.9±0.7微米的平均直径。作为复水过程中的温度升高，聚合物囊泡的平均尺寸也增加（ 见表1）。在高温（> 60℃），甚至大于100微米（ 图5）大小形成的聚合物囊泡。

所有的图像处理是使用开源的成像软件（ 图6）完成。采集到的图像在软件程序被打开。校准的像素大小订立设置比例框。使用行工具，系横跨直径绘制。每个单独的线绘制之后，所述标定长度进行测定，并加入到结果框。数据可以然后选择（ 如 Excel中，棱镜，产地等 ）的数学软件绘制

图2.所需聚合物囊泡的形成所需要的项目的共同和廉价的实验材料的图片有:石蜡膜中，将18.5g针，聚合物在氯仿或其它合适的溶剂中，1000微升枪头，锥形瓶中，镊子，琼脂糖25平方毫米的盖玻片，PDMS成像井和一个玻璃培养皿。 请点击这里查看该图的放大版本。

图3.图片凝胶辅助补液的方法。琼脂糖溶解散布在25平方毫米的盖玻片，直到连薄膜覆盖整个盖玻片。然后盖玻片放入37℃培养箱和电影脱水。聚合物溶液沉积在脱水琼脂糖膜和使用以圆周运动的针传播。然后将盖玻片放置在干燥器中O / N充分蒸发的任何溶剂的残留物。最后，成像室粘附于基片和聚合物再水合以选择的溶液，并置于培养皿中，在40℃下进行至少25分钟，以允许聚合物囊泡的形成。 请点击查看的这个更大的版本数字。 >

图4.聚合物囊泡可以形成在各种不同的缓冲器。PEO-PBD聚合物膜在40℃与所指示的缓冲器再水合1小时。比例尺= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5.复水过程中增加温度增加了聚合物囊泡的大小。在所示补液温度在水中形成聚合物囊泡的代表性落射荧光图像。在较大的聚合物囊泡温度升高的结果。比例尺= 10微米。_blank">请点击此处查看该图的放大版本。

温度（℃）	平均尺寸（微米）
24	2.93±0.7
40	5.76±2.5
50	6.65±2.4
60	11.46±5.8
70	14.04±7.0

表1增加期间增加聚合物囊泡大小补液结果的温度。平均直径为大于100聚合物囊泡在每进行了计算不同温度条件的水和这里被描绘。错误是标准偏差。

讨论

聚合物囊泡正在成为广泛地探讨作为生物膜模仿。聚合物的稳健和灵活的性能使得它们对需要膜功能化，长寿和调整的响应研究广泛的吸引力。形成巨型的聚合物囊泡^9,10（> 4微米），传统的方法是劳动密集和需要昂贵和专用设备。这里，我们提出的第一次中，用于形成使用标准便宜实验室试剂和设备巨尺寸聚合物囊泡一种快速，灵活和可靠的方法。

使用凝胶辅助补液，单层聚合物囊泡可以迅速地形成（<30分钟），在各种补液溶液（包括细胞培养基）中，用各种不同的聚合物（未示出数据）。多层或不对称囊泡的形成使用这种技术，没有观察到。贯穿本工作中，我们使用的聚（氧化乙烯） - B-聚（丁二烯）（PEO-PBD，EO ₂₂ -BD _37）中性二嵌段共聚物。许多不同的聚合物组合物（包括带电嵌段共聚物）工作良好使用此方法（未示出）。然而，一些可商购的三嵌段共聚物和较高分子量的二嵌段共聚物（〜> 5,000道尔顿）不形成不同的聚合物囊泡。对于所有在此手稿的实验中，标记的脂质的低浓度掺杂到仅用于可视化目的的聚合物溶液。还可以用于可视化的其他方法，包括直接官能化用荧光染料的聚合物。聚合物囊泡同样可以用亮视野显微镜成像，虽然荧光显微镜提供更高的分辨率。

最少量修改的协议通常不改变的结果。例如，在分散到盖玻片的聚合物溶液的浓度小的差异不改变聚合物f的形成ILM形成。虽然没有测定完整浓度范围内，将成功地用一个大范围的聚合物膜的浓度（ 例如 ，1-10毫克/毫升）的发生聚合物囊泡形成。然而，也有一些协议改变那些聚合物囊泡的形成产生不利影响。最值得注意的是在形成非常差聚合物囊泡这一轮盖玻片（而不是正方形）的结果。我们认为这是极为甚至这实际上阻碍了聚合物囊泡形成的玻璃涂层琼脂糖。

一个该技术的最显着的挑战是要以高收率回收从表面聚合物囊泡的能力。有某些情况下，其中从原始表面去除聚合物囊泡可以是有利的。由于从脱水的聚合物膜的高背景荧光，移除个别的聚合物囊泡，并坚持他们打扫盖玻片将增加的成像质量和表征（汉邦FRAP分析过程中cularly）。要做到这一点，温和移液用移液管尖端，其中端已被切断将从表面解吸聚合物囊泡（虽然回收囊泡的数量比那些最初形成显著低级）。然后聚合物囊泡可以放置在修改盖玻片的表面，使聚合物囊泡与新盖玻片交互。通常情况下，为中性的PEO-PBD聚合物囊泡，盖玻片用臭氧处理15分钟，使聚合物囊泡向下落到表面用于成像。不同表面改性需要不同聚合物囊泡的组合物（ 例如，带负电或带正电荷的聚合物）。

在这个协议中使用的大多数材料是成功地存储并用于天至数周。固化琼脂糖可再沸腾和重复使用，直到琼脂糖开始有聚集体即使煮沸后，或凝固琼脂糖开始干燥。用干燥的琼脂糖膜盖玻片可以存储和使用无限期D（ 例如 ，月）。溶于氯仿的聚合物可以储存在-20℃下几个月。一旦聚合物薄膜上琼脂糖膜干燥，然而，膜需要房子在真空下被储存和使用的两个周（未直接测定长期贮存中，但也有在聚合物囊泡从聚合物膜年长超过两个形成明显的差异周）。

使用这里介绍的凝胶辅助补液协议，数百均匀状聚合物囊泡与使用标准设备和廉价的实验室试剂劳动短短几个小时内迅速形成。此外，可以以各种的生理缓冲溶液和从不同的聚合物组合物（ 未示出）来形成聚合物囊泡。次要的改变的方法不负面改变聚合物囊泡的形成，呈现凝胶辅助补液一个通用和方便的技术来与科学家不同的技术电子xpertise。

容易地对细胞的大小尺度创建巨型聚合物囊泡的能力是用于构建人工细胞样系统是必不可少的。凝胶辅助补液的使用和多功能性的易用性使这些聚合物囊泡提供了仿生领域的巨大进步为建立强大的细胞膜模仿的。例如，使用这种技术，对于不同的细胞内成分，具有细胞膜蛋白和膜转运蛋白的掺入的聚合物的官能化，封装策略仅举几个，可以设计成基于聚合物囊泡人工细胞。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 ml Erlenmeyer flask	VWR	89000-360
18 guage needle	VWR	BD-305196
25 mm square coverslips	VWR	48366-089
Agarose	Sigma	A9539	A standard agarose for DNA gel electrophoresis
Chloroform	Sigma	288306-2L
Commerical coverwell	Electron Microscopy Sciences	70336	Press-to-Seal Silicone Isolators
Fiji Image Analysis Software	ImageJ		Free Download: http://fiji.sc/Fiji
Glass vial with Teflon Lid	VWR	66009-556	1.9 ml capacity, case of 144
Liss-rhodamine B PE Lipid	Avanti Polar Lipids	810150C	1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform
Parafilm	VWR	52858-000	10.2 cm x 38.1 m
poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940)	Polymer Source	P2904-BdEO	http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf
Pastic Petri Dish	VWR	25384-092
Teflon tape	VWR	300001-057	1/2" width