诱导多能干细胞使用成纤维样滑膜生成类风湿关节炎患者的关节分离

摘要

在这里，我们描述了从患者来源的成纤维细胞样滑膜细胞产生的诱导的人多能干细胞，使用慢病毒系统无饲养细胞的协议。

摘要

成熟的体细胞可以使用一组已定义的重编程因子被逆转成多潜能干细胞样的状态。的Oct4，Sox2的，Klf4的和c-Myc:大量的研究已经通过转导4山中转录因子产生的各种体细胞类型的诱导多能干细胞（iPS细胞）。 iPS细胞的研究仍然是生物学和临床研究的前沿。特别是，患者特异性iPSCs的可以被用作疾病病理学的研究开拓工具，因为iPSCs的可以从任何个体的组织进行诱导。类风湿关节炎（RA）是一种慢性炎性疾病，软骨和骨结构中的关节的破坏分类。滑膜增生是导致这些结果在RA中的主要原因或症状之一。成纤维细胞样滑膜细胞（FLSS）是在增生的滑膜的主要成分的细胞。 FLSS在合资无限增殖，最终侵入相邻cartil年龄和骨骼。目前，增生性滑膜只能通过外科手术去除。移除的滑膜用于RA的研究作为反映关节的炎性病症的材料。如在RA的发病机理的主要参与者，FLSS可用作一种材料，以产生并调查RA患者的iPSCs的。在这项研究中，我们使用了RA患者的FLSS产生的iPSC。使用慢病毒系统，我们发现FLSS可以生成RA患者特异性的iPSC。从FLSS产生的iPS细胞可以进一步用来作为一种工具来研究RA的病理生理的未来。

引言

多能性干细胞是在不同的临床和生物领域的下一代平台。它们是一种很有前途的工具，可以在疾病建模，药物筛选，并再生医疗治疗中使用。人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）主要用于研究和理解多能细胞。然而，由人胚泡的破坏分离，人类胚胎干细胞与几个伦理问题相关联。 2007年，山中伸弥博士和他的团队逆转细胞编程过程和成人的体细胞^1,2开发干细胞。因此，与人类胚胎干细胞，诱导多能干细胞（iPS细胞），可以从成熟的体细胞中产生，避免了伦理障碍。

的Oct4，Sox2的，Klf4和c-Myc的:通常，由四个外源基因递送产生的iPSC。这些因素山中正在使用慢病毒和逆转录病毒系统最初交付。第一iPS细胞是从鼠体细胞衍生Ç厄尔^3。然后，将技术应用于人皮肤成纤维^1,2。随后的研究成功生成从各种来源，如尿^4，血液^5,6- iPSCs的，角质⁷和其他一些类型的细胞。然而，也有没有在重新编程中使用的一些体细胞，并从在疾病状态特异组织的各种细胞类型的重新编程能力筛选，仍然需要。

类风湿关节炎（RA）是一种可以攻击所有关节，并导致在其他器官自身免疫疾病的疾病。 RA影响在发达国家成年人约1％。这是一种相当常见的疾病和其发病率逐年增加^8。然而，RA是很难在早期识别和摧毁oncebone发生没有治疗，可以恢复的损害。此外，药物的功效，从患者的不同而不同病人，这是很难预测的军医所需INE。因此，药物筛选方法的开发是必要的，并且需要能反映RA的条件的细胞的材料。

成纤维样滑膜（FLSS）均在^9,10 RA发病的积极参与者的细胞。 FLSS在关节囊和腔，其也被称为滑膜之间滑膜内膜衬里存在。通过支持接头结构和周围软骨提供营养，FLSS通常发挥关节功能和维护了至关重要的作用。然而，在FLSS RA具有侵入性的表型。 RA FLSS有一个肿瘤样表型，最终被无限增殖¹⁰摧毁了周围的骨骼。这种独特的特性，FLSS可以用作一个有前途的材料，可反映RA的病理生物学。然而，这些细胞很少产生，细胞表型改变的细胞经过在体外几段的条件。因此，它可以使用复杂的RA FLSS作为一种工具，可以代表病人的状况。

从理论上讲，RA患者来源的iPS细胞（RA-iPSCs的），可以成为药物筛选和进一步研究的理想工具。产生的iPSC具有自我更新的能力，并且可以保持和体外扩展。与多能性，这些细胞可以分化为成熟软骨细胞和骨细胞谱系，其可为在RA和其它骨相关疾病¹¹具体的研究有助于细胞材料。

在这项研究中，我们将演示如何隔离和从手术切除滑膜，以及如何扩大FLSS使用含有山因素慢病毒从FLSS产生RA-iPSCs的。

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研究方案

伦理学声明:本研究方案被批准由韩国天主教大学（KC12TISI0861）的机构审查委员会。

1.滑膜细胞分离和扩增

1. 隔离滑膜
   1. 消毒2双手术剪和一对钳。
   2. 转移滑膜组织到100mm皿并用含有1％青霉素/链霉素5毫升磷酸盐缓冲盐水的（PBS）中洗涤。
   3. 切断淡黄色脂肪组织和骨的残基。转移修整组织到一个6孔板的孔中加入5 ml Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），用20％胎牛血清（FBS）的。
   4. 剁用剪刀组织直至件小到足以穿透一次性吸。
   5. 含组织媒体传送到50ml锥形管中。通过加入5ml DMEM中，用20％的FBS的6孔板收获剩余的材料，然后转移到管中。
   6. 在冰上解冻胶原酶。添加胶原酶到0.01％的终浓度和密封用封口膜的管。孵育在水浴在37℃振荡4小时。
   7. 温育后，填充有20％FBS的DMEM管，直到总体积为50 ml和离心机在300 xg离心，室温10分钟。
   8. 不干扰沉淀除去上清液并加40毫升培养基重悬沉淀。
   9. 重复步骤1.1.10-1.1.11。
   10. 重悬在25毫升的DMEM的沉淀，用20％FBS和等待组织的大的团块，以沉底。
   11. 将上清转移至100毫米培养皿，并在5％CO ₂在37℃下孵育14一天。
2. 滑膜维护和扩展
   1. 丢弃从板的使用的媒体，并用5毫升的PBS洗细胞。
   2. 添加1ml的PBS / 1mM EDTA中，并在5％CO ₂在37℃下孵育2分钟。
   3. 轻轻点击菜和transfer中的细胞到15毫升锥形管中。离心细胞，在250 xg离心，室温2分钟。
   4. 不干扰沉淀除去上清液和重悬沉淀在30ml DMEM中，用20％的FBS。
   5. 转移细胞以3×100毫米培养皿，不留任何可见的边角料。
   6. 新鲜传媒每3天更换介质。分裂细胞以用1ml的PBS / 1mM EDTA中80％汇合。保持，直到使用之前3代。分裂细胞的每道菜到每分3菜肴。
      注:到达通道3后，即不会立即使用的细胞可以被冷冻。

2.重新编程FLSS使用编码慢病毒，山因素

1. 转导（D0）
   1. 每在生长培养基的6孔板的种子3×10 ⁴细胞（500毫升DMEM中补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素）。孵育细胞O / N在37℃下在5％CO2。
   2. 次日，除去含有4山因子慢病毒之一小瓶:Oct4的，Klf4的，Sox2的和c-Myc从冷冻和解冻，在4℃。注意:慢病毒通过在我们以前的研究¹¹中描述的方法产生的。
   3. 而解冻病毒，更改（在DMEM 20％胎牛血清加抗生素）含有10微克/毫升聚凝胺和50微克/毫升抗坏血酸媒体FLS生长培养基。
   4. 更换介质后，加入30微升慢病毒的细胞，轻轻混匀。以提高感染，在680 XG，35℃30分钟离心板。
   5. 离心后，孵育细胞在37℃下在5％CO _2。
2. 维护直到重新编程可见
   1. 为第3天，用含有0.1毫丁酸钠和50微克/毫升抗坏血酸FLS培养基每天更换介质。
   2. 第二天，与FLS生长培养基的混合物代替媒体和含有0.1mM丁酸钠和50微克/毫升抗坏血酸:（1比1）的iPSC介质。
      注意:iPSC的介质的组分中的材料/设备列表中给出。
3. 拆分单元格的集落形成
   1. 制备玻连蛋白包被的6孔板中。
      1. 加入60微升玻〜6毫升的PBS无钙⁺和Mg2 ^+。放2毫升混合物到每个孔中，并在室温下孵育至少1小时。注意:玻连蛋白的工作浓度为5微克/毫升。
   2. 上D5，洗涤细胞，用PBS。
   3. 添加1ml的PBS / 1mM EDTA中分离细胞，并在37℃，5％CO ₂孵育2分钟。
   4. 收获细胞，离心，在250 xg离心，室温2分钟。
   5. 分裂的细胞以3个不同的比例（1:3,1:6和1:9），以实现不同的汇合。添加900微升的媒体向细胞沉淀重悬。每孔中添加6- 300，150，和100微升细胞混合物的孔板来实现的比率为1:3,1:6和1:9，分别。
   6. 直到克隆出现与媒体的iPSC每天更换介质。关于D18菌落后会出现。注意:在此阶段，的iPSC集落共存与非重新编程FLSS。
4. 殖民地采摘
   1. 通过加入500微升玻连至孔准备48孔玻连蛋白包被的板，并在室温下孵育至少1小时。
   2. 放置一个净化台显微镜，并从培养箱取出6孔板。
   3. 从48孔板中除去玻连蛋白溶液，并添加补充有含10mM的Rho相关，卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂500微升的iPSC介质。
   4. 用10便士的枪头，切断周围的殖民地。传送所拾取菌落至48孔板的一个孔中。
   5. 采摘几个菌落后，孵育细胞在37℃，5％的CO _2。
   6. 维持细胞直到菌落大ENO唉转移。注意:我们通常洒细胞时菌落失控显微镜的可见领域，当在100X放大率的观看。

3.免疫荧光染色

1. 细胞的制备
   1. 放置无菌18毫米盖玻片至12孔板中。
   2. 加入1毫升的PBS以冷却和冲洗玻璃盖。
   3. 用1毫升10微克/毫升玻连蛋白溶液的更换。
   4. 孵育在室温的板至少1小时。
   5. 弃去玻连蛋白溶液和板的iPSC在玻连蛋白包被的12孔平板并培养7天，在37℃，5％CO _2，每日更换介质。
2. 细胞染色
   1. 弃去培养基，用PBS洗细胞一次。
   2. 固定在0.4％多聚甲醛（PFA）将细胞在室温30分钟。
   3. 透用0.1％的Triton X-100将细胞在室温下5分钟。
   4. 取出透溶液和块与含有2％牛血清白蛋白（BSA）在室温30分钟的PBS。
   5. 稀释按表1含2％BSA的PBS中的抗体。用在RT 2小时的初级抗体孵育的细胞。
   6. 添加二次抗体（稀释1:200），孵育所述细胞在室温下1小时，以避免光。
   7. 处理细胞用1微升/毫升的DAPI 10分钟。
   8. 放置在载玻片与抗淬灭剂的顶部的盖玻璃，并在室温下孵育24小时，避光。
   9. 验证用荧光显微镜表达。

4.实时聚合酶链式反应（RT-PCR）

1. 使用硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法¹¹细胞沉淀中提取的mRNA。
2. 使用反转录¹¹总RNA 2微克扩增基因。
3. 混合使用2微升cDNA的统的用于PCR所需的组件板^11。
4. 进行RT-PCR和验证通过凝胶电泳¹¹的结果。

5.碱性磷酸酶（AP）染色

1. 培养的iPSC 5-7天，在37℃，5％CO ₂的前染色。
2. 吸媒体和修复用4％PFA的细胞1分钟。
3. 丢弃固定液和冲洗用1X冲洗缓冲细胞。
4. 准备AP染色试剂。混合试剂在下列比率:快速红紫:酚AS-BI磷酸酯溶液:水= 2:1:1。
5. 孵育在室温染色溶液15分钟的细胞中，避光。
6. 丢弃染色液和冲洗用漂洗缓冲液将细胞。
7. 覆盖细胞用PBS以防止干燥，并用明场显微镜验证表达。

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结果

在这项研究中，我们描述了一种协议使用的慢病毒系统生成从FLSS的iPSC。 图1A示出了FLS隔离协议的一个简单的方案。继手术切除滑膜，组织被切成采用手术剪小块。加入胶原酶向细胞从组织的团块隔离。细胞进一步处理前温育14天。 图 1B示出的分离的FLSS的形态。细胞保持在使用前3的通道。 FLSS共享一般的成纤维细胞的类似特性。我们?...

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讨论

iPS细胞的发现之前，科学家主要用于胚胎干细胞通过差异化来研究干细胞生物学和其他细胞系。然而，胚胎干细胞从胚泡，这是一个早期胚胎的内质起源。为了分离胚胎干细胞，囊胚破坏是不可避免的，提高是不可能克服的伦理问题。此外，尽管胚胎干细胞具有干性特征和多能性，它们不能从个体获得的，并且有时不进行个性化的分析和疾病筛查的理想工具。

在2007年，高桥...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 mlL Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 ml)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/ml)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde (PFA)	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004