Generación de células madre pluripotentes inducidas por el Uso de sinoviocitos similares a fibroblastos aislados de las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide

Resumen

Aquí se describe un protocolo para la generación de células madre pluripotentes humanas inducida de sinoviocitos similares a fibroblastos derivados del paciente, utilizando un sistema lentiviral sin células alimentadoras.

Resumen

células somáticas maduras pueden revertirse a un estado de células madre pluripotentes-como el uso de un conjunto definido de factores de reprogramación. Numerosos estudios han generado células pluripotentes inducidas-madre (iPSCs) de diversos tipos de células somáticas mediante la transducción cuatro factores de transcripción Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc. El estudio de las células iPS se mantiene a la vanguardia de la investigación biológica y clínica. En particular, iPSCs específicos del paciente se pueden utilizar como una herramienta para el estudio pionero de patobiología de la enfermedad, ya que iPSCs pueden ser inducidos a partir del tejido de cualquier individuo. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria crónica, clasificados por la destrucción del cartílago y la estructura ósea en la articulación. hiperplasia sinovial es una de las principales razones o síntomas que conducen a estos resultados en la AR. Los sinoviocitos tipo fibroblasto (FLSs) son las principales células componentes de la membrana sinovial hiperplásica. FLSs en la articulación ilimitadamente proliferan, finalmente invadir el cartil adyacentesla edad y el hueso. Actualmente, la membrana sinovial hiperplásica se puede quitar solamente por un procedimiento quirúrgico. La membrana sinovial eliminado se utiliza para la investigación RA como un material que refleja la condición inflamatoria de la articulación. Como un jugador importante en la patogénesis de la AR, FLSs se puede utilizar como un material para generar e investigar las iPSCs de pacientes con AR. En este estudio, hemos utilizado la FLSs de un paciente con AR para generar células iPS. El uso de un sistema lentiviral, descubrimos que puede generar FLSs RA-paciente específico IPSC. Las iPSCs generados a partir de FLSs se pueden utilizar además como una herramienta para estudiar la fisiopatología de la AR en el futuro.

Introducción

Las células madre pluripotentes son la plataforma de próxima generación en diversos campos clínicos y biológicos. Son una herramienta prometedora que puede utilizarse en el modelado de la enfermedad, la detección de drogas, y la terapia médica regenerativa. Las células madre embrionarias humanas (hESCs) se utilizaron principalmente para estudiar y comprender células pluripotentes. Sin embargo, aislado por la destrucción del blastocisto humano, hESCs están asociados con varias preocupaciones éticas. En 2007, el Dr. Shinya Yamanaka y su equipo invirtieron el proceso de programación celular y desarrollan células madre a partir de células somáticas adultas humana ^1,2. Por lo tanto, a diferencia de hESCs, inducida por las células madre pluripotentes (iPSCs) se pueden generar a partir de células somáticas maduras, evitando los obstáculos éticos.

Por lo general, iPSCs son generados por la entrega de cuatro genes exógenos: Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc. Estos factores Yamanaka son entregados originalmente usando sistemas de lentivirus y retrovirus. Las primeras células iPS se derivaron de ratón c somáticaells ^3. Posteriormente, la técnica se aplicó a los fibroblastos dérmicos humanos ^1,2. Estudios posteriores generado correctamente iPSCs de diversas fuentes, tales como orina ^4, la sangre ^5,6, queratinocitos ^7, y varios otros tipos de células. Sin embargo, hay algunas células somáticas que no han sido usados ​​en la reprogramación, y el cribado de las capacidades de reprogramación de diversos tipos de células de tejidos específicos en el estado de la enfermedad, sigue siendo necesaria.

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad que puede afectar a todas las juntas y conducir a enfermedades autoinmunes en otros órganos. La AR afecta a alrededor del 1% de los adultos en el mundo desarrollado. Es una enfermedad bastante común y su incidencia aumenta cada año ^8. Sin embargo, RA es difícil de identificar en las primeras etapas y oncebone destrucción ocurre no existe un tratamiento que puede recuperar el daño. Por otra parte, la eficacia del fármaco varía de paciente a paciente, y es difícil predecir el médicoine que se requiere. Por lo tanto, se necesita el desarrollo de un método de selección de fármacos, y se requiere un material celular que puede reflejar las condiciones de la AR.

Los sinoviocitos similares a fibroblastos (FLSs) son un participante celular activo en la patogénesis de la AR ^9,10. FLSs existe en el revestimiento de la íntima sinovial entre la cápsula y cavidad de la junta, que también se refiere como la membrana sinovial. Mediante el apoyo a la estructura de la articulación y el aporte de nutrientes al cartílago circundante, FLSs suelen jugar un papel crucial en la función de las articulaciones y el mantenimiento. Sin embargo, FLSs en la AR tiene un fenotipo invasivo. RA FLSs tienen un fenotipo similar al cáncer, finalmente destruir el hueso circundante por la proliferación infinita ^10. Con esta característica única, FLSs se puede utilizar como un material prometedor que puede reflejar la patobiología de la AR. Sin embargo, estas células son rara vez se producen, y los fenotipos celulares alteran medida que las células pasan por varios pasajes de in vitro condiciones. Por lo tanto, puede ser complicado de usar RA FLSs como una herramienta que puede representar el estado del paciente.

En teoría, RA células iPS derivadas de pacientes (RA-iPSCs) pueden convertirse en una herramienta ideal para la detección de drogas y una mayor investigación. IPSCs generadas tienen la capacidad de auto-renovación y se pueden mantener y expandir in vitro. Con la pluripotencia, estas células pueden diferenciarse en condrocitos y osteocitos linajes maduros, que pueden contribuir material celular para la investigación específica en la AR y otras enfermedades relacionadas con los huesos ^11.

En este estudio, se demuestra cómo aislar y expandir FLSs de una membrana sinovial extraído quirúrgicamente, y cómo generar RA-iPSCs de FLSs utilizando lentivirus que contenían factores Yamanaka.

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Protocolo

Declaración de Ética: Este protocolo de estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (KC12TISI0861).

1. Aislamiento de sinoviocitos y Expansión

1. El aislamiento de sinoviocitos
   1. Esterilizar dos pares de tijeras quirúrgicas y un par de fórceps.
   2. Transferir el tejido sinovial a un plato de 100 mm y se lava con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 1% de penicilina / estreptomicina.
   3. Cortar los residuos en los tejidos de grasa y huesos amarillentos. Transferir el tejido recortado a un pocillo de una placa de 6 pocillos y añadir 5 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 20% (FBS).
   4. Picar los tejidos con las tijeras hasta que las piezas son lo suficientemente pequeñas como para penetrar una pipeta desechable.
   5. Transferir el medio que contiene el tejido a un tubo cónico de 50 ml. Se recoge el material restante mediante la adición de 5 ml de DMEM con 20% de SFB a la placa de 6 pocillos y luego transferir al tubo.
   6. colagenasa deshielo en hielo. Añadir la colagenasa hasta una concentración final de 0,01% y sellar el tubo con parafilm. Incubar en un baño de agua a 37 ° C con agitación durante 4 hr.
   7. Después de la incubación, llenar el tubo con DMEM con 20% de SFB, hasta que el volumen total es de 50 ml y se centrifuga a 300 xg, ta durante 10 min.
   8. Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento y añadir 40 ml de medio para volver a suspender el sedimento.
   9. Repita los pasos 1.1.10-1.1.11.
   10. Resuspender el precipitado en 25 ml de DMEM con 20% de FBS y esperar a que las grandes masas de tejido a hundirse hasta el fondo.
   11. Transferir el sobrenadante a un plato de 100 mm y se incuba a 37 ° C en 5% de _CO2 durante 14 días.
2. Sinoviocitos Mantenimiento y Expansión
   1. Desechar los medios utilizados a partir de la placa y se lavan las células con 5 ml de PBS.
   2. Añadir EDTA 1 ml de PBS / 1 mM y se incuba a 37 ° C en 5% de _CO2 durante 2 min.
   3. Toque suavemente el plato y transfer las células a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células a 250 g, la temperatura ambiente durante 2 min.
   4. Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento y volver a suspender el sedimento en 30 ml de DMEM con 20% de SFB.
   5. Transferir las células a 3 x 100 mm platos, sin dejar ningún material sobrante visible.
   6. Reemplazar los medios de comunicación por medio nuevo cada 3 d. Dividir las células en confluencia del 80% usando EDTA 1 ml de PBS / 1 mM. Mantener hasta el paso 3 antes de su uso. Dividir cada placa de células en 3 platos en cada división.
      NOTA: Después de alcanzar el paso 3, las células que no se van a utilizarse inmediatamente se pueden congelar.

2. La reprogramación FLSs El uso de lentivirus que codifican factores de Yamanaka

1. Transducción (D0)
   1. Seed 3 × 10 ⁴ células por pocillo de una placa de 6 pocillos en medio de crecimiento (500 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina). Se incuban las células O / N a 37 ° C en 5% de CO2.
   2. Al día siguiente, eliminar un vial de lentivirus que contenía 4 Yamanaka factores: Oct4, Klf4, Sox2 y c-Myc del congelador y descongelar a 4 ° C. Nota: Lentivirus fue producido por el procedimiento descrito en nuestro estudio anterior ^11.
   3. Mientras descongelación del virus, cambiar los medios de comunicación a los medios de crecimiento FLS (20% de FBS más antibióticos en DMEM) que contiene 10 mg / ml de bromuro de hexadimetrina y ácido ascórbico 50 mg / ml.
   4. Después de cambiar los medios de comunicación, añadir 30 l de lentivirus a las células y mezclar suavemente. Para mejorar la infección, centrifugar la placa a 680 xg, 35 ° C durante 30 min.
   5. Después de la centrifugación, se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO _2.
2. Mantenimiento Hasta La reprogramación es visible
   1. Para 3 días, reemplazar los medios de comunicación a diario con medio de crecimiento que contiene 0,1 FLS mM de butirato de sodio y ácido ascórbico 50 mg / ml.
   2. Al día siguiente, en lugar de los medios de comunicación con una mezcla de medios de cultivo y FLSmedios IPSC (relación 1: 1) que contiene 0.1 mM de butirato de sodio y ácido ascórbico 50 mg / ml.
      Nota: Los componentes de los medios de comunicación IPSC se da en la lista de materiales / equipos.
3. Las células de división para la formación de colonias
   1. Preparar una placa de 6 pocillos recubiertos con vitronectina.
      1. Añadir vitronectina 60 l a 6 ml de PBS sin Ca2 ⁺ y Mg2 ^+. Poner 2 ml de mezcla en cada uno de los pozos y se incuban en RT durante al menos 1 hr. Nota: La concentración de trabajo de la vitronectina es 5 mg / ml.
   2. En D5, se lavan las células con PBS.
   3. Añadir 1 ml de EDTA PBS / 1 mM para separar las células y se incuba a 37 ° C, 5% de _CO2 durante 2 min.
   4. Recoger las células y centrifugar a 250 xg, TA durante 2 min.
   5. Dividir las células a 3 proporciones diferentes (1: 3, 1: 6, y 1: 9) para lograr diferentes confluencies. Añadir 900 l de medios de comunicación para el sedimento celular y resuspender. Añadir 300, 150, y 100 l de la mezcla de células por pocillo de una 6-así placa para lograr una proporción de 1: 3, 1: 6, y 1: 9, respectivamente.
   6. Reemplazar los medios de comunicación diaria con los medios de IPSC hasta que aparezcan las colonias. Las colonias van a aparecer después de unos D18. Nota: En esta etapa, las colonias IPSC coexistir con el FLSs no reprogramado.
4. recogida de colonia
   1. Preparar una placa de vitronectina recubierto de 48 pocillos mediante la adición de 500 l de vitronectina a los pocillos, e incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 hr.
   2. Coloque el microscopio sobre una mesa de trabajo limpia, y retire la placa de 6 pocillos de la incubadora.
   3. Eliminar la solución de vitronectina de la placa de 48 pocillos y añadir 500 l de IPSC medios suplementados con 10 mM de Rho-asociado, espiral de la bobina que contiene inhibidor de la proteína quinasa (ROCK).
   4. Con una punta de pipeta de 10 peniques, corte alrededor de la colonia. La transferencia de la colonia recogido a un pocillo de la placa de 48 pocillos.
   5. Después de recoger varias colonias, se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO _2.
   6. Mantener las células hasta que las colonias son grandes enouf para la transferencia. Nota: Por lo general, se le cayó de las células cuando la colonia se sale del campo visible del microscopio, cuando se ve con un aumento de 100X.

3. La tinción de inmunofluorescencia

1. Preparación de la célula
   1. Coloque una cubierta de vidrio estéril de 18 mm en una placa de 12 pocillos.
   2. Añadir 1 ml de PBS para enfriar y enjuagar la cubierta de vidrio.
   3. Reemplazar con 1 ml de una solución de 10 mg / ml de vitronectina.
   4. Se incuba la placa a temperatura ambiente durante al menos 1 hora.
   5. Desechar la solución vitronectina y iPSCs placa en la placa de 12 pocillos recubiertos con vitronectina y la cultura durante 7 días a 37 ° C, 5% de CO _2, el cambio de los medios de comunicación todos los días.
2. la tinción de células
   1. Descartar el medio de cultivo y se lavan las células una vez con PBS.
   2. Fijar las células en 0,4% de paraformaldehído (PFA) durante 30 min a RT.
   3. Permeabilizar las células con 0,1% Triton X-100 durante 5 min a RT.
   4. Retire la permeabilizaciónsolución y de bloque con PBS que contiene 2% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 30 min a TA.
   5. Diluir los anticuerpos en PBS que contenía 2% de BSA de acuerdo con la Tabla 1. Se incuban las células con los anticuerpos primarios durante 2 horas a RT.
   6. Añadir el anticuerpo secundario (diluido 1: 200) y se incuban las células durante 1 hora a temperatura ambiente, evitando la luz.
   7. Tratar las células con 1 l / ml DAPI para 10 min.
   8. Coloque la cubierta de vidrio en la parte superior de la placa de cristal con antifade reactivo y se incuba a temperatura ambiente durante 24 horas, evitando la luz.
   9. Verificar la expresión con un microscopio de fluorescencia.

4. tiempo real de reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR)

1. Extracto de ARNm del sedimento celular usando el tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo método de extracción ^11.
2. Amplificar ADNc a partir de 2 g de mRNA total de la transcripción inversa utilizando ^11.
3. Mezclar los componentes necesarios para la PCR utilizando 2 l de cDNA templaca ^11.
4. Realizar RT-PCR y verificar los resultados por electroforesis en gel de ^11.

5. fosfatasa alcalina (AP) tinción

1. IPSCs de cultivo durante 5-7 días a 37 ° C, 5% de _CO2 antes de la tinción.
2. Aspirar los medios de comunicación y fijar las células con PFA al 4% durante 1 min.
3. Desechar el fijador y lavar las células con tampón de lavado 1X.
4. Preparar los reactivos para la tinción de AP. Mezcle los reactivos en la siguiente proporción: Fast Red Violet: solución de fosfato de naftol AS-BI: agua = 2: 1: 1.
5. Se incuban las células con la solución de tinción a temperatura ambiente durante 15 minutos, evitando la luz.
6. Desechar la solución de tinción y lavar las células con tampón de enjuagado.
7. Cubrir las células con PBS para evitar el secado y verificar la expresión mediante un microscopio de campo brillante.

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Resultados

En este estudio, se describe un protocolo para generar células iPS de FLSs usando un sistema lentiviral. La figura 1A muestra un esquema simple del protocolo de aislamiento FLS. Después de la eliminación quirúrgica de la membrana sinovial, el tejido se corta en trozos pequeños con tijeras quirúrgicas. La colagenasa se añadió para aislar las células de los grupos de tejido. Las células se incubaron durante 14 días antes del procesamiento adicional.

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Discusión

Antes del descubrimiento de iPSCs, los científicos utilizan principalmente los CES para estudiar la biología de células madre y otros linajes celulares a través de la diferenciación. Sin embargo, los CES originan a partir de la masa interna de un blastocisto, que es un embrión en etapa temprana. Para aislar los CES, la destrucción del blastocisto es inevitable, plantea cuestiones éticas que son imposibles de superar. Por otra parte, aunque los CES tienen características stemness y pluripotencia, no pueden ser o...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 mlL Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 ml)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/ml)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde (PFA)	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004