Génération de cellules souches induites pluripotentes Utilisation synoviocytes fibroblaste Isolé Joints de la polyarthrite rhumatoïde Les patients

Résumé

Nous décrivons ici un protocole destiné à générer des cellules souches pluripotentes humaines induites par les synoviocytes de type fibroblaste provenant de patients, en utilisant un système lentiviral sans cellules nourricières.

Résumé

cellules somatiques matures peuvent être inversées dans un état de cellules souches pluripotentes comme l'aide d'un ensemble défini de facteurs de reprogrammation. De nombreuses études ont généré induites-cellules souches pluripotentes (CISP) à partir de différents types de cellules somatiques par transduction quatre Yamanaka facteurs de transcription: Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc. L'étude des CSPi demeure à la fine pointe de la recherche biologique et clinique. En particulier, CSPi spécifiques au patient peuvent être utilisés comme un outil d'avant-garde pour l'étude de pathobiologie de la maladie, puisque CSPi peuvent être induites à partir du tissu de tout individu. La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire chronique, classé par la destruction du cartilage et la structure de l'os dans l'articulation. hyperplasie synoviale est une des raisons majeures ou des symptômes qui conduisent à ces résultats dans la polyarthrite rhumatoïde. Synoviocytes fibroblast-like (SSLF) sont les principales cellules du composant dans la synoviale hyperplasique. FLSS dans l'articulation prolifèrent indéfiniment, finalement envahir le cartil adjacentl'âge et de l'os. À l'heure actuelle, la synoviale hyperplasique peut être enlevé que par une intervention chirurgicale. La membrane synoviale enlevée est utilisée pour la recherche RA comme un matériau qui reflète l'état inflammatoire de l'articulation. En tant qu'acteur majeur dans la pathogenèse de la PR, FLSS peut être utilisé comme un matériau pour générer et étudier les CSPi de patients atteints de PR. Dans cette étude, nous avons utilisé le FLSS d'un patient atteint de PR pour générer CSPi. En utilisant un système lentiviral, nous avons découvert que FLSS peut générer RA spécifique au patient iPSC. Les CSPi générées par FLSS peuvent encore être utilisés comme un outil pour étudier la physiopathologie de la PR dans le futur.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes sont la plate-forme de nouvelle génération dans divers domaines cliniques et biologiques. Ils sont un outil prometteur qui peut être utilisé dans la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues, et le traitement médical régénérateur. Humaines cellules souches embryonnaires (CSEh) ont été principalement utilisés pour étudier et comprendre les cellules pluripotentes. Cependant, isolé par la destruction du blastocyste humain, CSEh sont associés à plusieurs préoccupations éthiques. En 2007, le Dr Shinya Yamanaka et son équipe inversé le processus de programmation de la cellule et développé des cellules souches à partir de cellules somatiques adultes humaines ^1,2. Par conséquent, contrairement à CSEh, induits-cellules souches pluripotentes (CISP) peuvent être générées à partir de cellules somatiques matures, en évitant les obstacles éthiques.

En règle générale, iPSCs sont générés par la fourniture de quatre gènes exogènes: Oct4, Sox2, Klf4, et c-Myc. Ces facteurs sont à l'origine Yamanaka livrés en utilisant des systèmes lentiviraux et rétroviraux. Les premiers CSPi ont été dérivées de la souris somatique caunes ^3. Par la suite, la technique a été appliquée sur des fibroblastes dermiques humains ^1,2. Des études ultérieures ont généré avec succès iPSCs provenant de diverses sources, telles que l' urine ^4, le sang ^5,6 kératinocytes ⁷ et plusieurs autres types de cellules. Cependant, il y a des cellules somatiques qui ne sont pas utilisés dans la reprogrammation et le dépistage des capacités de reprogrammation de différents types de tissus spécifiques dans l'état de la maladie de cellules, est encore nécessaire.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie qui peut frapper toutes les articulations et entraîner des maladies auto-immunes dans d'autres organes. La polyarthrite rhumatoïde touche environ 1% des adultes dans le monde développé. Il est une maladie assez courante et son incidence augmente chaque année ^8. Cependant, RA est difficile d'identifier dans les premiers stades et oncebone destruction se produit il n'y a pas de traitement qui peut récupérer les dommages. De plus, l'efficacité du médicament diffère d'un patient à, et il est difficile de prédire le médecinine qui est nécessaire. Par conséquent, la mise au point d'une méthode de dépistage de drogue est nécessaire, et un matériau cellulaire qui peut refléter les conditions de la polyarthrite rhumatoïde est nécessaire.

Synoviocytes fibroblast-like (SSLF) sont un participant cellulaire actif dans la pathogenèse de la PR ^9,10. FLSS existent dans la paroi de l'intima synoviale entre la capsule et la cavité articulaire, qui est également désigné sous le nom synoviale. En soutenant la structure commune et fournissant des éléments nutritifs au cartilage environnant, FLSS jouent généralement un rôle crucial dans la fonction articulaire et la maintenance. Cependant, FLSS dans la PR ont un phénotype invasif. RA FLSS ont un phénotype de cancer comme, éventuellement détruire l'os environnant par une prolifération infinie ^10. Grâce à cette caractéristique unique FLSS peut être utilisé en tant que matériau prometteur qui peut refléter la pathobiologie de la polyarthrite rhumatoïde. Cependant, ces cellules sont rarement réalisées, ainsi que les phénotypes cellulaires modifient que les cellules passent par plusieurs passages in vitro conditions. Par conséquent, il peut être compliqué à utiliser RA FLSS comme un outil qui peut représenter l'état du patient.

Théoriquement, RA CSPi patient dérivé (RA-CSPi) peuvent devenir un outil idéal pour le dépistage de drogues et d'autres recherches. CSPi générées ont l' auto-renouvellement et la capacité peuvent être maintenues et développées in vitro. Avec pluripotence, ces cellules peuvent être différenciées en chondrocytes et ostéocytes lignées matures, qui peuvent contribuer matériel cellulaire pour la recherche spécifique dans la polyarthrite rhumatoïde et d' autres maladies liées à l' os ^11.

Dans cette étude, nous montrons comment isoler et développer FLSS d'un synoviale enlevé chirurgicalement, et comment générer RA-CSPi de FLSS utilisant des lentivirus contenant des facteurs Yamanaka.

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Protocole

Déclaration éthique: Ce protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC12TISI0861).

1. synoviocytes Isolement et expansion

1. synoviocytes Isolation
   1. Stériliser deux paires de ciseaux chirurgicaux et une paire de pinces.
   2. Transférer le tissu synovial à 100 mm plat et on lave avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1% de pénicilline / streptomycine.
   3. Coupez les résidus jaunâtres de tissu adipeux et des os. Transférer le tissu coupé à un puits d'une plaque à 6 puits et on ajoute 5 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 20% de sérum bovin fœtal (FBS).
   4. Hacher les tissus avec des ciseaux jusqu'à ce que les pièces sont suffisamment petites pour pénétrer dans une pipette jetable.
   5. Transférer le support du tissu contenant un tube conique de 50 ml. Récolter la matière restante en ajoutant 5 ml de DMEM avec 20% de FBS à la plaque de 6 puits, puis les transférer dans le tube.
   6. collagénase Thaw sur la glace. Ajouter la collagénase à une concentration finale de 0,01% et sceller le tube avec du parafilm. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° C sous agitation pendant 4 heures.
   7. Après incubation, remplir le tube avec du DMEM avec 20% de FBS jusqu'à ce que le volume total soit de 50 ml et centrifuger à 300 x g, RT pendant 10 min.
   8. Retirer le surnageant sans perturber le culot et ajouter 40 ml de médias pour remettre le culot.
   9. Répétez les étapes 1.1.10-1.1.11.
   10. Reprendre le culot dans 25 ml de DMEM avec 20% de FBS et d'attendre les grosses touffes de tissu à couler au fond.
   11. Transférer le surnageant dans une boîte de 100 mm et incuber à 37 ° C dans 5% de _CO2 pendant 14 jours.
2. Synoviocytes Maintenance et extension
   1. Jeter les médias utilisés à partir de la plaque et laver les cellules avec 5 ml de PBS.
   2. Ajouter 1 ml de PBS / EDTA 1 mM et on incube à 37 ° C dans 5% de _CO2 pendant 2 min.
   3. Appuyez sur le plat en douceur et transfer les cellules dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules à 250 x g, température ambiante pendant 2 min.
   4. Retirer le surnageant sans perturber le culot et resuspendre le culot dans 30 ml de DMEM avec 20% de FBS.
   5. Transférer les cellules à 3 x 100 mm plats, sans laisser de matériau restant visible.
   6. Remplacez le support avec un milieu frais tous les 3 d. Fractionner les cellules à 80% de confluence en utilisant 1 ml de PBS / EDTA 1 mM. Maintenir jusqu'au passage 3 avant utilisation. Divisez chaque plat de cellules en 3 plats dans chaque division.
      NOTE: Après avoir atteint le passage 3, les cellules qui ne vont pas être utilisés immédiatement peuvent être congelés.

2. Reprogrammation FLSS Utilisation de lentivirus codant pour les facteurs Yamanaka

1. Transduction (D0)
   1. Graines 3 × 10 ⁴ cellules par puits d'une plaque à 6 puits dans un milieu de croissance (500 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine). Incuber les cellules O / N à 37 ° C dans 5% de CO2.
   2. Le lendemain, retirer un flacon de lentivirus contenant 4 Yamanaka facteurs: Oct4, Klf4, Sox2 et c-Myc du congélateur et décongeler à 4 ° C. Note: lentivirus a été produit par la procédure décrite dans notre précédente étude ^11.
   3. Bien que la décongélation du virus, changer les médias aux médias de croissance FLS (20% de FBS, plus des antibiotiques dans DMEM) contenant 10 pg / ml de bromure de hexadimethrine et 50 pg / ml d'acide ascorbique.
   4. Après avoir changé les médias, ajouter 30 pl de lentivirus aux cellules et mélanger doucement. Pour améliorer l'infection, centrifuger la plaque à 680 xg, 35 ° C pendant 30 min.
   5. Après centrifugation, incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de _CO2.
2. Maintenance Jusqu'à Reprogrammation est visible
   1. Pour le jour 3, remplacer les médias quotidiens avec les médias de croissance FLS contenant 0,1 mM de butyrate de sodium et 50 pg / ml d'acide ascorbique.
   2. Le lendemain, remplacer les médias avec un mélange de milieux de croissance et FLSCOPSi support (1: 1 rapport) contenant 0,1 mM de butyrate de sodium et 50 pg / ml d'acide ascorbique.
      Remarque: Les composants des médias iPSC est donnée dans la liste des matériaux / équipement.
3. Cellules Fractionnement pour la Formation Colony
   1. Préparer une plaque à 6 puits vitronectine revêtu.
      1. Ajouter 60 ul de vitronectine à 6 ml de PBS sans Ca ²⁺ et Mg ^2+. Mettez 2 ml de mélange dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h. Remarque: La concentration de travail de la vitronectine est de 5 ug / ml.
   2. Le D5, laver les cellules avec du PBS.
   3. Ajouter 1 ml de PBS / 1 mM d' EDTA pour détacher les cellules et incuber à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant 2 min.
   4. Récolter les cellules et centrifuger à 250 x g, température ambiante pendant 2 min.
   5. Fractionner les cellules à 3 rapports différents (1: 3, 1: 6 et 1: 9) pour obtenir différents confluencies. Ajouter 900 ul de milieu pour le culot cellulaire et remettre en suspension. Ajouter 300, 150, et 100 pl du mélange de cellules par puits d'une 6-Plaque puits pour parvenir à un rapport de 1: 3, 1: 6 et 1: 9, respectivement.
   6. Remplacer les médias tous les jours avec les médias iPSC jusqu'à ce que les colonies apparaissent. Colonies apparaîtront après environ D18. Remarque: A ce stade, les colonies iPSC coexistent avec le SSLF non reprogrammée.
4. Colony picking
   1. Préparer une plaque de vitronectine revêtue de 48 puits par addition de 500 ul de la vitronectine aux puits et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h.
   2. Placez le microscope sur un banc propre, et retirer la plaque de 6 puits de l'incubateur.
   3. Retirer la solution de vitronectine de la plaque de 48 puits et ajouter 500 médias iPSC ul supplémenté avec 10 mM Rho-associé, superhélice contenant de la protéine kinase (ROCK) inhibiteur.
   4. En utilisant une pointe de pipette 10p, couper autour de la colonie. Transférez la colonie choisi pour un puits de la plaque de 48 puits.
   5. Après la cueillette de plusieurs colonies, incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO _2.
   6. Maintenir les cellules jusqu'à ce que les colonies sont grandes enough pour le transfert. Note: Nous avons l'habitude déversé les cellules lorsque la colonie sort du champ visible du microscope, lorsqu'on regarde au grossissement 100X.

3. immunofluorescence

1. Préparation cellulaire
   1. Placez un 18 mm couvercle en verre stérile dans une plaque de 12 puits.
   2. Ajouter 1 ml de PBS pour refroidir et rincer le verre de protection.
   3. Remplacer par 1 ml d'une / ml de vitronectine solution à 10 pg.
   4. Incuber la plaque à température ambiante pendant au moins 1 h.
   5. Jeter la solution de vitronectine et CSPi de plaque dans la plaque de 12 puits vitronectine enduit et de la culture pendant 7 jours à 37 ° C, 5% de CO _2, en changeant les médias tous les jours.
2. cellule coloration
   1. Jeter les milieux de culture et laver les cellules avec du PBS une fois.
   2. Fixer les cellules dans 0,4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 30 min à température ambiante.
   3. Perméabiliser les cellules avec 0,1% de Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante.
   4. Retirez le perméabilisationla solution et le bloc avec du PBS contenant 2% d'albumine de sérum bovin (BSA) pendant 30 min à température ambiante.
   5. Diluer les anticorps dans du PBS contenant du BSA à 2% selon le Tableau 1. Incuber les cellules avec les anticorps primaires pendant 2 heures à température ambiante.
   6. Ajouter l'anticorps secondaire (dilution 1: 200) et on incube les cellules pendant 1 heure à température ambiante, en évitant la lumière.
   7. Traiter les cellules avec 1 pl / ml de DAPI pendant 10 min.
   8. Placer le couvercle en verre sur le dessus de la lame de verre avec antifade réactif et incuber à température ambiante pendant 24 heures, en évitant la lumière.
   9. Vérifier l'expression d'un microscope à fluorescence.

4. temps réel Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

1. Extraire l' ARNm à partir du culot cellulaire en utilisant le thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme , la méthode d'extraction ^11.
2. Amplifier ADNc à partir de 2 pg d'ARNm totaux en utilisant la transcription inverse ^11.
3. Mélanger les composants nécessaires pour la PCR en utilisant 2 pi d'ADNc de systèmeplaque ^11.
4. Effectuer RT-PCR et de vérifier les résultats par électrophorèse sur gel ^11.

5. phosphatase alcaline (AP) Coloration

1. IPSCs de culture pendant 5-7 jours à 37 ° C, 5% de CO ₂ avant la coloration.
2. Aspirer les médias et fixer les cellules avec 4% de PFA pendant 1 min.
3. Jeter le fixateur et rincer les cellules avec le tampon de rinçage 1X.
4. Préparer les réactifs pour AP coloration. Mélanger les réactifs dans le rapport suivant: Fast Red Violet: solution de phosphate de naphtol AS-BI: eau = 2: 1: 1.
5. Incuber les cellules avec la solution de coloration à la température ambiante pendant 15 minutes, en évitant la lumière.
6. Jeter la solution de coloration et de rinçage des cellules avec un tampon de rinçage.
7. Couvrir les cellules avec du PBS pour éviter le dessèchement et vérifier l'expression en utilisant un microscope à champ clair.

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Résultats

Dans cette étude, nous décrivons un protocole pour générer CSPi de FLSS en utilisant un système lentiviral. La figure 1A montre un schéma simple du protocole d'isolement FLS. À la suite de l'ablation chirurgicale de la synovie, le tissu a été haché en petits morceaux avec des ciseaux chirurgicaux. Collagénase a été ajouté à isoler les cellules à partir des amas de tissu. Les cellules ont été mises en incubation pendant 14 jours avant le traiteme...

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Discussion

Avant la découverte de CSPi, les scientifiques ont utilisé principalement les CES pour étudier la biologie des cellules souches et d'autres lignées cellulaires grâce à la différenciation. Cependant, les CES proviennent de la masse interne d'un blastocyste, qui est un embryon à un stade précoce. Pour isoler les CES, la destruction du blastocyste est inévitable, ce qui soulève des questions éthiques qui sont impossibles à surmonter. En outre, bien que les CES ont des caractéristiques stemness et plur...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 mlL Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 ml)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/ml)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde (PFA)	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004