Die Erzeugung von Induced-pluripotenten Stammzellen Fibroblast-wie Synoviozyten Isoliert von Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die menschliche Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen von Patienten stammenden Fibroblasten-ähnlichen Synoviozyten, ein lentiviraler System ohne Feeder-Zellen.

Zusammenfassung

Reife somatische Zellen in eine pluripotente Stammzelle ähnlichen Zustand mit einem definierten Satz von Reprogrammierungsfaktoren rückgängig gemacht werden. Zahlreiche Studien haben induzierte pluripotente Stammzellen erzeugt Zellen (iPS-Zellen) aus verschiedenen Zelltypen, die von vier Yamanaka Transkriptionsfaktoren transduzierenden: Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc. Die Studie von iPS-Zellen bleibt auf dem neuesten Stand der biologischen und klinischen Forschung. Insbesondere patientenspezifische iPSCs kann als Pionier Werkzeug für die Untersuchung von Krankheits Pathobiologie verwendet werden kann, da iPSCs aus dem Gewebe eines Individuums induziert werden. Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die durch die Zerstörung von Knorpel und Knochenstruktur in dem gemeinsamen klassifiziert. Synoviale Hyperplasie ist einer der wichtigsten Gründe, oder Symptome, die zu diesen Ergebnissen bei RA führen. Fibroblast-wie Synoviozyten (FLSS) sind die Hauptkomponentenzellen in der hyperplastischen Synovium. FLSS in der gemeinsamen unbegrenzt vermehren, schließlich das benachbarte cartil eindringendenAlter und Knochen. Derzeit kann der hyperplastischen Synovium nur durch einen chirurgischen Eingriff entfernt werden. Das entfernte Synovium ist für RA Forschung als Material verwendet, die die entzündliche Erkrankung des Gelenks widerspiegelt. Als wichtiger Akteur in der Pathogenese der RA kann FLSS als Material verwendet werden, um die iPS-Zellen von RA-Patienten zu erzeugen und zu untersuchen. In dieser Studie verwendeten wir die FLSS eines RA Patienten iPSCs zu erzeugen. Verwendung eines lentiviralen System entdeckten wir, dass FLSS kann RA patientenspezifische iPSC erzeugen. Die iPSCs erzeugt aus FLSS kann weiter als ein Werkzeug verwendet werden, um die Pathophysiologie der RA in der Zukunft zu studieren.

Einleitung

Pluripotente Stammzellen sind die Plattform der nächsten Generation in verschiedenen klinischen und biologischen Bereichen. Sie sind ein vielversprechendes Werkzeug, das in Krankheitsmodelle verwendet werden können, Wirkstoff-Screening, und regenerative medizinische Therapie. Humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) wurden vor allem verwendet, um zu studieren und pluripotenten Zellen zu verstehen. Doch durch die Zerstörung des menschlichen Blastozysten isoliert, hESCs sind mit mehreren ethischen Bedenken verbunden. Im Jahr 2007 kehrte Dr. Shinya Yamanaka und sein Team die Zelle Programmierprozess und entwickelt Stammzellen aus menschlichen adulten somatischen Zellen ^1,2. Deshalb, im Gegensatz zu hES, induziert-pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) können aus reifen somatischen Zellen erzeugt werden, die ethischen Hürden zu vermeiden.

Üblicherweise iPSCs werden durch die Lieferung von vier exogenen Gene erzeugt: Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc. Diese Yamanaka Faktoren sind ursprünglich mit Lentiviren und retrovirale Systeme geliefert. Die ersten iPSCs wurden aus Maus somatischen c abgeleitetells ^3. Danach wurde die Technik , um humane dermale Fibroblasten ^1,2 angewendet. Nachfolgende Studien erzeugten erfolgreich iPSCs aus verschiedenen Quellen, wie beispielsweise Urin ^4, Blut ^5,6, Keratinozyten ⁷ und mehrere andere Zelltypen. Es gibt jedoch einige somatische Zellen sind, die nicht in Umprogrammierung verwendet haben, und Screening der Umprogrammierung Fähigkeiten verschiedener Zelltypen von spezifischen Geweben in Krankheitszustand, ist immer noch erforderlich.

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Erkrankung, die alle Gelenke treffen können und zu Autoimmunerkrankungen in anderen Organen führen. RA betrifft etwa 1% der Erwachsenen in der entwickelten Welt. Es ist eine ziemlich häufige Erkrankung und ihre Häufigkeit steigt jedes Jahr ^8. Jedoch ist RA hart in den frühen Stadien und oncebone Zerstörung zu identifizieren auftritt gibt es keine Behandlung, die den Schaden erholen kann. Darüber hinaus unterscheidet sich die Arzneimittelwirksamkeit von Patient zu Patient, und es ist schwer, die Sanitäter zu prognostizierenine, die erforderlich ist. Daher wird die Entwicklung eines Medikaments-Screening-Verfahren benötigt wird, und ein Zellmaterial, das die Bedingungen von RA erforderlich reflektieren kann.

Fibroblast-like Synoviozyten (FLSS) sind eine aktive Mobilteilnehmer in der Pathogenese der RA ^9,10. FLSS existieren in der synovialen intimale Auskleidung zwischen der Gelenkkapsel und den Hohlraum, der auch als das Synovium bezeichnet wird. Durch die gemeinsame Trägerstruktur und Nährstoffe zu den umgebenden Knorpel Bereitstellung FLSS in der Regel eine entscheidende Rolle bei der Gelenkfunktion und Wartung spielen. Allerdings FLSS in RA haben einen invasiven Phänotyp. RA FLSS haben einen Krebs-ähnlichen Phänotyp, was schließlich den umgebenden Knochen ¹⁰ durch unendliche Vermehrung zu zerstören. Mit dieser einzigartigen Charakteristik kann FLSS als vielversprechendes Material verwendet werden, das die Pathobiologie von RA reflektieren kann. Doch werden diese Zellen nur selten hergestellt und die Zelle Phänotypen verändern , wenn die Zellen durch mehrere Passagen in in vitro gehen Bedingungen. Daher kann es RA FLSS als Werkzeug zu benutzen, kompliziert sein, dass der Zustand des Patienten darstellen kann.

Theoretisch RA-Patienten stamm iPSCs (RA-iPS-Zellen) kann ein ideales Werkzeug für Wirkstoff-Screening und weitere Forschung. Erzeugte iPSCs haben Selbsterneuerungsvermögen und aufrecht erhalten und in vitro erweitert werden. Mit Pluripotenz, können diese Zellen in reife Chondrozyten und Osteozyten Abstammungslinien unterschieden werden, die Zellmaterial für spezifische Forschung in RA und anderen Knochen bedingte Krankheiten ¹¹ beitragen kann.

In dieser Studie zeigen wir, wie FLSS von einem chirurgisch entfernt Synovium zu isolieren und zu erweitern, und wie RA-iPS-Zellen aus FLSS mit Lentiviren enthält Yamanaka Faktoren zu erzeugen.

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Protokoll

Ethik-Erklärung: Diese Studienprotokoll vom Institutional Review Board der Katholischen Universität von Korea (KC12TISI0861) genehmigt wurde.

1. Synoviocyte Isolierung und Expansion

1. Synoviocyte Isolation
   1. Sterilisieren zwei Paare von chirurgische Scheren und ein Paar Zangen.
   2. Übertragung der synovialen Gewebe zu einer 100 mm-Schale und wasche mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 1% Penicillin / Streptomycin.
   3. Schneiden Sie die gelbliche Fettgewebe und Knochenreste aus. Bringen Sie das zugeschnittene Gewebe auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und 5 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 20% fötalem Rinderserum (FBS).
   4. Hacken Sie die Gewebe mit der Schere bis die Stücke sind klein genug, um eine Einweg-Pipette eindringen.
   5. Übertragen, um das Gewebe enthaltende Medium zu einem 50 ml konischen Röhrchen. Ernten Sie die verbleibende Material durch Zugabe von 5 ml DMEM mit 20% FBS auf die 6-Well-Platte und dann übertragen auf das Rohr.
   6. Thaw Kollagenase auf Eis. Hinzufügen Kollagenase bis zu einer Endkonzentration von 0,01% und dichten das Rohr mit Parafilm. Inkubieren in einem Wasserbad bei 37 ° C mit 4 h schütteln.
   7. Nach der Inkubation Füllen des Röhrchens mit DMEM mit 20% FBS, bis das Gesamtvolumen 50 ml und Zentrifuge bei 300 xg ist, RT für 10 min.
   8. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und fügen Sie 40 ml Medium, das Pellet zu resuspendieren.
   9. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.10-1.1.11.
   10. Resuspendieren des Pellets in 25 ml DMEM mit 20% FBS und warten auf die großen Klumpen von Gewebe auf den Boden zu versenken.
   11. Den Überstand auf eine 100 mm - Schale und inkubieren bei 37 ° C in 5% CO ₂ für 14 Tage.
2. Synoviocyte Wartung und Erweiterung
   1. Entsorgen Sie die Medien von der Platte und die Zellen werden mit 5 ml PBS.
   2. 1 ml PBS / 1 mM EDTA und Inkubation bei 37 ° C in 5% CO ₂ für 2 min.
   3. Tippen Sie auf die Schale sanft und transfer die Zellen einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 · g, RT für 2 min.
   4. Entfernen Sie den Überstand ohne das Pellet zu stören und das Pellet in 30 ml DMEM mit 20% FBS resuspendiert.
   5. Übertragen Sie die Zellen bis 3 x 100-mm-Schalen, ohne sichtbare Überbleibsel Material zurückbleibt.
   6. Ersetzen Sie die Medien durch frische Medien alle 3 d. Aufgeteilt, die Zellen bei 80% Konfluenz unter Verwendung von 1 ml PBS / 1 mM EDTA. Pflegen bis Passage 3 vor dem Gebrauch. Teilen Sie jedes Gericht von Zellen in drei Gerichte in jedem Split.
      HINWEIS: Nach dem Durchgang Erreichen 3, Zellen, die nicht sofort eingefroren werden können, verwendet werden werden.

2. Reprogrammierung FLSS Mit Lentiviren kodierenden Yamanaka Faktoren

1. Transduction (D0)
   1. Seed 3 × 10 ⁴ Zellen pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen in Wachstumsmedium (500 ml DMEM , supplementiert mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin). Inkubiere die Zellen O / N bei 37 ° C in 5% CO2.
   2. Am nächsten Tag, entfernen Sie ein Fläschchen von Lentiviren, die 4 Yamanaka Faktoren: Oct4, Klf4, Sox2 und c-Myc aus dem Gefrierschrank und Tauwetter bei 4 ° C. Hinweis: Lentivirus wurde durch das Verfahren hergestellt , beschrieben in unserer früheren Studie ^11.
   3. Während das Virus Auftauen, ändern Sie die Medien zu FLS Wachstumsmedien (20% FBS und Antibiotika in DMEM) 10 ug / ml Hexadimethrinbromid und 50 ug / ml Ascorbinsäure enthält.
   4. Nach den Medienwechsel, fügen Sie 30 ul Lentiviren zu den Zellen und vorsichtig mischen. Zur Verbesserung der Infektion, Zentrifuge die Platte bei 680 · g, 35 ° C für 30 min.
   5. Nach der Zentrifugation inkubiert , die Zellen bei 37 ° C in 5% CO _2.
2. Wartung Bis Reprogrammierung ist sichtbar
   1. Für 3 Tage, ersetzen Sie die Medien täglich mit FLS Wachstumsmedium 0,1 mM Natriumbutyrat und 50 ug / ml Ascorbinsäure enthält.
   2. Am nächsten Tag, ersetzen Sie das Medium mit einer Mischung aus FLS Wachstumsmedien undiPSC Medien (Verhältnis 1: 1), enthaltend 0,1 mM Natriumbutyrat und 50 ug / ml Ascorbinsäure.
      Hinweis: Die Komponenten der iPSC Medien in der Materialien / Ausstattungsliste gegeben.
3. Teilen von Zellen für die Koloniebildung
   1. Bereiten Sie eine Vitronectin beschichteten 6-Well-Platte.
      1. Werden 60 & mgr; l Vitronectin bis 6 ml PBS ohne Ca ²⁺ und Mg ^2+. Setzen Sie 2 ml Mischung in den einzelnen Wells und Inkubation mindestens 1 Stunde in RT. Hinweis: Die Arbeitskonzentration von Vitronectin beträgt 5 & mgr; g / mL.
   2. Auf D5, waschen Sie die Zellen mit PBS.
   3. 1 ml PBS / 1 mM EDTA , die Zellen abzulösen und bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 2 min inkubieren.
   4. Ernten Sie die Zellen und Zentrifuge bei 250 xg, RT für 2 min.
   5. Aufgeteilt, die Zellen bei 3 verschiedenen Verhältnissen (1: 3, 1: 6 und 1: 9) an unterschiedliche confluencies erzielen. Hinzufügen, 900 & mgr; l Medium zu dem Zellpellet und resuspendieren. Hinzufügen von 300, 150 und 100 & mgr; l der Zellmischung pro Vertiefung einer 6-3, 1: 6 und 1: 9, jeweils Well-Platte ein Verhältnis von 1 zu erreichen.
   6. Ersetzen Sie die Medien täglich mit iPSC Medien bis Kolonien erscheinen. Die Kolonien werden nach etwa D18 erscheinen. Anmerkung: In diesem Stadium iPSC Kolonien koexistieren mit dem nicht umprogrammiert FLSS.
4. Colony Kommissionierung
   1. Bereiten Sie eine 48-Well Vitronectin beschichteten Platte durch Zugabe von 500 ul Vitronectin an den Brunnen, und bei RT inkubieren mindestens 1 Stunde für.
   2. Stellen Sie das Mikroskop auf eine saubere Bank, und entfernen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator.
   3. Entfernen Sie die Vitronectin-Lösung aus der 48-Well-Platte und fügen 500 ul iPSC Medien, ergänzt mit 10 mM Rho-assoziierten, Coiled-Coil-containing protein kinase (ROCK) -Inhibitor.
   4. Mit Hilfe eines 10p-Pipettenspitze, schneiden um die Kolonie. Übertragen Sie die gepflückt Kolonie zu einer Vertiefung der 48-Well-Platte.
   5. Mehrere Kolonien Nach der Kommissionierung, Inkubation der Zellen bei 37 ° C, 5% CO _2.
   6. Pflegen Sie die Zellen, bis die Kolonien groß eno sindPfui für die Übertragung. Hinweis: Wir in der Regel die Zellen verschüttet, wenn die Kolonie aus dem sichtbaren Bereich des Mikroskops wird, wenn bei 100-facher Vergrößerung betrachtet.

3. Immunfluoreszenzanfärbung

1. Zellpräparation
   1. Legen Sie eine sterile 18 mm Deckglas in eine 12-Well-Platte.
   2. 1 ml PBS des Deckglases abkühlen lassen und abspülen.
   3. Ersetzen mit 1 ml einer 10 ug / ml Vitronectin Lösung.
   4. Die Platte bei RT für mindestens 1 Stunde.
   5. Entsorgen Sie die Vitronectin - Lösung und Platte iPSCs in den Vitronectin beschichteten 12-Well - Platte und Kultur für 7 Tage bei 37 ° C, 5% CO _2, täglich die Medienwechsel.
2. Zellfärbung
   1. Entsorgen Sie die Kulturmedien und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
   2. Fixieren Sie die Zellen in 0,4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bei RT.
   3. Permeabilisierung der Zellen mit 0,1% Triton X-100 für 5 min bei RT.
   4. Entfernen Sie die PermeabilisierungLösung und Block mit PBS 2% Rinderserumalbumin (BSA) für 30 min bei RT enthält.
   5. Verdünne die Antikörper in PBS , enthaltend 2% BSA gemäß Tabelle 1. Inkubieren der Zellen mit den primären Antikörpern für 2 h bei RT.
   6. Fügen Sie den sekundären Antikörper (1: 200 verdünnt) und Inkubation der Zellen für 1 h bei RT, Licht zu vermeiden.
   7. Behandeln Sie die Zellen mit 1 & mgr; l / ml DAPI für 10 min.
   8. Legen Sie das Deckglas auf dem Glasobjektträger mit Antifade-Reagenz und Inkubation bei RT für 24 h, Vermeidung von Licht.
   9. Stellen Sie sicher, Ausdruck mit einem Fluoreszenzmikroskop.

4. Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)

1. Extrahieren von mRNA aus dem Zellpellet unter Verwendung des Guanidinium - Thiocyanat-Phenol-Chloroform - Extraktionsverfahren ^11.
2. Amplify cDNA von 2 ug Gesamt - mRNA unter Verwendung der reversen Transkription ^11.
3. Mischen Sie die Komponenten für die PCR benötigten mit 2 ul cDNA temPlatte ^11.
4. Führen Sie RT-PCR und überprüfen Sie die Ergebnisse durch Gelelektrophorese ^11.

5. Alkalische Phosphatase (AP) Staining

1. Kultur iPSCs für 5-7 Tage bei 37 ° C, 5% CO ₂ vor der Färbung.
2. Absaugen Medien und fixieren die Zellen mit 4% PFA für 1 min.
3. Entsorgen Sie die Fixiermittel und spülen Sie die Zellen mit 1X Spülpuffer.
4. Bereiten Sie die Reagenzien für die AP-Färbung. Mischen Sie die Reagenzien in folgendem Verhältnis: Fast Red Violet: Naphthol AS-BI-Phosphat-Lösung: Wasser = 2: 1: 1.
5. Inkubieren der Zellen mit der Färbelösung bei RT für 15 min, leicht vermieden werden.
6. Entsorgen Sie die Farblösung und spülen Sie die Zellen mit Spülpuffer.
7. Decken Sie die Zellen mit PBS Austrocknen zu verhindern und sicherzustellen, Ausdruck einer Hellfeld-Mikroskop.

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Ergebnisse

In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll iPSCs von FLSS Verwendung eines lentiviralen System zu erzeugen. 1A zeigt ein einfaches Schema des FLS Isolierungsprotokoll. Verwendung von chirurgischen Scheren nach der chirurgischen Entfernung der Synovia wurde das Gewebe in kleine Stücke zerhackt. Kollagenase wurde zugegeben, um die Zellen aus den Gewebeklumpen zu isolieren. Die Zellen wurden für 14 Tage vor der weiteren Verarbeitung inkubiert. 1B

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Diskussion

Vor der Entdeckung von iPS-Zellen, vor allem Wissenschaftler verwendeten WSR Stammzellbiologie und andere Zelllinien durch Differenzierung zu untersuchen. Allerdings stammen WSR von der inneren Masse eines Blastozyste, die eine im Frühstadium Embryo ist. WSR, Zerstörung der Blastozyste zu isolieren, ist unvermeidlich, die Erhöhung ethische Fragen, die zu überwinden sind unmöglich. Darüber hinaus, obwohl WSR stemness Eigenschaften und Pluripotenz haben, können sie nicht von Personen gewonnen werden und sind manchm...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 mlL Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 ml)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/ml)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde (PFA)	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004