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摘要

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

摘要

RNA测序（RNA测序）是可以被用于检测和表征的基因表达，突变，基因融合，和非编码RNA一个通用的方法。标准RNA测序需要30 - 亿测序读出并可以包括多个RNA产物如mRNA和非编码RNA。我们证明有针对性的RNA测序（捕获）如何允许在使用桌面序选定的RNA产品聚焦研究。 RNA测序采集可以表征可能以其它方式使用传统的RNA测序方法错过没有注释，低或瞬时表达成绩单。在这里，我们描述了从细胞系，核糖体RNA耗尽，cDNA合成，制备条形码库，杂交和靶向转录物的捕获和多重测序上的桌面序的RNA的提取。我们也勾勒出计算分析管道，其中包括质量控制评估，校准，检测融合，基因表达定量和单国统会的鉴定leotide变种。该测定允许有针对性的转录测序来表征的基因表达，基因融合，和突变。

引言

Whole transcriptome or RNA sequencing (RNAseq) is an unbiased sequencing method to assess all RNA products. The goal of targeted RNAseq (Capture) is a focused evaluation of selected transcripts with increased sensitivity, dynamic range, reduced cost or scale, and increased throughput compared to standard RNAseq. Similar to standard RNAseq, targeted enrichment approaches can be used to evaluate gene expression, multiple RNA species such as mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, other noncoding RNAs2, gene fusions3, and mutations4-6.

Capture involves hybridization of complementary oligonucleotides to enrich cDNA libraries for sequencing. The rationale for RNAseq Capture is similar to microarray approaches where complementary oligonucleotides or probes are hybridized to samples and then measured for relative abundance. For microarray technologies, expression is based on relative signal measured for transcripts binding to these probes. Microarrays are thus limited by range, potential background noise from non-specific binding, and cross-hybridization of probes. Furthermore, arrays have limited dynamic range for low and highly expressed transcripts compared to RNAseq1. Microarrays are widely utilized due to their reduced cost and high throughput capacity compared to RNAseq.

Here, we demonstrate a method for RNAseq Capture that offers a middle ground between RNAseq and microarray approaches for evaluating the transcriptome. RNAseq Capture has intermediate throughput, greater dynamic range and sensitivity, and is scaled for fast turnaround on desktop sequencers. RNAseq Capture also requires reduced computational resources in terms of storage space and data processing.

研究方案

注意:此协议说明了同时处理和4个样品的分析。这种方法是用RNA从细胞中分离，新鲜冷冻组织和福尔马林固定，石蜡包埋的组织的（FFPE）兼容。该协议始于50 - 从RNA输入每个样本的1000纳克（250纳克推荐）。

1. rRNA的消耗和RNA议事碎片

  1. rRNA的消耗
    1. 在室温下除去洗脱，素，片段组合，rRNA的去除组合，rRNA的结合缓冲液和重悬浮缓冲液从-20℃并解冻。从4℃除去的洗脱缓冲液，rRNA的去除珠和RNA / cDNA的特定顺磁性珠粒，并把到室温。
    2. 添加0.25微克RNA​​对PCR管。稀释用不含核酸酶的超纯水的总RNA，以10微升总终体积。添加5微升的rRNA结合缓冲液，以每管再加入的rRNA去除混合5微升，轻轻pipettË向上和向下混合。在与盖的热循环仪的地方管预加热至100℃，程序热循环仪于68℃5分钟以变性RNA。
    3. RNA变性后，从热循环仪取出试管并在室温下孵育1分钟。涡rRNA基因去除珠管大力重悬珠。添加35微升的rRNA去除珠新管和转移RNA变性反应（20微升）添加到含有的rRNA去除珠管。
    4. 调整吸管45微升和吸管迅速向上和向下20X混合。在RT孵育管1分钟。然后放置在磁性支架管在室温下放置1分钟。转移上清液至新标记的PCR试管中在磁性支架再次将这些试管在室温下放置1分钟。这将确保没有珠粒转移。转移上清至新标记的PCR管。
    5. 涡流的RNA / cDNA的特定顺磁珠，并添加99微升的珠每管。轻轻吸管整个音量上下10倍混合。如果有降级-RNA起，加193微升充分混合的RNA / cDNA的顺磁性的珠子，每管。孵育在室温下进行15分钟。然后将试管在室温下的磁性支架5分钟。取下并丢弃上清液。
    6. 加入200μl新鲜配制的70％乙醇（乙醇）的。保持磁架管和照顾到不打扰珠。在室温下孵育30秒，然后取出并丢弃上清液。允许管放置在室温下5 - 10分钟进行干燥。
    7. 离心机解冻室温洗脱缓冲液在600×g下5秒。添加11微升洗脱缓冲液对每个管和轻轻吸取上下10倍混合。在RT孵育管2分钟。放置在磁性支架管在室温下5分钟。将上清转移的8.5μl到新标记的PCR试管中。
  2. rRNA基因RNA耗尽的碎片
    1. 加入8.5微升埃尔UTE，8.5微升黄金和8.5微升片段组合，以每管。吸管轻轻向上和向下10倍混合。地方管在与下面的程序热循环仪:预加热盖至100℃，94℃8分钟，然后4℃保持。
      注意:此步骤是为了产生155碱基对的平均插入片段大小。如果RNA样品的平均片段大小低于200基点，跳过此步骤并继续执行第一链cDNA合成。

2. cDNA合成

  1. 合成第一链cDNA
    1. 从-20°C取出第一链合成的混合，在室温下解冻。
    2. 预编程热循环仪，使用以下设置:预热盖选项和设定为100℃，然后25℃10分钟，42℃15分钟，70℃15分钟，并保持在4℃下。程序保存为"合成第一链。"
    3. 在600＃离心机解冻-第一链合成混合管215;克5秒。将1微升逆转录酶与9微升第一链合成混合。
    4. 添加8微升第一链合成的和逆转录酶混合到每个管中，轻轻地吸取上下6倍混合。使用固定速度的迷你台式离心机在600 XG 4秒的离心管中，使液体底部。将管在热循环仪，并选择合成第一链。当热循环仪达到4℃，除去管和立即进行合成第二链cDNA。
  2. 合成cDNA第二链
    1. 预热热循环仪，以16℃下与盖子预先加热至30℃。解冻第二链预混并在冰上再悬浮缓冲。在事先从4℃除去的顺磁性珠的瓶子，静置至少30分钟，以使它们到室温。
    2. 添加5μl的重悬浮缓冲液，以每个PCR管中。离心机第二链预混600×g下5秒，并添加20微升到每个PCR管中。地方管在16℃，1小时预热的热循环仪。当完成温育后，从热循环仪取出，并允许管来室温。
    3. 涡流的顺磁性珠粒，直到它们被充分分散。添加90微升充分混合的顺磁珠到每个管中。轻轻吸取整个音量上下10倍混合。在室温下孵育管15分钟。在室温下的磁性支架5分钟地方管。
    4. 取下并丢弃135微升上清液然后离开磁力架管进行乙醇洗。加入200μl新鲜制备的80％的乙醇，以每管，而不会干扰所述珠，然后在室温下孵育30秒。取下并丢弃所有的上清液从每个。重复一共有两个80％的乙醇洗涤。
    5. 让试管在室温下静置5 - 10分钟以在磁性支架干燥。离心解冻室temperatur在600×克5秒ê悬浮缓冲液。从磁性底座取出PCR管。添加17.5微升悬浮缓冲液到每个PCR管，轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。孵育管在室温下2分钟。
    6. 在室温下5分钟的磁性支架地方管，然后转移15微升上清液（双股cDNA）至0.2ml的PCR条管中。
      注意:这是如cDNA可被储存在-20℃下长达7天的安全停止点。

3.文库制备

  1. 腺苷酸3'端
    1. 在室温下拆下-20°C和解冻A尾组合。预编程热循环仪使用以下设置:选择预热盖选项和设定为100℃，然后将在37℃30分钟，70℃5分钟，并保持在4℃。这个程序保存为"ATAIL70"。
    2. 加入2.5微升再悬浮的缓冲到每个管中。然后加入12.5微升解冻A尾组合。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。将管在热循环仪，并选择ATAIL70。当热循环仪的温度是在4℃下，从热循环仪取出PCR管并立即进行结扎适配器。
  2. 结扎适配器
    1. 除去合适的RNA适配器管，从-20℃停止连接缓冲液和重悬浮缓冲液并在室温下解冻。直到指示在协议中这样做，不要从-20°C除去连接混合物管。从4℃除去的顺磁性珠的瓶子，静置至少30分钟，使至室温。
    2. 预加热热循环仪，以30℃，并选择预加热盖选项和设定为100℃。离心600×克5秒解冻RNA适配器管。在使用前立即从-20℃取出连接混合物管存储。
    3. 添加2.5微升的再悬浮缓冲液中向每个样品管中。加入2.5微升连接混合物。返回连接混合物管-20°C使用后立即存储。添加2.5微升解冻的RNA适配器索引的向每个样品管中。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。
    4. 使用固定速度的迷你台式离心机在600×g的时间为4秒离心管中。管放置在预热的热循环仪。盖上盖子，在30℃下孵育10分钟。
    5. 除去从热循环仪管和添加5微升停止连接缓冲液到每个管灭活结扎。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。
    6. 2.2.4，使用42微升的混合顺磁珠，并丢弃79.5微升上清 - 如2.2.3所述重复洗。与在磁性支架上的管，让在室温下进行5样品风干 - 10分钟。
    7. 拆下的PCR条管磁架，并添加52.5微升悬浮缓冲液每管。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。在室温下孵育管2分钟。放置在RT磁性支架上的管5分钟，或直至所述液体是明确的。转移上清液加入50μl来自每个管新0.2毫升的PCR条管中。注意不要打扰珠。
    8. 2.2.4，用50微升的混合顺磁珠，并丢弃95微升上清 - 如2.2.3所述重复洗。与在磁性支架上的管，让在RT样品风干5 - 10分钟。
    9. 从磁性底座上卸下的PCR条管和添加22.5微升重悬浮缓冲液到每个管中。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。
    10. 孵育在RT管2分钟。放置在磁性支架上的管，在室温下放置5分钟或直至液体是明确的。转移20微升上清液从每个管到一个新0.2毫升PCR条管。注意不要打扰珠。这是一种安全的停止点和cDNA可以储存在-20℃达7天。

4.图书馆放大

  1. 丰富DNA片段
    1. 在室温下取出PCR主混合物，PCR引物鸡尾酒和再悬浮缓冲从-20°C的存储和解冻。除去从4℃贮存的顺磁性珠的瓶中，静置至少30分钟，使至室温。
    2. 预编程热循环仪使用以下设置:选择预热盖选项和设定为100℃，然后在98℃设定的初始变性在98℃，30秒，变性的15个循环持续10秒，退火在60℃下30秒，和延伸72℃30秒，在72℃下的最后一个扩展周期为5分钟，并保持在4℃。程序保存为"PCR"。
    3. 离心解冻PCR主在600×g下5秒混合和PCR引物的管。添加5微升的解冻PCR引物，以每个样品管中。加入25微升解冻PCR扩增预混每个样品管中。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。
    4. 请将加盖PCR条管的预编程热循环仪。盖上盖子，运行PCR程序。当PCR完成后，从热循环仪取出试管，并保持在冰上。
    5. 2.2.4，用50微升的混合顺磁珠，并丢弃95微升上清 - 如2.2.3所述重复洗。与在磁性支架上的管，让在室温下进行5样品风干 - 10分钟。
    6. 从磁性支架移除管和添加32.5微升重悬浮缓冲液到每个样品管中。轻轻吸取整个音量上下10倍到调匀。孵育在室温下进行2分钟。放置在磁性支架上的PCR试管在室温下5分钟，或直至所述液体是明确的。然后换乘30微升苏pernatant新鲜0.2毫升PCR管。
    7. 使用荧光计7执行cDNA的定量和使用毛细管电泳系统8确定的cDNA质量。
      注意:这是一个安全的停止点和cDNA可以储存在-20℃达7天。注:该库被认为是一种RNA测序文库。
      后续步骤导致捕获库。

5.杂交，捕获和测序

  1. 复用杂交
    1. 从-20°C删除自定义水合探头，婴儿床-1 DNA，阻断通用寡核苷酸，以及适配器特异性阻断寡核苷酸和解冻冰。
    2. 在低绑定1.5mL管中，并结合500 ng的DNA（每个样品125纳克时，复用4个样本），5微升婴儿床-1 DNA（1微克/微升），1UL通用阻断寡核苷酸，0.5微升P7（6个核苷酸）适配器特定阻断寡核苷酸（该量可能需要根据多路复用conditi进行调整项）和0.5微升P7（8核苷酸）适配器特异性阻断寡聚（该量可能需要根据多路复用条件）进行调整。
    3. 将样品管在真空浓缩器具有面向旋转的相反方向帽打开。在45℃下20分钟，或直至所述液体完全蒸发干燥的内容。
    4. 干重悬内容与8.5微升2X杂交缓冲液，3.4微升杂交A组份和1.1微升无核酸酶的水。允许再悬浮和涡每2.5分钟10分钟。再悬浮的物质转移至0.2mL的PCR管并在95℃下孵育10分钟在热循环。
    5. 从热循环仪中删除的杂交样品管，加入2微升重新悬浮在1.5皮摩尔/微升的浓度定制探针。备选地，加入4微升重新悬浮在0.75皮摩尔/微升的浓度定制探针。孵育杂交反应过夜 - 在65℃下（16 24小时）。
      注:探头从不同的供应商处购买之间可以使用和制造商的说明应遵循。杂交步骤的持续时间也可以变化。
  2. 珠制备及捕获
    1. 从4℃除去的链霉抗偶联的顺磁珠瓶并在室温下平衡30分钟。稀释10倍的洗涤缓冲液（I，II，III和严格）和2.5倍珠洗涤液以创建1X工作方案。
    2. 等分试样140微升1×洗涤缓冲液的我成到一个新的1.5毫升管。的1倍严格缓冲热量全部量，并在65℃下1×洗涤缓冲液I的等分试样在至少2小时的热块。
    3. 等份加入100μl的每捕获蛋白链菌素偶联的顺磁珠到1.5毫升管。放置在磁铁和弃上清。添加每100微升磁珠200μl的珠洗涤缓冲液并涡旋10秒。在磁铁将用于2 - 5分钟或直到上清液是显而易见的。一旦上清液是明确的，放弃它，并重新泥炭一次，总共两次洗涤的。
    4. 拆除珠子洗涤缓冲液后，加入等体积的珠洗涤液作为初始起点体积（ 即 100微升一个捕获）。重悬并转移到0.2mL的PCR管中。将管磁架为2 - 5分钟或直到上清液是显而易见的。弃上清。
    5. 既在在65℃的热循环仪的杂交样品和珠，杂交混合物转移到珠管和移液管上下10倍混合。孵育在65℃下45分钟，涡旋，并使用一个固定的速度（6.0 XG）台式微型离心机降速样品4秒。
  3. 珠洗
    1. 从热循环仪中取出捕获管，加入100微升预先加热1×洗涤缓冲液I至管，涡旋10秒以混合。将混合物转移到一个新的低绑定1.5mL管中。放置管中磁分离齿条和允许2 - 5分钟进行分离，或直至上清液是明确的。 ðiscard上清。
    2. 加入200μl预热1X严格的洗涤液和移液器上下10次混合。孵育在65℃下5分钟。把试管磁分离架上，并允许2 - 3分钟分离或直到上清液是显而易见的。弃上清。重复严格洗涤一次，总共两次洗涤的。
    3. 加入200μl室温1×洗涤缓冲液I和涡旋2分钟以混合。放置管在磁性分离架上并允许2 - 5分钟进行分离，或直至上清液是明确的。弃上清。
    4. 加入200μl室温1×洗涤缓冲液II和涡旋1分钟以混合。放置管在磁性分离架上并允许2 - 5分钟进行分离，或直至上清液是明确的。弃上清。
    5. 加入200μl室温1×洗涤缓冲液III和涡旋30秒以混合。放置管中磁分离机架允许2 - 5分钟进行分离，或直至上清液清楚了。弃上清。
    6. 从磁分离机架上卸下该管，并添加20微升不含核酸酶的水重悬珠子。吹打向上和向下10倍调匀。
  4. 拍摄后的PCR扩增
    1. 从4℃除去顺磁珠，在室温下平衡30分钟。
    2. 在RT除去-20℃并解冻的热启动PCR预拌（2×）和PCR引物混合，然后置于冰上。 27.5微升2倍热启动PCR预拌与PCR引物1的2.75微升至2.75微升PCR引物2相结合的图书馆准备扩增预混（这些卷1杂交库加过量10％）。
    3. 设置通过加入珠20微升加与文库扩增主混合物的30微升的50微升的总体积捕获的DNA在PCR管进行反应。帽筒正确，涡旋混合。 4秒的离心管使用一个固定的速度迷你卡在6.0×g的LE-离心机。
      1. 设置下述PCR程序: - 在98℃变性12个周期为15秒，退火65选择预热盖选项和设定为100℃，然后将初始变性在98℃45秒，10 ℃30秒和延伸72℃60秒，在72℃下的最后一个扩展周期为60秒并保持在4℃。
    4. 从热循环仪取出样本，加入75微升顺珠。拌匀，并在室温孵育15分钟。
    5. 放置在磁体管在室温下2 - 3分钟，然后除去上清液。通过加入200微升80％乙醇，温育30秒，然后除去上清液洗上磁珠。重复总共两次80％洗涤。
    6. 在RT孵育5 - 10分钟，以允许珠粒干燥。不要过度干燥，开裂。珠悬浮在22微升的Tris-EDTA pH值8.0（1X TE解决方案），并允许为洗脱3分钟。将样品在磁铁3 - 5分钟，日恩转移20微升洗脱的产品来新低绑定1.5mL管中，以确保没有珠结转。
    7. 执行使用荧光计7捕获的cDNA的定量和使用毛细管电泳系统8确定捕获的cDNA质量。
  5. 桌面序时的加载过程9
    1. 稀捕获cDNA文库利用10毫摩尔Tris-氯pH 8.5的具有0.1％Tween 20的解冻10N的NaOH和杂交缓冲在冰上4 1nM的最终浓度。使用前约30分钟，在解冻水RT桌面序V2试剂盒盒1。不要填写上面的最大加载线10。请注意，这是一个测序平台的具体程序和政策有可能根据制造商的说明而变化。
    2. 通过在离心管（始终准备好新鲜）20微升10 N氢氧化钠980微升核酸游离水结合准备的0.2N氢氧化钠1毫升。通过稀释PhiX库（库控制）至4纳米组合2微升10与3微升的10mM三Cl pH 8.5的纳米库控制的具有0.1％Tween 20。
    3. 5微升4nm的图书馆与5微升0.2N的氢氧化钠和旋涡简要相结合的混合最终变性图书馆和图书馆的控制。使用固定速度小型台式离心机在6.0×g下4秒离心管中。孵育在RT 5分钟以变性库。
    4. 添加990微升预冷的杂交缓冲液含有10微升变性库的管中。这导致了20 PM库。标记变性20 PM库与日期，并可以在-20℃储存长达3周。
    5. 混合375微升20日下午库控制的225微升预冷杂交缓冲液稀释库控制导致12.5分库控制。倒置几次到该溶液中混合。
    6. 结合594微升变性最终库6微升下午12时05分变性库控制和旋涡混合的。将结合SAMP乐库和磁带库控制预留冰上直到样品准备加载到桌面序试剂盒。

6.数据分析

  1. 序列质量评估
    1. 计算使用序列质量评估11原始序列数据（FASTQ文件）的质量。
      注意:此步骤有助于评估数据之前，进一步进行下游分析。该软件具有内置参数运行，并产生一组度量为每个FASTQ文件。
  2. 对准
    1. 对齐序列读取（FASTQ文件）的参考人类基因组hg19并使用Tophat2 12转录（2.0.10版本），同时提供成绩单称为一个GTF文件。输出是在所谓的BAM文件的二进制对准格式的形式。
    2. 执行包括排序，并使用Samtools 13（版本0.1.19索引后处理步骤）的BAM文件。执行重复的标记，重新排序SAM，插入尺寸计算，并使用工具皮卡德14（1.84版）增加或更换读取组。
  3. RNA测序质量评估
    1. 计算使用RNA测序质量评估RNA测序数据的一系列的质量控制指标。输入到这个软件是从Tophat2对准一个BAM文件15。输出是一个HTML文件，该目录总读取次数，重复的，映射的读百分比和rRNA的百分比， 等等 ，等等。
  4. 变异召唤
    1. 使用STAR（版本2.4.0）16对齐，然后调用单核苷酸变异使用GATK的（版本3.3-0）HaplotypeCaller 17。遵循GATK BAM后处理步骤和过滤标准标志，并从输出中删除误报。
  5. 基因表达
    1. 计算基因表达USING袖扣从燕尾服套装软件18（版本2.1.1）。
      注意:输入来自Tophat2对齐工具BAM文件。输出是在同种型，基因和转录物水平，其中，表达作为FPKM（每百万映射读取片段每千碱基）计算产生的。
  6. 融合呼叫
    1. 呼叫使用ChimeraScan 19（0.4.5版本），高顶礼帽融合20个自定义和TRUP 21每个样品的融合。注释使用Oncofuse 22（版本1.0.9b2）域的融合。

结果

在RNA测序捕捉的概略突出关键步骤示于图1。与已知的突变四癌细胞系被用来证明RNA测序捕捉技术的有效性（K562与ABL1融合，LC2与RET融合，EOL1与PDGFRalpha融合和RT- 4 FGFR3融合）。这四个样品汇集在一起​​，并进行测序2倍于台式机音序器，生成FASTQ文件100个基点的读取。 1）质量控制评估，2）对准至人类转录，3）基因表达的定量，4）?...

讨论

RNA测序Capture是RNA测序和芯片之间的中间策略评估转录的选定部分接近。捕获的优点包括在桌面序器，高吞吐量，和基因组改变的检测降低的成本，快速的周转时间。可适于表征非编码RNA 23，检测单核苷酸的方法变体4-6，检查RNA剪接，并确定基因融合或结构重排24。此外，这种方法可应用于已经经过用福尔马林固定并包埋在石蜡块24,25临床或处理的样本。

披露声明

S.R. receives funding from Novartis and Ariad Pharmaceuticals for conduct of clinical trials. S.R. immediate family members own stock in Johnson and Johnson.

致谢

We give special thanks to Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto and Eric Samorodnitsky for technical support. We would also like to thank Jenny Badillo for her administrative support for our team. We acknowledge the Ohio Supercomputer Center (OSC) for providing disk space, processing capacity, and support to run our analyses. We thank the Comprehensive Cancer Center (CCC) at The Ohio State University Wexner Medical Center for their administrative support of this work. S.R. and Team are supported by the American Cancer Society (MRSG-12-194-01-TBG), a Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award, NHGRI (UM1HG006508-01A1), Fore Cancer Research Foundation, American Lung Association, and Pelotonia.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Thermomixer REppendorf21516-166
Centrifuge 5417REppendorf5417R
miRNeasy Mini KitQiagen217004
Molecular Biology Grade EthanolSigma AldrichE7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 mlEppendorf21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)IlluminaMS-102-2002
MiSeq Desktop SequencerIllumina
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetAIlluminaRS-122-2301
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5IDT127040822
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt)IDT127040823
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt)IDT127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads Beckman-CoulterA63880
Dynabeads® M-270 StreptavidinLife Technologies65305
COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mgRoche Applied Science05480647001
Qubit® Assay Tubes Life TechnologiesQ32856
Qubit® dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32851
SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits  (24 or 96 reactions)Roche NimbleGen 05634261001 or 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorometer Life TechnologiesQ32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)IDT
Tween20 BioXtraSigmaP7949-500ML
Nuclease Free WaterLife TechnologiesAM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection ModuleBiorad185-1196
SeqCap EZ Hybridization and Wash KitsRoche Applied Science05634253001
SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μlLife Technologies18064-014
D1000 ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 mlBeckman Coulter IncA63987
RNA ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5576
RNA ScreenTape LadderAgilent Technol. Inc.5067-5578
RNA ScreenTape Sample BufferAgilent Technol. Inc.5067-5577
Sodium HydroxideSigma72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65602
DYNAMAG -96 SIDE EACHLife Technologies12331D
ChloroformSigmaC2432-1L
KAPA HotStart ReadyMixKAPA BiosystemsKK2602
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermo Scientific
My Block Mini Dry BathBenchmarkBSH200
D1000 ReagentsAgilent Technol. Inc.5067- 5583
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参考文献

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