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Résumé

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Résumé

séquençage de l'ARN (RNA-seq) est une méthode polyvalente qui peut être utilisée pour détecter et caractériser l'expression des gènes, des mutations, des fusions de gènes, et ARNs non codants. Norme exige RNA-seq 30-100000000 séquençage lit et peut inclure plusieurs produits d'ARN tels que l'ARNm et ARN non codantes. Nous démontrons comment ciblée RNA-seq (capture) permet une étude ciblée sur les produits d'ARN sélectionnés à l'aide d'un séquenceur de bureau. RNA-seq capture peut caractériser les transcriptions annotées, faibles, ou exprimés de façon transitoire qui pourraient autrement être manquées en utilisant des méthodes traditionnelles RNA-seq. Nous décrivons ici l'extraction d'ARN à partir de lignées cellulaires, l'ARN ribosomique, l'épuisement de la synthèse d'ADNc, la préparation de bibliothèques de codes à barres, l'hybridation et la capture des produits de transcription cibles, et le séquençage multiplex sur un séquenceur de bureau. Nous présentons également le pipeline d'analyse informatique, qui comprend l'évaluation du contrôle de la qualité, l'alignement, la détection de la fusion, l'expression du gène de quantification et d'identification de simple nucdes variants de leotide. Ce dosage permet un séquençage de transcription ciblé pour caractériser l'expression des gènes, des fusions de gènes et des mutations.

Introduction

Whole transcriptome or RNA sequencing (RNAseq) is an unbiased sequencing method to assess all RNA products. The goal of targeted RNAseq (Capture) is a focused evaluation of selected transcripts with increased sensitivity, dynamic range, reduced cost or scale, and increased throughput compared to standard RNAseq. Similar to standard RNAseq, targeted enrichment approaches can be used to evaluate gene expression, multiple RNA species such as mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, other noncoding RNAs2, gene fusions3, and mutations4-6.

Capture involves hybridization of complementary oligonucleotides to enrich cDNA libraries for sequencing. The rationale for RNAseq Capture is similar to microarray approaches where complementary oligonucleotides or probes are hybridized to samples and then measured for relative abundance. For microarray technologies, expression is based on relative signal measured for transcripts binding to these probes. Microarrays are thus limited by range, potential background noise from non-specific binding, and cross-hybridization of probes. Furthermore, arrays have limited dynamic range for low and highly expressed transcripts compared to RNAseq1. Microarrays are widely utilized due to their reduced cost and high throughput capacity compared to RNAseq.

Here, we demonstrate a method for RNAseq Capture that offers a middle ground between RNAseq and microarray approaches for evaluating the transcriptome. RNAseq Capture has intermediate throughput, greater dynamic range and sensitivity, and is scaled for fast turnaround on desktop sequencers. RNAseq Capture also requires reduced computational resources in terms of storage space and data processing.

Protocole

Remarque: Ce protocole décrit le traitement et l'analyse des quatre échantillons simultanés. Cette méthode est compatible avec l'ARN isolé à partir de cellules, tissus frais congelé et de tissus en paraffine fixés au formol (FFPE). Ce protocole commence avec 50 - 1000 ng (250 ng recommandé) à partir de l'entrée d'ARN pour chaque échantillon.

1. ARNr Épuisement et Fragmentation de procédure ARN

  1. ARNr Depletion
    1. Retirer éluer, premier, fragment mélange, ARNr élimination mélange, le tampon de liaison ARNr et tampon de resuspension de -20 ° C et décongélation à température ambiante. Retirer le tampon d'élution, ARNr perles d'enlèvement et de l'ARN / ADNc billes paramagnétiques spécifique de 4 ° C et porter à la température ambiante.
    2. Ajouter 0,25 pg d'ARN à tube PCR. Diluer l'ARN total avec de l'eau ultra-pure sans nucléase à un volume total final de 10 ul. Ajouter 5 pi de tampon de liaison ARNr à chaque tube, puis ajouter 5 pi d'ARNr élimination mélange et doucement pipette de haut en bas pour mélanger. Placer les tubes dans cycleur thermique à couvercle préalablement chauffé à 100 ° C et on programme cycleur thermique à 68 ° C pendant 5 minutes pour dénaturer l'ARN.
    3. Après l'ARN dénaturation, retirer les tubes de cycleur thermique et incuber à température ambiante pendant 1 min. Vortex ARNr tube de retrait des talons vigoureusement pour remettre en suspension les perles. Ajouter 35 ul de ARNr perles d'enlèvement à de nouveaux tubes et transférer la réaction ARN de dénaturation (20 pi) dans des tubes contenant de l'ARNr perles d'enlèvement.
    4. Régler la pipette à 45 pi et pipette rapidement monter et descendre 20x pour mélanger. Incuber les tubes à température ambiante pendant 1 min. Ensuite, placez les tubes en position magnétique à température ambiante pendant 1 min. Transférer le surnageant dans des tubes de PCR nouvellement étiquetés et placer ces tubes à nouveau en stand magnétique à température ambiante pendant 1 min. Cela garantit qu'aucune des billes sont transférées. Transférer le surnageant dans des tubes de PCR nouvellement étiquetés.
    5. L'ARN Vortex / ADNc spécifique des billes paramagnétiques et ajouter 99 ul de billes dans chaque tube. Doucement pipette ensemblevolume vers le haut et vers le bas 10x pour mélanger. Si à partir de l'ARN-dégradé, ajouter 193 ul de billes paramagnétiques spécifiques bien mélangé ARN / ADNc dans chaque tube. Incubation à température ambiante pendant 15 min. Ensuite, placez les tubes sur le support magnétique à température ambiante pendant 5 min. Retirer et jeter les surnageants.
    6. Ajouter 200 ul d'éthanol fraîchement préparée à 70% (EtOH). Garder les tubes sur support magnétique et de prendre soin de ne pas perturber les perles. Incuber à température ambiante pendant 30 secondes, puis retirez et jetez le surnageant. Les tubes permettent de reposer à température ambiante pendant 5 - 10 minutes pour sécher.
    7. Centrifugeuse décongelé chambre tampon d'élution de la température à 600 xg pendant 5 sec. Ajouter 11 ul de tampon d'élution à chaque tube et la pipette doucement monter et descendre 10 fois pour mélanger. Incuber les tubes à température ambiante pendant 2 min. Placer les tubes sur support magnétique à température ambiante pendant 5 min. Transférer 8,5 ul du surnageant dans des tubes de PCR nouvellement marqués.
  2. Fragmentation des ARNr Depleted ARN
    1. Ajouter 8,5 pi elute, 8,5 pi premier, et 8,5 pi de fragment mélange dans chaque tube. pipette doucement vers le haut et vers le bas 10x pour mélanger. Placer les tubes dans cycleur thermique avec le programme suivant: le couvercle préalablement chauffé à 100 ° C, 94 ° C pendant 8 minutes, puis 4 ° C attente.
      Remarque: cette étape est conçu pour générer une taille moyenne d'insert de 155 pb. Si la taille moyenne des fragments de l'échantillon d'ARN est inférieure à 200 pb, ignorez cette étape et passez à First Strand cDNA Synthesis.

2. Synthèse d'ADNc

  1. Synthétiser First Strand cDNA
    1. Retirer premier mélange de synthèse du brin de -20 ° C et décongeler à la température ambiante.
    2. Pré-programme du cycleur thermique avec les paramètres suivants: option de couvercle de préchauffage et réglé à 100 ° C, puis 25 ° C pendant 10 min, 42 ° C pendant 15 min, 70 ° C pendant 15 min et maintenir à 4 ° C . Enregistrer ce programme comme "Synthétiser 1 er Strand."
    3. Centrifugeuse le tube décongelé-première synthèse mélange brin à 600 & #215; g pendant 5 sec. Mélanger 1 pl de transcriptase inverse avec 9 ul de premier mélange de synthèse du brin.
    4. Ajouter 8 pi de synthèse du premier brin et la transcriptase inverse mélange dans chaque tube, pipette doucement monter et descendre 6x pour mélanger. Tubes à centrifuger pour 4 sec en utilisant une mini-table centrifugeuse à vitesse fixe à 6,0 xg pour amener le liquide vers le bas. Placer les tubes dans le thermocycleur et sélectionnez Synthétiser 1 er Strand. Lorsque le cycleur thermique atteint 4 ° C, retirer les tubes et procéder immédiatement à Synthétiser deuxième brin d'ADNc.
  2. Synthétiser deuxième brin d' ADNc
    1. cycleur thermique Préchauffer à 16 ° C avec couvercle pré-chauffé à 30 ° C. Thaw deuxième mélange maître brin et le tampon de remise en suspension sur de la glace. En avance, retirez la bouteille de billes paramagnétiques de 4 ° C et laisser reposer pendant au moins 30 min pour les amener à la température ambiante.
    2. Ajouter 5 ul de tampon de remise en suspension dans chaque tube de PCR. Centrifugeuse deuxième mélange maître brin à 600× g pendant 5 sec et ajouter 20 ul à chaque tube PCR. Placer les tubes dans cycleur thermique préchauffé à 16 ° C pendant 1 h. Lorsque l'incubation est terminée, retirez du cycleur thermique et permettent des tubes à venir à la température ambiante.
    3. Vortex les perles paramagnétiques jusqu'à ce qu'ils soient bien dispersés. Ajouter 90 ul de billes paramagnétiques bien mélangés dans chaque tube. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour mélanger. Incuber les tubes à température ambiante pendant 15 min. Placer les tubes sur le support magnétique à température ambiante pendant 5 min.
    4. Retirer et jeter 135 pi de surnageant puis laisser les tubes sur le support magnétique pour effectuer lavage de EtOH. Ajouter 200 ul fraîchement préparées 80% d'EtOH dans chaque tube, sans perturber les billes, puis incuber à température ambiante pendant 30 sec. Retirer et jeter tout le surnageant de chacun. Répétez l'opération pour un total de deux lavages 80% EtOH.
    5. Laissez tubes reposer à température ambiante pendant 5 - 10 min à sécher sur le support magnétique. Centrifuger le temperatur ambiante décongelée resuspension tampon à 600 × g pendant 5 sec. Retirer les tubes PCR du support magnétique. Ajouter 17,5 tampon de resuspension ul à chaque tube PCR et pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger. Incuber les tubes pendant 2 minutes à la température ambiante.
    6. Placer les tubes sur le support magnétique à température ambiante pendant 5 min, puis transférer 15 surnageant pi (ADNc double brin) à 0,2 ml PCR tubes de bande.
      NOTE: Ceci est un point d'arrêt sûr que l'ADNc peut être stocké à -20 ° C pendant jusqu'à 7 jours.

3. Bibliothèque Préparation

  1. Adénylate 3 'Ends
    1. Retirer A-tailing mélange de -20 ° C et décongélation à température ambiante. Pré-programme du cycleur thermique avec les paramètres suivants: choisir l'option de couvercle de pré-chauffage et réglé à 100 ° C, puis fixé à 37 ° C pendant 30 min, 70 ° C pendant 5 min et maintenir à 4 ° C. Enregistrer ce programme comme "ATAIL70."
    2. Ajouter 2,5 ul de resuspensionun tampon pour chaque tube. Puis ajouter 12,5 pi de décongelé A-tailing mix. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger. Placer les tubes dans le thermocycleur et sélectionnez ATAIL70. Lorsque la température du cycleur thermique est à 4 ° C, retirer les tubes PCR du thermocycleur et procéder immédiatement à ligaturer des adaptateurs.
  2. Adaptateurs ligaturer
    1. Retirer tubes adaptateurs d'ARN appropriés, arrêter un tampon de ligature et tampon de resuspension de -20 ° C et décongeler à la température ambiante. Ne pas retirer le tube ligature de mélange de -20 ° C jusqu'à ce que les instructions de le faire dans le protocole. Retirez la bouteille de billes paramagnétiques de 4 ° C et laisser reposer pendant au moins 30 minutes pour amener à la température ambiante.
    2. Préchauffer le cycleur thermique à 30 ° C et choisissez l'option de couvercle de pré-chauffage et réglé à 100 ° C. Centrifugeuse les ARN adaptateur Tubes décongelés à 600 × g pendant 5 sec. Immédiatement avant utilisation, retirer le tube ligature de mélange de -20 ° Cstockage.
    3. Ajouter 2,5 ul de tampon de remise en suspension dans chaque tube à échantillon. Ajouter 2,5 pi de mélange de ligature. Retour le tube ligature de mélange à -20 ° C stockage immédiatement après utilisation. Ajouter 2,5 ul de l'index d'adaptateur d'ARN décongelé à chaque tube d'échantillon. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger.
    4. Tubes à centrifuger pour 4 sec en utilisant une mini-table centrifugeuse à vitesse fixe à 6,0 x g. Placer les tubes dans le cycleur thermique préchauffé. Fermer le couvercle et incuber à 30 ° C pendant 10 min.
    5. Retirer les tubes de cycleur thermique et ajouter 5 pl de tampon de ligature d'arrêt à chaque tube pour inactiver la ligature. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger.
    6. Répétez lavage comme décrit dans 2.2.3 - 2.2.4, en utilisant 42 ul de billes mixtes paramagnétiques, et à rejeter 79,5 surnageant ul. Avec les tubes sur le support magnétique, laisser les échantillons d'air sec à la température ambiante pendant 5 - 10 min.
    7. Retirez les bandes de tubes PCR de laLe support magnétique et ajouter un tampon de remise en suspension 52,5 ul à chaque tube. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger. Incuber les tubes à température ambiante pendant 2 min. Placer les tubes sur le support magnétique à température ambiante pendant 5 min ou jusqu'à ce que le liquide est clair. Transfert 50 pi de surnageant de chaque tube à nouveau 0,2 ml PCR tubes de bande. Prenez soin de ne pas perturber les perles.
    8. Répétez lavage comme décrit dans 2.2.3 - 2.2.4, en utilisant 50 pi de perles mixtes paramagnétiques, et en rejetant 95 surnageant ul. Avec les tubes sur le support magnétique, laisser les échantillons sécher à l'air à température ambiante pendant 5 à 10 min.
    9. Enlever les tubes de la bande PCR à partir du support magnétique et ajouter un tampon de remise en suspension 22,5 ul à chaque tube. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger.
    10. Incuber les tubes à température ambiante pendant 2 min. Placer les tubes sur le support magnétique à température ambiante pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que le liquide est clair. Transfert 20 ul surnageant de chaque tube à unenouvelle PCR tube de 0,2 ml de la bande. Prenez soin de ne pas perturber les perles. Ceci est un point d'arrêt sûr et l'ADNc peut être stocké à -20 ° C pendant jusqu'à 7 jours.

4. Bibliothèque Amplification

  1. Enrichir fragments d' ADN
    1. Retirez le mélange maître PCR, PCR primaire cocktail et tampon de resuspension de -20 ° C stockage et décongélation à température ambiante. Retirez la bouteille de billes paramagnétiques de 4 ° C de stockage et laisser reposer pendant au moins 30 minutes pour amener à la température ambiante.
    2. Pré-programme du cycleur thermique avec les paramètres suivants: choisir l'option de couvercle de pré-chauffage et réglé à 100 ° C, puis réglez dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 secondes, 15 cycles de dénaturation à 98 ° C pendant 10 sec, recuit à 60 ° C pendant 30 secondes, et extension à 72 ° C pendant 30 secondes, une étape d'élongation finale à 72 ° C pendant 5 min et le maintenir à 4 ° C. Enregistrer ce programme comme «PCR».
    3. Centrifuger le maître PCR décongelémélanger et des amorces de PCR tubes à 600 g pendant 5 sec. Ajouter 5 ul d'amorces de PCR décongelés à chaque tube d'échantillon. Ajouter 25 ul de décongelé mélange maître PCR dans chaque tube d'échantillon. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger.
    4. Placer les tubes en forme de bande PCR coiffés dans le cycleur thermique préprogrammé. Fermer le couvercle et exécuter le programme PCR. Lorsque la PCR est terminée, retirez les tubes de cycleur thermique et garder sur la glace.
    5. Répétez lavage comme décrit dans 2.2.3 - 2.2.4, en utilisant 50 pi de perles mixtes paramagnétiques, et en rejetant 95 surnageant ul. Avec les tubes sur le support magnétique, laisser les échantillons d'air sec à la température ambiante pendant 5 - 10 min.
    6. Enlever les tubes du support magnétique et ajouter un tampon de remise en suspension 32,5 ul de chaque tube d'échantillon. pipette doucement la totalité du volume de haut en bas 10x pour bien mélanger. Incubation à température ambiante pendant 2 min. Placer les tubes de PCR sur le support magnétique à température ambiante pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que le liquide est clair. Ensuite, transférer 30 pi supernatant à 0,2 ml tubes PCR frais.
    7. Effectuer la quantification de l' ADNc en utilisant un fluoromètre 7 et déterminer la qualité d'ADNc en utilisant un système d'électrophorèse capillaire 8.
      NOTE: Ceci est un point d'arrêt sûr et l'ADNc peut être stocké à -20 ° C pendant jusqu'à 7 jours. Remarque: Cette bibliothèque est considérée comme une bibliothèque RNA-seq.
      Les étapes ultérieures conduisent à une bibliothèque de capture.

5. Hybridation, Capture et séquençage

  1. hybridation multiplexée
    1. Retirer les sondes sur mesure hydratés, Cot-1 DNA, oligos blocage universel et oligos bloquants spécifiques de l'adaptateur de -20 ° C et de dégel sur la glace.
    2. Dans une liaison de 1,5 tube à faible ml, mélanger 500 ng d'ADN (125 ng par échantillon lorsque le multiplexage 4 échantillons), 5 pi Cot-1 DNA (1 pg / pl), 1UL oligos de blocage universel, 0,5 pi p7 (6 nucléotide) adaptateur spécifique bloquant oligos (ce montant peut être nécessaire d'ajuster en fonction de conditi multiplexons) et 0,5 ul p7 (8 nucléotide) adaptateur oligos bloquants spécifiques (ce montant peut être nécessaire d'ajuster en fonction des conditions multiplex).
    3. Placer le tube d'échantillon dans un concentrateur sous vide avec capuchon ouvert dans le sens opposé de rotation. Extrait sec à 45 ° C pendant 20 minutes ou jusqu'à évaporation complète du liquide.
    4. Resuspendre contenu séché avec 8,5 ul 2x tampon d'hybridation, 3,4 pi composante d'hybridation A et de l'eau libre 1.1 nucléase ul. Autoriser 10 min pour la remise en suspension et vortex toutes les 2,5 minutes. Transfert de matériau remis en suspension dans un tube PCR de 0,2 ml et on incube à 95 ° C pendant 10 min sur un thermocycleur.
    5. Retirer le tube d'échantillon d'hybridation à partir cycleur thermique et ajoute 2 pl de sondes personnalisées remises en suspension à une concentration de 1,5 pmole / ul. En variante, ajouter 4 pi de sondes personnalisées remises en suspension à une concentration de 0,75 pmole / ul. Incuber réaction d'hybridation pendant la nuit (16-24 h) à 65 ° C.
      NOTE: Sondes achetés auprès de divers fournisseurs peuvent être utilisés et les instructions du fabricant doivent être suivies. La durée de l'étape d'hybridation peut également varier.
  2. Bead Préparation et capture
    1. Enlever une bouteille de billes paramagnétiques de streptavidine couplée de 4 ° C et on équilibre à la température ambiante pendant 30 min. Diluer 10x Wash Tampons (I, II, III, et stringentes) et Perle 2.5x Wash Buffer pour créer des solutions de travail 1x.
    2. Aliquoter 140 pi de tampon de lavage 1x I dans un nouveau tube de 1,5 ml. toute la chaleur quantité de tampon stricte 1x et aliquote de tampon de lavage 1x I à 65 ° C dans un bloc de chaleur pendant au moins 2 h.
    3. Aliquote de 100 ul de billes paramagnétiques de streptavidine couplée par la capture dans un tube de 1,5 ml. Placer sur aimant et éliminer le surnageant. Ajouter 200 pi de tampon de lavage des billes par 100 ul de perles de vortex et pendant 10 sec. Placer sur l'aimant pendant 2 - 5 min ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. Une fois que le surnageant est clair, jetez-le et rela tourbe, une fois de plus pour un total de deux lavages.
    4. Après élimination du tampon de lavage des billes, ajouter du tampon de lavage des billes de volume égal que le volume initial de départ (soit 100 ul pour une capture). Resuspendre et transfert à un tube de 0,2 ml PCR. Placer le tube dans le rack magnétique pendant 2 - 5 min ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. surnageant Jeter.
    5. Avec à la fois l'échantillon d'hybridation et de perles dans le cycleur thermique à 65 ° C, transférer le mélange d'hybridation pour le tube de talon et la pipette de haut en bas 10x pour mélanger. Incuber à 65 ° C pendant 45 min, vortex et centrifuger l'échantillon pendant 4 secondes avec une vitesse fixe (6,0 xg) de table mini-centrifugeuse.
  3. Bead Wash
    1. Retirer le tube de capture de cycleur thermique et ajouter le tampon de lavage 1x 100 pi préchauffé I du tube et vortex pendant 10 secondes pour mélanger. Transférer le mélange à un faible 1,5 bind nouveau tube de ml. Placer le tube dans un rack de séparation magnétique et prévoir 2 - 5 min pour la séparation ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. résurnageant iscard.
    2. Ajouter 200 pi de tampon préchauffé de lavage stringent 1x et la pipette de haut en bas 10 fois pour mélanger. Incuber à 65 ° C pendant 5 min. Placer le tube dans le rack de séparation magnétique et permettre à 2 - 3 min pour la séparation ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. surnageant Jeter. Répéter le lavage stringent une fois de plus pour un total de deux lavages.
    3. Ajouter 200 chambres ul 1x température de lavage tampon I et vortex pendant 2 min pour mélanger. Placer le tube dans le rack de séparation magnétique et permettant 2-5 min pour la séparation ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. surnageant Jeter.
    4. Ajouter 200 pi 1x température ambiante tampon de lavage II et vortex pendant 1 min pour mélanger. Placer le tube dans le rack de séparation magnétique et permettant 2-5 min pour la séparation ou jusqu'à ce que le surnageant soit clair. surnageant Jeter.
    5. Ajouter 200 pi 1x température ambiante tampon de lavage III et vortex pendant 30 secondes pour mélanger. Placer le tube dans le rack de séparation magnétique permettant 2-5 min pour la séparation ou jusqu'à ce que le surnageantest clair. surnageant Jeter.
    6. Retirer le tube du rack de séparation magnétique et ajouter de l'eau sans nucléase 20 pi pour remettre en suspension les perles. Mélanger soigneusement par pipetage de haut en bas 10 fois.
  4. Amplification PCR Capture Poster
    1. Retirer des billes paramagnétiques de 4 ° C et on équilibre à la température ambiante pendant 30 min.
    2. Retirez le démarrage à chaud PCR Ready Mix (2x) et PCR Primer Mix de -20 ° C et décongélation à température ambiante puis placer sur la glace. Préparer la bibliothèque amplification Mix Master en combinant 27,5 pi de démarrage à chaud 2x PCR Ready Mix avec 2,75 ul de PCR Primer 1 et 2,75 pi d'amorce de PCR 2 (ces volumes sont pour 1 bibliothèque d'hybridation plus 10% en excès).
    3. Configuration de la réaction dans le tube PCR en ajoutant 20 ul de billes ainsi que l'ADN capturé avec 30 pi d'amplification bibliothèque master mix pour un volume total de 50 ul. Cap tubes correctement et vortex pour mélanger. Tubes à centrifuger pour 4 sec en utilisant un onglet mini vitesse fixele-centrifugeuse à 6,0 x g.
      1. Mettre en place le programme de PCR suivant: choisissez l'option de couvercle de pré-chauffage et réglé à 100 ° C, puis réglez dénaturation initiale à 98 ° C pendant 45 secondes, 10 - 12 cycles de dénaturation à 98 ° C pendant 15 sec, recuit à 65 ° C pendant 30 secondes et extension à 72 ° C pendant 60 secondes, un cycle d'extension finale à 72 ° C pendant 60 secondes et maintenir à 4 ° C.
    4. Retirer l'échantillon de thermocycleur et ajouter 75 ul billes paramagnétiques. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 15 min.
    5. Placer les tubes sur l'aimant à la température ambiante pendant 2 - 3 min, puis retirer le surnageant. Lavez perles sur l'aimant en ajoutant 200 pi de 80% d'éthanol, l'incubation pendant 30 secondes, puis enlever le surnageant. Répétez l'opération pour un total de deux 80% lavages.
    6. Incuber à température ambiante pendant 5 - 10 minutes pour permettre aux billes de sécher. Ne pas trop sec à la fissuration. Remettre les billes dans 22 pl de Tris-EDTA pH 8,0 (1x TE Solution) et permettre 3 min pour l'élution. Placez l'échantillon sur l'aimant pour 3 - 5 ème minen transfert 20 ul de produit élué à un bas-bind 1,5 nouveau tube de ml, assurant aucune perles sont reportées.
    7. Effectuer la quantification des ADNc capturés à l' aide de fluorimètre 7 et déterminer la qualité d'ADNc capturé en utilisant un système d'électrophorèse capillaire 8.
  5. Séquenceur Desktop Loading Procédure 9
    1. Diluer la banque d'ADNc capturé à une concentration finale de 4 nm en utilisant 10 mM de Tris-Cl pH 8,5 avec 0,1% de Tween 20. Dégel NaOH 10 N et le tampon d'hybridation sur de la glace. Environ 30 min avant utilisation, bureau séquenceur réactif v2 kit boîte 1 dans de l'eau RT dégel. Ne pas remplir au- dessus MAX FILL LINE 10. S'il vous plaît noter que ceci est une procédure spécifique de la plate-forme de séquençage et peut varier selon les instructions du fabricant.
    2. Préparer 1 ml de NaOH 0,2 N en combinant 20 ul 10 N NaOH avec de l'eau libre 980 nucléase ul dans un tube à centrifuger (toujours se préparer frais). Diluer la bibliothèque PhiX (contrôle bibliothèque) à 4 nM parla combinaison de 2 ul de 10 contrôle de la bibliothèque nM 3 ul de 10 mM de Tris-Cl pH 8,5 avec 0,1% de Tween 20.
    3. Dénaturer bibliothèque finale et le contrôle de la bibliothèque en combinant 5 pi de bibliothèque 4 nM avec 5 pi de NaOH 0,2 N et vortex brièvement pour mélanger. Tubes à centrifuger pour 4 sec en utilisant une mini-table centrifugeuse à vitesse fixe à 6,0 x g. Incubation à température ambiante pendant 5 min pour dénaturer les bibliothèques.
    4. Ajouter 990 ul de tampon d'hybridation pré-refroidi dans les tubes contenant 10 ul de bibliothèques dénaturées. Cela se traduit par une bibliothèque de 20 pM. Marquer la bibliothèque de 20 pM dénaturé avec la date et peut être stocké pendant jusqu'à 3 semaines à -20 ° C.
    5. Mélanger 375 ul de contrôle bibliothèque de 20 pM avec 225 pi de tampon d'hybridation pré-refroidi et le contrôle de la bibliothèque diluée pour donner un contrôle bibliothèque 12,5 pM. Inversez plusieurs fois pour mélanger la solution.
    6. Combinez 594 pi de bibliothèque finale dénaturée avec 6 pi de 12h05 contrôle de bibliothèque dénaturée et vortex pour mélanger. Réglez le samp combinéle bibliothèque et le contrôle de la bibliothèque de côté sur la glace jusqu'à ce que les échantillons sont prêts à charger dans la cartouche de réactif bureau du séquenceur.

Analyse 6. Données

  1. Évaluation de la qualité de la séquence
    1. Calculer la qualité des données de séquences brutes (fichiers fastq) en utilisant la séquence d' évaluation de la qualité 11.
      REMARQUE: Cette étape permet d'évaluer les données avant qu'il ne soit plus soumis à une analyse en aval. Le logiciel fonctionne avec des paramètres en construit et produit un ensemble de paramètres pour chaque fichier fastq.
  2. Alignement
    1. Aligner séquence lit (fichiers fastq) au hg19 du génome de référence humain et transcriptome utilisant Tophat2 12 (version 2.0.10) tout en fournissant les transcriptions connues sous le nom d' un fichier de GTF. La sortie est sous la forme d'un format binaire d'alignement appelé le fichier BAM.
    2. Effectuer soumettre les étapes de traitement , y compris le tri et l' indexation en utilisant samtools 13 (version 0.1.19) Sur le fichier BAM. Effectuer double marquage, réordonner SAM, insérez calcul de la taille et l' ajout ou le remplacement des groupes de lecture à l' aide des outils Picard 14 (version 1.84).
  3. RNA-seq évaluation de la qualité
    1. Calculer une série de mesures de contrôle de qualité pour les données en utilisant RNA-seq RNA-seq évaluation de la qualité. L'entrée de ce logiciel est un fichier BAM 15 de l'alignement Tophat2. La sortie est un fichier HTML qui répertorie le nombre de lecture totale, doublons, cartographiées lire le pourcentage et le pourcentage ARNr, etc., entre autres.
  4. Calling Variant
    1. Utilisez STAR (version 2.4.0) 16 pour l' alignement, puis appeler seul nucléotide variantes utilisant de GATK (Version) étapes de 3,3 à 0 post-traitement HaplotypeCaller 17 .Follow GATK BAM et les critères de filtrage pour marquer et supprimer des faux positifs de la sortie.
  5. L'expression du gène
    1. Calculer l'expression des gènes usilogiciel Cufflinks ng (version 2.1.1) de Tuxedo Suite 18.
      NOTE: L'entrée est un fichier BAM de l'outil d'alignement Tophat2. La sortie est produite au niveau isoforme, le gène et la transcription, où l'expression est calculée comme FPKM (Fragments par Kilobase par million mappé Lit).
  6. Fusion Calling
    1. Appel de fusions chaque échantillon en utilisant ChimeraScan 19 (version 0.4.5), Tophat Fusion 20 coutume et TRUP 21. Annoter les fusions pour les domaines en utilisant Oncofuse 22 (version 1.0.9b2).

Résultats

A soulignant schématique des étapes clés dans RNA-seq capture est représenté sur la figure 1. Quatre lignes de cellules cancéreuses avec des mutations connues ont été utilisés pour démontrer l'efficacité de la technique RNA-seq Capture (K562 avec ABL1 fusion, LC2 avec RET fusion, EOL1 avec PDGFRalpha fusion et RT- 4 avec FGFR3 fusion). Les quatre échantillons ont été regroupés et séquencés avec 2x 100 pb lit sur un...

Discussion

RNA-seq Capture est une stratégie intermédiaire entre RNA-seq et microarray approches pour l'évaluation d'une partie sélectionnée du transcriptome. Les avantages de la capture comprennent le coût, le délai d'exécution rapide réduits sur un séquenceur de bureau, à haut débit, et la détection des altérations génomiques. Le procédé peut être adapté pour caractériser ARN non-codants 23, détecter seul nucléotide variantes 4-6, examiner épissage de l' ARN, et d'...

Déclarations de divulgation

S.R. receives funding from Novartis and Ariad Pharmaceuticals for conduct of clinical trials. S.R. immediate family members own stock in Johnson and Johnson.

Remerciements

We give special thanks to Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto and Eric Samorodnitsky for technical support. We would also like to thank Jenny Badillo for her administrative support for our team. We acknowledge the Ohio Supercomputer Center (OSC) for providing disk space, processing capacity, and support to run our analyses. We thank the Comprehensive Cancer Center (CCC) at The Ohio State University Wexner Medical Center for their administrative support of this work. S.R. and Team are supported by the American Cancer Society (MRSG-12-194-01-TBG), a Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award, NHGRI (UM1HG006508-01A1), Fore Cancer Research Foundation, American Lung Association, and Pelotonia.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Thermomixer REppendorf21516-166
Centrifuge 5417REppendorf5417R
miRNeasy Mini KitQiagen217004
Molecular Biology Grade EthanolSigma AldrichE7023-6X500ML
Thermoblock 24 x 1.5 mlEppendorf21516-166
MiSeq Reagent Kit v2 (300-cycles)IlluminaMS-102-2002
MiSeq Desktop SequencerIllumina
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetAIlluminaRS-122-2301
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p5IDT127040822
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(6nt)IDT127040823
25 rxn xGen® Universal Blocking Oligo - TS-p7(8nt)IDT127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR Purification beads Beckman-CoulterA63880
Dynabeads® M-270 StreptavidinLife Technologies65305
COT Human DNA, Fluorometric Grade, 1 mgRoche Applied Science05480647001
Qubit® Assay Tubes Life TechnologiesQ32856
Qubit® dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32851
SeqCap® EZ Hybridization and Wash Kits  (24 or 96 reactions)Roche NimbleGen 05634261001 or 05634253001 
Qubit® 2.0 Fluorometer Life TechnologiesQ32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)IDT
Tween20 BioXtraSigmaP7949-500ML
Nuclease Free WaterLife TechnologiesAM9937
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Well Fast Rection ModuleBiorad185-1196
SeqCap EZ Hybridization and Wash KitsRoche Applied Science05634253001
SuperScript II Reverse Transcription 200 U/μlLife Technologies18064-014
D1000 ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 mlBeckman Coulter IncA63987
RNA ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5576
RNA ScreenTape LadderAgilent Technol. Inc.5067-5578
RNA ScreenTape Sample BufferAgilent Technol. Inc.5067-5577
Sodium HydroxideSigma72068-100ML
DynaBeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65602
DYNAMAG -96 SIDE EACHLife Technologies12331D
ChloroformSigmaC2432-1L
KAPA HotStart ReadyMixKAPA BiosystemsKK2602
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermo Scientific
My Block Mini Dry BathBenchmarkBSH200
D1000 ReagentsAgilent Technol. Inc.5067- 5583
Vacufuge PlusEppendorf022829861 

Références

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  8. . MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html (2012)
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