水培:一个多功能的系统来研究营养分配和植物响应养分有效性及暴露于有毒元素

摘要

Here, we present an easy-to-follow protocol to establish a successful hydroponic system for plant nutrition studies. This protocol has been extensively tested in Arabidopsis and can easily be adapted to other plant species to study specific nutritional requirements or the effect of non-essential elements on plant growth and development.

摘要

水培系统已被用作用于植物生物学研究的标准方法之一，并在商业生产也可用于多种作物，包括莴苣和番茄。在植物研究界，无数的水培​​系统已被用于研究生物和非生物胁迫植物响应。在这里，我们提出了一个水培协议，可以在热衷于追求植物矿质营养研究实验室可以轻松实现。

本协议描述了水培系统的详细设置和植物材料的成功实验的准备工作。大多数本协议中所述的材料都可以科学供应公司以外找到，使得设置了水培试验更便宜和方便。

使用水耕生长系统的是的情况下最有利的，其中所述营养培养基需要被很好的控制，并当完好滚装OTS需要被收获下游应用。我们还证明浓度如何养分可被修改以诱导对两者必需的营养物质和有毒的非必需元素植物反应。

引言

植物是指能合成由无机离子，水和CO ₂利用来自太阳¹捕获的能量所需的所有代谢物的少数生物体之间。水耕是生长植物的方法，通过提供所有的营养的利用了这一事实，在其无机形式，有或没有固体介质的液体溶液。水培系统已经探索的营养要求，并在拟南芥的一些元素和其他植物物种^2-5的毒性被广泛使用的科学家。例如，Berezin 等 ^3，Conn 等⁴和Alatorre-科沃斯等 ²用于水培系统和几种植物物种，包括番茄和烟草，以产生用于矿物分析^2-4足够量的植物生物质。水耕的工业应用也已经开发了用于作物，如番茄和莴苣^6。在这里，我们Øutline在研究，在可用的方法可能的变化背景下使用水栽法，最后提出一个系统，它可以很容易地扩展性和可用于对研究植物矿质营养研究实验室。

水培系统允许根组织容易分离和养分有效性精确控制

水耕过土壤为基础的系统提供了若干优点。当从土壤除去，根组织往往机械剪切引起组织或损害的损失。这是细根结构，如侧根和根毛尤其如此。不利用惰性粒状介质水耕系统允许根的微创分离和拍摄的组织。

在土壤系统，在整个土壤基质的养分养分有效性的变化结合创建土壤中的微环境中的土壤颗粒。这^ heterogeneity可以在需要养分或其他分子的外部浓度的精确控制实验的复杂性增加了额外的水平。与此相反，水培溶液是均匀的，并且可以在整个实验过程中很容易地更换。

水培系统的变种

所有的水培培养依靠营养液传送到工厂的基本要素。除了营养物，根部也需要氧气的稳定供应。当根系缺氧成为他们无法承担运输代谢产物的植物体⁷的其余部分。由饱和空气（经典水耕）的溶液中，在任何时候都不会淹没根部氧气输送，或者让根被完全暴露在:水培系统可以根据他们如何提供氧气和其他营养物质的根源进行分类空气^{（aeroponics）8。}在水培，营养液可以与之前其使用空气是饱和的和频繁地改变，或者空气可以在溶液在工厂⁹的生命周期中连续供给。备选地，植物也可在惰性介质（ 例如 ，岩棉，蛭石，或粘土粒料）培养，并进行由通过媒体滴落溶液或周期性地浸没在营养液¹⁰在基板湿法干燥循环。在aeroponics，根都与营养物溶液喷雾以防止干燥。

水培系统的缺点

虽然水培文化土壤上为基础的系统具有明显的优势，有一定解释数据时承认一些注意事项。例如，水培系统暴露的植物可被视为非生理条件。因此，表型或植物响应使用水培系统在大小磨片可能会有所不同检测N组植物生长在替代系统（ 例如，土壤或基于琼脂培养基）。这些考虑并不适合水培系统唯一的;如果植物在不同类型的土壤^11,12的生长，也可观察到差的反应。

下面的协议提供了如何建立一个水培系统，在实验室中一步一步的指示。此协议为拟南芥 （ 拟南芥 ）进行了优化;然而，类似的或在某些情况下，相同的步骤可用于种植其他物种。

研究方案

1.苗圃

1. 拟南芥种子的气相消毒
   1. 倾种子（40-50毫克）到1.5毫升离心管中。 （参见图1适当的种子体积，约50微升）。标签用铅笔各管（墨水可能会在灭菌过程中消失）。将每个标管帽开放，进入干燥器^13。
   2. 放置在干燥器中的积极通风柜并关闭干燥器的阀门。
   3. 等分试样百毫升漂白的（次氯酸钠6.15％）到250ml烧杯中，然后将其放置在干燥器中。
   4. 迅速加入3毫升12M盐酸，使用移液管的漂白剂。迅速关闭干燥器的盖作为反应迅速进行。允许灭菌进行4小时（标记用墨水的管，看到墨水消逝有助于可视化已经生成的氯气的足量）。
      注意:氯气是有毒的;处理其残基在功能通风柜额外的安全预防措施。与当地政府联系，或访问环境健康与安全部门的网页-密苏里大学^{（ESH-MU）14}化学品安全和指南使用通风橱:https://ehs.missouri.edu/chem/。
   5. 十五分钟之前灭菌完成（3.75小时），打开层流罩和清洁用70％的乙醇的表面。
   6. 灭菌后的4小时开启阀门，简要地除去干燥器的盖通风柜内，取出漂白剂，并且根据机构程序处理它。这个步骤将释放氯气烟雾的很大一部分。密封消毒室，并把它的层流罩。广泛打开盖子和曝气消毒的种子大约40分钟。在此之后，立即用种子或在干燥的地方存放。
      注:建议种子气相灭菌但是其它方法ス在Alatorre，科沃斯等²所描述与乙醇，漂白剂和水通道作为候补洗涤液同样有效。
2. 种子萌发培养基
   注意:在此步骤中制备的培养基是四分之一维生素¹⁵ Murashige和Skoog（MS）。
   1. 添加450毫升去离子水（DI水），0.55克MS培养基加维生素将0.3g MES（4-吗啉乙磺酸水合物）和磁性搅拌棒放入一个1升玻璃烧杯中。
   2. 溶解，用NaOH调节pH值至5.7，然后加入3.5克植物琼脂。不断搅拌溶液5分钟。
   3. 倾整个溶液置于量筒，并添加去离子水至500毫升。高压灭菌这家医院500 ml溶液，与内部的磁力搅拌棒，用1升高压灭菌瓶中。
   4. 该解决方案已被高压灭菌后，用搅拌在瓶子的磁力搅拌器搅拌7-10分钟的解决方案。
   5. 之后，媒体已经冷却下来至50-60℃，倒入媒体到平板在无菌条件下，让它凝固。板可存放在冷室以后使用。
3. 电镀种子
   1. 打开使用和清洗，用70％的乙醇的表面之前的层流罩15分钟。下列项目是必需的:无菌种子，滤纸，牙签，胶带微孔和1/4 MS板。
   2. 放置在无菌滤纸无菌种子。无菌牙签（用无菌水或戳¼MS培养基）的微湿一端。使用此滋润月底挑选从滤纸上的种子，然后躺在他们到介质表面。
   3. 分布在该板的种子以每厘米²大约1种子（ 见图2）的密度。然后用微孔胶带保持附着于盘体的板盖。这种类型的带的帮助，以防止污染，同时允许空气和insid小气候之间的气体交换Ë板。
   4. 发芽前，通过保持所述板在冷室2天分层种子从光覆盖。
   5. 分层后，将种子在生长室或在具有最佳生长条件（23℃，16小时光照/ 8小时黑暗，60％为拟南芥相对湿度）的地方。幼苗将准备发芽后10-12天水耕。
      注意:在萌发有可能在板的盖下显著缩合，防止溺水，多余的水应在层流罩在无菌条件下被丢弃。

2.水培的安装和移植过程

1. 水培液
   注意:如在引言中提到的，植物可以具有特定营养要求拟南芥已成功地生长与表1 ¹⁶中所示的营养液根据不同的供应商，该。此处列出的盐可具有不同的水含量（水合），并使用这样的替代，只要摩尔浓度保持恒定，不影响营养液的性质。
   1. 准备在不同瓶（ 表1）和在无菌瓶除铁EDTA所有微量营养素每大量营养素的储备溶液（用0.22微米的膜过滤除菌）。总是在最后的混合解决方案时，添加铁EDTA。制备在4℃下预先实验，但高压釜和存储的10倍的营养液。使用或改变，只有当营养物溶液达到室温，营养。
2. 移植
   1. 准备厂房架和集装箱水培
      1. 使在泡沫的切口，沿着用剃刀刀片其长度延伸（ 见图3）。准备每株一个插头。
      2. 液釜泡沫管塞在去离子水中浸泡。
      3. 切割所述泡沫面板成更小的板，确保泡沫板的宽度和长度是0.5-1.0厘米小于容器的大小（ 见图4）。
      4. 用软木钻孔以创建在泡沫板的通孔。植物的密度应均匀分布，每10cm ²理想地1植物。这种密度将保持彼此截然分开植物;然而更高的密度是可能的，并且不排除在实验的成功。确保孔的尺寸将插头的尺寸相匹配（参见图4）。
      5. 装满营养液的容器。确保溶液的深度是足够的根发育（至少5厘米）。然后小心地将泡沫板到解决方案的表面。
      6. 设置空气泵系统，以提供氧气进入溶液（参见图5）。
         注意:在水耕容器营养液萨姆填ê天幼苗被移植。从光覆盖容器双方将有助于防止藻类生长。
   2. 从板块幼苗转移到水培系统
      1. 用小镊子每株秧苗轻轻向外拉出中板和沿发泡管塞的切口打下了根。小心将发泡管抱着苗成泡沫板然后将板回水培容器。参见图6适当操作。

3.水培试验

1. 营养液的更换和处理
   1. 营养液更换
      1. 要更换营养液，如步骤2.1中所述准备新鲜的水培液。从水培容器中取出含有植物泡沫板，并将其放置在一个充满临时容器水培或解决方案。
      2. 丢弃旧溶液，短暂地冲洗该容器用DI水三次。新配制的水培液添加到这个容器中，轻轻地放在泡沫板与植物放回容器中水培。每周两次更换水培液。
   2. 改变水培液的营养成分
      1. 调整表1所示的修改感兴趣的元素的最终浓度的水培液的组成。例如，为了诱导铁（Fe）缺乏症，修改水培溶液以降低的Fe-EDTA浓度。包括一组上生长充分（或充满）水耕溶液对照植物的，没有任何修改，以进行比较。
      2. 能够操作与有毒元素的营养液，先准备好所需的有毒元素的一个独立的原液，最好是1000倍浓。用一个吸管穗与使用1000倍浓储备所需最终浓度的有毒元素的水培液。
      3. 例如，为了使3升含有镉的20μM的水培溶液中，制备0.5M的_氯化镉的库存，并加入120微升的0.5M _氯化镉库存的入3升的水培溶液。包括水培种植无_氯化镉比较植物的控制集。
         注意:有毒元素如镉，砷和铅对人体健康和环境非常危险。请与当地政府联系，或访问EHS-MU的网页^{（https://ehs.missouri.edu/train/chemical.html）14} 事先进行各种实验环境和健康安全准则。
2. 器械灭菌明年实验
   1. 由于几乎所有使用的材料准备水培设置即可重复使用，请用稀释的漂白剂的不同部分（次氯酸钠0.6％）。
   2. 用漂白粉漂洗后，用去离子水彻底冲洗所有材料。保持容器，泡沫板和泡沫水族馆石头以备将来使用干燥的地方。泡沫塞去除根和被高压灭菌后准备重用。

结果

在本节中，两种类型的实验中，使用此处描述的水培系统的结果，现介绍。在第一个实验中，营养液被修改，以得到不同浓度的锌。我们还通过添加有毒元素镉非致死浓度（ 图7）改性的营养液。在第二个实验中，我们使用电感耦合等离子体光学发射光谱法^{（ICP-OES）1}来测量根和在水培含有溶液镉（ 图8）中生长的植物的叶子的元素组成。这个实验说明分别获得根和叶的优势。

实验1

拟南芥秧苗（Col-0中）在公关描述的水培系统中生长otocol步骤1和2植物被允许与不同锌浓度（ 图7A-B）或镉的非致死浓度（ 图7C）处理前生长，共3周。六天后处理，植物生长在高锌浓度（> 42微米）显示延迟由于锌毒性的增长，而无需额外的锌植物相比具有7微米的Zn ²⁺生长的植物加入也显示延迟生长， 图7还示出了减少枝条生长，根系生长，并且褪绿叶症状典型暴露于镉（ 图7C）的植物。

实验2

如在步骤1和2描述了两个星期之后的Col-0植物生长，未改性（充满）溶液用80毫升含有20μM的镉水培溶液替换。 72小时后S，根部组织通过整个泡沫板与植物转移到含有80 ml的三的20mM（pH 8.0）中和5mM EDTA的新血管洗涤。该解决方案将消除结合于根表面的重金属。植物在5分钟旋转振荡器含EDTA的溶液中温育。 EDTA溶液然后通过80毫升DI水置换和植物一起孵育的旋转振荡器额外5分钟。重复用DI水二次漂洗步骤。用DI水漂洗植物后，叶和根组织中独立地收集和用于ICP-OES ¹进行处理。 图8显示了叶子的元素组成是从根，不同的地方大量营养素（钙，钾，和Mg）的叶组织中目前在高浓度相比根源。另一方面，微量营养素如Zn和Fe中根优先积累。非必需元素镉的浓度被发现是喜 gher根相比芽。

图1. 气相灭菌拟南芥种子。（A）每1.5个ml离心管拟南芥种子的数量。 （B）含用盖在管架子保持部准备灭菌开放种子，一个管与油墨标在帽包括管。 （C）灭菌设置了干燥器，内盖和阀门关闭。 （D）包括在之前和灭菌后的墨水标记的色彩浓厚的种子消毒过程管的盖子的墨水标记。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2. 种子电镀步骤。（A）种子电镀前放置在消毒纸。也需要这一步消毒牙签。 （B）的微湿与在介质板的一侧的介质或水中的牙签的末尾。 （ 三 ）种子移到¼MS板。 （ 四 ）种子的理想密度为≈1籽/厘米^2。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 用于保存在营养液苗泡沫塞 。在泡沫管塞半切口可帮助从板块移栽水培期间举行的苗子。请点击此处查看该图的放大版本。

图4. 泡沫板做准备。（A）大批量制备泡沫板前检查模板泡沫板与容器尺寸的大小。在泡沫板的中心由两个小穿孔使其更容易保持和用镊子处理泡沫。 （B-C）打孔器用于创建对泡沫板的孔。 （ 四 ）检查发泡管塞和孔的泡沫板之间建立适当的配合。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5.空气泵设置为从顶视图（A）和侧视图（B）的水培试验中的数字表示:1 -泵供给空气; 2 - 塑料管连接用阀系统来控制空气流动的空气泵; 3 - 阀系统; 4和5​​ - 塑料管材连接用石头泡曝气阀系统; 6和7 -泡泡石（鱼缸销售） 点击此处查看该图的放大版本。

图6. 传输苗水培系统。（A）使用镊子取苗出来的中厚板。 （ 二 ）将苗袋鼠沿着泡沫管塞切口吨。 （C）将发泡管插头插入泡沫板。用苗准备（D）已完成的泡沫板设置放置在营养液。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7. 养分溶液可以被修改，以测试缺乏或元件的毒性作用 -4周老水耕治疗后6天生长的拟南芥 :生长具有（AB）植物0，7，14，21，28，35，42，和50μM锌。在与具有种植的植物高锌含量（> 42μM）显示生长迟缓（毒性），而没有锌厂加入也表明生长迟缓（营养缺乏）种植的植物 7μM锌^离子 。 （C）的植物中的不存在（左）或20μM的镉的存在下，在营养液生长（照片拍摄之后镉暴露6天）。镉暴露引起萎黄，并降低增长。 请点击此处查看该图的放大版本。

从植物根与芽的 图8. 元素组成水耕种植。芽含有比较多根营养素（钙，钾，镁），而必需的微量营养素锌和铁多集中于根。同样地，非必要的元件镉是根优先积累。误差棒代表95％置信区间（14，芽和n = 9，根）。_upload / 54317 / 54317fig8large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

营养类型	盐/试剂	浓度的水培液	单元
营养素	KNO 3	1.250	毫
营养素	KH 2 PO 4	0.625	毫
营养素	硫酸镁	0.500	毫
营养素	的Ca（NO 3）2	0.500	毫
微量营养素	H 3 BO 3	17.500	μM
微量营养素	氯化锰2	5.500	μM
微量营养素	硫酸锌	0.500	μM
微量营养素	的 Na 2的MoO 4	0.062	μM
微量营养素	氯化钠2	2.500	μM
微量营养素	氯化钴	0.004	μM
微量营养素	的FeEDTA	12.500	μM

表1中的水培液的营养成分的有效浓度。

讨论

用于水培苗的健康是造成水培实验成功的主要因素之一。仪器仪表，种子和培养基灭菌在减少污染的风险也扮演着重要的角色，并提供一个良好的开端植物它们被移植到水培系统之前。为一个良好的实验设置与设施，如高压釜，通风柜，冷室（4℃），并用受控条件（光强度和温度）生长空间A的工作环境是必要的。

营养液的新鲜度也决定了植物健康，进而确定水培试验的成功。因为水在直接照明蒸发更快，盐的浓度将由于减少总溶液体积的改变;因此它是最好的一个星期，以改变它的水培液的至少两倍。但是，如果大，深集装箱配备了一个空气泵系统中使用它可能没有必要更换该短持续时间实验的营养液。注意，在拟南芥的情况下，我们使用品红容器（77宽×77毫米长×97毫米高度），但也可以使用其它的，较大的容器，以容纳更大的植物。

对于有兴趣的植物营养素的研究人员，水培试验提供了测试植物的表型和应对不同的养分供应¹⁷一个独特的环境。通过操纵感兴趣的元素的浓度，研究人员可以设置不同的实验，以测试充分性，缺乏，或者必需和非必需的营养物质的毒性浓度的影响。相比于土壤为基础的系统中，水培系统提供了更均匀的营养培养基的植物土传病害的风险较小。此外，根和芽组织可以收获和易于分离对具体的植物组织进一步的分析。

中的代表性部分中，我们介绍了在将其使用于对植物营养更详细的研究一简单的水培系统中的两个例子。在第一个例子中，通过在锌浓度梯度生长的植物，我们能够说明可在营养组合物使用本水耕系统来实现的控制水平。 7μM锌种植的植物生长更加积极相比，50μM锌种植的植物，而植物相比，7μM锌种植的植物生长，无需额外添加的锌分别发育不良。这部分是由于时间的植物被允许充分的条件下生长的长度;较早从媒体去除锌很可能诱导强锌缺乏症状。应用相同的原理，我们能够使用非必要的金属，镉，这是众所周知的损害植物的生长以诱导毒性。

在第二例如，用20μM的镉处理72小时的Col-0根和枝条的元素组成，通过ICP-OES测定。我们发现在根与芽之间的所有检测到金属的差异。宏观元件在相对于所述根枝条较高浓度被发现，而铁和锌，发现根更丰富。镉其次类似于铁和锌的模式，是多集中在根部较笋。这些数据强化了叶和根提供有关核电厂的ionome状态不同的信息，因此需要单独分析，以了解矿质营养和成分在全厂级这两个组织中的想法。除了​​ICP-OES几个光谱方法如原子吸收光谱（AAS）或电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）也可以用于测量植物的元素组成（ionome）组织中^18-20。

在hydroponiÇ实验，症状和植物响应不同营养条​​件的表型表现的是什么可以扩展到更多的开始详细制定分析，如基因表达（转录）和蛋白质丰度（蛋白质组学）。这些-omic技术是键通过考虑在一个组织特异性方式过程，以植物代谢集成。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
For seed sterilization
Bleach	The Clorox Company	NA	The regular bleach www.cloroxprofessional.com
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-500
Desiccator body	Nalgene	D2797 SIGMA	Marketed by Sigma-Aldrich
Desiccator plate	Nalgene	5312-0230	Marketed by Thermo Scientific
For one quarter MS medium preparation
MES	Acros Organics	172591000	4-Morpholineethanesulfonic acid hydrate
Murashige and Skoog (MS)	Sigma-Aldrich	M0404-10L
KOH	Fisher Scientific	P250-500
Phytoagar	Duchefa Biochemie	P1003.1000
Square plate	Fisher Scientific	0875711A	Disposable Petri Dish With Grid
For seed plating
Filter paper	Whatman	1004090
Toothpick	Jarden Home Brands	NA
Aluminum foil	Reynolds Wrap	NA	Standard aluminum foil
Micropore tape	3M Health Care	19-898-074	Surgical tape; Marketed by Fisher Scientific
For hydroponic solution preparation
KNO3	Fisher Scientific	BP368-500
KH2PO4	Fisher Scientific	P386-500
MgSO4	Fisher Scientific	M63-500
Ca(NO3)2	Acros Organics	A0314209
H3BO3	Sigma	B9645-500G
MnCl2	Sigma-Aldrich	M7634-100G
ZnSO4	Sigma	Z0251-100G
Na2MoO4	Aldrich	737-860-5G
NaCl2	Fisher Scientific	S271-1
CoCl	Sigma-Aldrich	232696-5G
FeEDTA	Sigma	E6760-100G
“Stericup & Steritop” bottle	Milipore Corporation	SCGVU02RE	Micronutrient container www.milipore.com
For root wash buffer preparation
EDTA	Acros Organics	A0305456
Tris	Fisher Scientific	BP154-1
For hydroponic setup
Autoclavable foam tube plug	Jaece Industries Inc.	L800-A	Identi-Plugs fit to holes with 2R = 6-13 mm
Foam Board	Styrofoam Brand  Dow	ESR-2142	Thickness is 1/2 inches
Cork borer	Humboldt	H-9662	Cork Borer Sets with Handles, , Plated Brass Set of 6, 3/16" to 1/2" OD Size
Air pump	Aqua Culture	MK-1504
Air pump	Marketed by Wal-mart Stores, Inc.
Airline tubing and aquarium bubble stones	Aqua Culture	Tubing: 928/25-S
Airline tubing and aquarium bubble stones	Marketed by Wal-mart Stores, Inc.	Stone: ASC-1
Other
Ethanol	Fisher Scientific	A995-4	Reagent Alcohol
Cadmium Chloride (CdCl2)	Sigma-Aldrich	10108-64-2