去除<em&gt;果蝇</em从幼虫鱼片的感官神经元和表皮细胞的免疫荧光分析&gt;肌肉组织

摘要

使用的果蝇幼虫树突分支（DA）神经元的神经元形态的研究通过免疫荧光在神经细胞和表皮蛋白质的原位可视化中受益。我们描述通过从幼虫体壁除去肌肉组织提高多巴胺神经元和包围的表皮细胞的免疫荧光分析的过程。

摘要

的果蝇幼虫树突分支（DA）神经元是研究神经元形态发生机制流行模式。 DA能神经元发展与表皮细胞它们所支配，因而从免疫荧光两种neuronally和epidermally表达蛋白的原位可视化他们的分析好处沟通。制备用于免疫荧光实验幼虫鱼片的传统方法留下完好的肌肉组织，覆盖大部分的体壁，呈现几个挑战于成像神经元和表皮蛋白质。在这里，我们描述了从的果蝇幼虫鱼片去除肌肉组织的方法。该协议可允许否则由肌肉组织遮蔽蛋白成像，改进了信噪比，并方便了使用超分辨率显微镜来研究哒神经发育。

引言

果蝇幼虫树突分支（DA）神经元由于其顺从遗传操纵和与它们可以被成像的容易程度为研究神经元发育一个有价值的模型。这些感觉神经元已经在控制树枝状结晶形态^1-3众多途径的鉴定工具。

四类DA能神经元（类别I - IV）支配幼虫表皮。这些神经元位于基底膜和表皮之间，与他们的树突形成基本上二维阵列^4,5。四个班，IV级DA能神经元具有最高度支乔木，像其他动物的感觉神经元，这些乔木的制定需要从邻近组织的内在因素，以及线索，尤其是表皮，为他们的发展^6-9 。

研究确定怎么这样神经元和额外的神经元的事实ORS通过免疫荧光检测原位蛋白表达的能力控制树突形态效益。幼虫的外表皮是穿不透的抗体，但这个障碍是很容易通过行之有效的夹层方法^-10,11-制备幼虫鱼片克服。然而，正好位于内部到基底膜体壁肌肉组织呈现朝大神经元和表皮细胞可视若干挑战。首先，肌肉组织，这行最体壁，大大掩盖从神经元或表皮组织发出的荧光信号。这大大降低了信号与样品中的信噪比。第二，许多相关的蛋白质可以在肌肉组织中，以及在神经元或表皮来表示。此肌肉衍生的荧光信号可能从神经元或表皮荧光信号的进一步晦涩检测。最后，先进的显微技术不在亚衍射分辨率样品W的许可证成像并可能挑剔了在神经元中表达的蛋白质的定位和周围的表皮细胞^12,13尤其有用。然而，通过从强信噪比和样品到盖玻片接近超高分辨率显微镜好处成像。除了降低信噪比，幼虫体壁肌肉的距离从盖玻片，从而限制可与超分辨率显微镜方法来实现改进的图像分辨率达的神经元。除了为免疫荧光分析挑战，肌肉组织提出从感觉神经元在幼虫体壁的障碍，电生理记录。因此，它有利于去除感觉神经元¹⁴的神经生理学操纵。

此处被描述为手动去除果蝇幼虫的肌肉组织的方法。我们证明了我们的协议p蛋白质ermits免疫荧光成像被另有肌肉组织遮蔽，提高了信号到第IV类多巴胺神经元的可视噪声比，并允许使用超分辨率显微镜，以更好地辨别在多巴胺神经元的蛋白质和细胞结构的空间关系和表皮。

研究方案

注意:对于肌肉切除（ 图1）的步骤的制备幼虫鱼片先前描述的方法的变形例。之前和之后的肌肉除去步骤概述简要地并且读者可以参考以前的工作^10，11，用于更详细的描述。

1.解剖幼虫在冷盐水

1. 准备冷HL3.1生理盐水¹⁵或冷的Ca ²⁺ HL3.1生理盐水^11（ 表1）的工作稀释。放置幼虫与刚好足够冷盐水硅氧烷弹性体盘，以覆盖培养皿的底部。
   注:请参阅有关生理盐水的选择讨论。

1X HL3.1盐水（pH 7.2）

5毫米的HEPES

70毫米氯化钠

5毫米氯化钾

1.5毫米氯化钙2（省略无钙生理盐水）

4毫米氯化镁2

10毫米碳酸氢钠

5毫米海藻糖

115毫米蔗糖

过滤消毒和储存在4℃

注:作文模仿昆虫的血淋巴

表1.冷盐水的组成。

2. 与腹侧幼虫位置。幼虫的腹面可以通过运行由前至后的主幼虫气管导管腹部dentical皮带和背侧被识别。伸展幼虫在前后方向和头尾针到一个有机硅弹性体用昆虫针解剖盘。用细解剖剪刀沿腹中线切开，在一端开始向另一进展。
   注:此方位保留DA能神经元的常用研究背集群。
3. 幼虫切开后，PIN四角的解剖盘，就像打开一本书。使用镊子抓住并取出内脏器官，包括中枢神经系统，肠道，和气管。调整昆虫针，使圆角绷紧但不是最大延伸。
   注:肌肉是在段的边界固定于体壁。虽然肌肉覆盖大部分体壁的，他们是在靠近背中线的狭窄的区域不存在。

2.去除肌肉

1. 找到幼虫，其中肌肉组织缺席的背中线。位置的单个钳子尖头，使得其可插入在尽可能平坦的取向的肌肉组织的下方。
2. 开始于背中线，该段的前边界附近，小心地将肌肉和表皮之间的钳子叉，注意尽量减少镊子和表皮之间的接触。
3. 向上拉钳子打破肌肉体壁的附着在一个锚定点。重复此过程针对感兴趣的剩余半段（多个）。
   注:此协议优化了每个大神经元树突场后的保存。为了保持枝晶场的前部，最好是在各段的后端插入镊子叉。
4. 重新调整昆虫针，使得幼虫鱼片在所有方向最大限度拉伸。
5. 修复圆角而这是采用冷，新鲜烹制的PBS中的4％甲醛25分钟还是被钉在解剖盘。
6. 在PBS中漂洗5次。
7. 使用镊子从剩余的锚点仔细扯远了肌肉组织，同时注意尽量减少CONTA克拉与表皮。
8. 取消固定，并从解剖盘取出鱼片到1.5ml微量离心管中。执行所有随后的洗涤，阻挡，和免疫荧光染色步骤，如前所述^11。

3.安装幼虫鱼片

1. 首先用细解剖剪，以使样品尽可能平坦去除头部和尾部。安装在盖玻片圆角与面对盖玻片圆角的内表面抗褪色封固剂。
2. 广场上的盖玻片显微镜载玻片，并轻轻按压以驱散安装介质。翻转显微镜载玻片和密封使用指甲油幻灯片盖玻片。玻片可以储存在-20℃下至少一个月。

结果

我们证明肌肉切除过程的效用改善信噪比在免疫荧光实验共同形象化隔连接蛋白小艇（科拉）和光盘大型（DLG）用标记与膜标记IV级多巴胺神经元一起CD4- tdTomato。

科拉先前已用于识别阿凡达的神经元树突是由表皮细胞封闭，是已在研究协会DA神经元的形态和功能的树突^4,6-9,16许多鉴定表皮因素之一大片。用抗DsRed的免疫染色，以检测神经元（红...

讨论

在这里，一个协议是从的果蝇幼虫鱼片手工清除肌肉组织的描述。该协议会修改先前描述的幼虫解剖技术^10,11。幼虫是在有机硅弹性体解剖的菜后，背中线的位置。一个单一的镊子尖头在其尽可能平坦的方向，仔细插入肌肉组织和表皮之间，靠近背中线。镊子轻轻向上从一个锚点中的每个感兴趣的幼虫段被拉至单独的肌肉组织。然后幼虫鱼片被固定在冷甲醛之后钳子再次用于从剩余...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4
Zeiss Stemi 2000	Carl Zeiss Microscopy
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	for confocal microscopy
Prolong Diamond antifade mountant	Life Technologies	P36970	for structured illumination microscopy
Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5	VWR	48366-227
Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm	Fisherbrand	12-550-15
Mouse anti-Coracle antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	C615.16	supernatant, dilute 1:50
Mouse anti-Discs large antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	supernatant, dilute 1:50
Rabbit anti-dsRed antibody	Clontech	632496	dilute 1:1,000
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated	ThermoFisher Scientific	A-11011	dilute 1:1,000
Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	ThermoFisher Scientific	A-11001	dilute 1:500