Enlèvement de<em&gt; Drosophila</em&gt; Muscle Tissue de Fillets larvaires pour immunofluorescence Analyse des neurones sensoriels et les cellules épidermiques

Résumé

Des études de la morphogenèse neuronale utilisant la drosophile arborisation dendritique larvaire (da) neurones bénéficient de la visualisation in situ des protéines neuronales et épidermiques par immunofluorescence. Nous décrivons un procédé qui permet d'améliorer l'analyse par immunofluorescence des neurones DA et des cellules épidermiques entourant en retirant le tissu musculaire de la paroi du corps de la larve.

Résumé

Larvaires arborisation dendritique (da) neurones de drosophile sont un modèle populaire pour les mécanismes de la morphogenèse neuronale enquête. Neurones Da se développent dans la communication avec les cellules de l' épiderme , ils innervent et donc leurs avantages de l' analyse de la visualisation in situ des deux protéines neuronal et épidermique exprimées par immunofluorescence. Les méthodes traditionnelles de préparation des filets larvaires pour les expériences d'immunofluorescence laissent intact le tissu musculaire qui couvre la majeure partie de la paroi du corps, présentant plusieurs défis à l'imagerie des protéines neuronales et épidermiques. Nous décrivons ici un procédé pour éliminer le tissu musculaire à partir des filets de Drosophila larves. Ce protocole permet l'imagerie des protéines qui sont autrement occulté par le tissu musculaire, améliore le rapport signal à bruit, et facilite l'utilisation de nanoscope pour étudier da développement des neurones.

Introduction

Larvaires arborisation dendritique (da) neurones de drosophile fournissent un excellent modèle pour l' étude du développement neuronal en raison de leur susceptibilité à la manipulation génétique et la facilité avec laquelle ils peuvent être visualisés. Ces neurones sensoriels ont joué un rôle dans l'identification de nombreuses voies qui contrôlent dendrites morphogenèse ^1-3.

Quatre classes de neurones DA (classe I - IV) innervent l'épiderme larvaire. Ces neurones se trouvent entre la membrane basale et l'épiderme, avec leurs dendrites formant matrices bidimensionnelles en grande partie à ^4,5. Sur les quatre classes, la classe IV neurones DA ont les tonnelles plus fortement ramifiée et, comme les neurones sensoriels d'autres animaux, l'élaboration de ces tonnelles exige des facteurs intrinsèques, ainsi que des indices de tissus voisins, en particulier l'épiderme, pour leur développement ^6-9 .

Les études pour déterminer la façon dont ces neurones et fait extra-neuronalSOR avantage de contrôler la morphogenèse dendritique de la capacité à détecter l' expression de la protéine in situ par immunofluorescence. La cuticule externe de la larve est impénétrable aux anticorps, mais cet obstacle est facilement surmontée par la préparation des filets larvaires grâce à des méthodes de dissection bien établies ^10,11. Cependant, le tissu musculaire de la paroi du corps qui se trouve juste à l'intérieur de la membrane de sous-sol présente de nombreux défis à la visualisation des neurones DA et des cellules de l'épiderme. D'abord, le tissu musculaire, qui tapisse la plupart de la paroi du corps, obscurcit considérablement des signaux fluorescents provenant d'un tissu neuronal ou épidermique. Ceci réduit considérablement le rapport signal sur bruit dans l'échantillon. D'autre part, de nombreuses protéines pertinentes peuvent être exprimées dans le tissu musculaire, ainsi que dans les neurones ou de l'épiderme. Ce signal de fluorescence dérivées du muscle est susceptible d'obscurcir davantage la détection d'un signal de fluorescence provenant du neurone ou de l'épiderme. Enfin, les progrès dans les technologies de microscopie pasl' imagerie d' un permis poids d'échantillons à une résolution de sous-diffraction et peut être particulièrement utile pour discerner la localisation de protéines qui sont exprimées dans les neurones et les cellules épidermiques entourant ^12,13. Cependant, l'imagerie par microscopie de super-résolution bénéficie d'un signal fort par rapport au bruit et à proximité de l'échantillon à la lamelle. En plus de réduire le rapport signal à bruit, les larves de la paroi du corps muscle distances neurones DA de la lamelle couvre-objet, ce qui limite la résolution de l'image améliorée qui peut être obtenue avec des procédés de microscopie de super-résolution. En plus de difficultés pour l'analyse d'immunofluorescence, le tissu musculaire présente une barrière à l'enregistrement électrophysiologique des neurones sensoriels dans la paroi du corps de la larve. Son retrait profite donc la manipulation neurophysiologique des neurones sensoriels ^14.

Voici une méthode pour l' extraction manuelle du Drosophila tissu musculaire larvaire est décrite. Nous démontrons que notre protocole permites immunofluorescence imagerie des protéines qui sont autrement obscurcie par le tissu musculaire, améliore le rapport signal sur bruit pour la visualisation de la classe IV neurones DA, et permet l'utilisation de super-résolution microscopique afin de mieux discriminer les relations spatiales des protéines et des structures cellulaires en neurones DA et l'épiderme.

Protocole

Remarque: La procédure de destitution musculaire (Figure 1) est une modification des méthodes décrites précédemment pour la préparation des filets larvaires. Les étapes qui précèdent et suivent le retrait du muscle sont décrites brièvement et le lecteur est renvoyé aux travaux antérieurs ^{10, 11} pour des descriptions plus détaillées.

1. Disséquer Larve dans une solution saline froide

1. Préparer une dilution de travail de solution saline froide HL3.1 ¹⁵ ou Ca ²⁺ froid -free HL3.1 saline ¹¹ (tableau 1). Placez la larve dans un plat en élastomère de silicone avec juste assez de solution saline froide pour couvrir le fond du plat.
   REMARQUE: Voir Discussion concernant le choix d'une solution saline.

1x HL3.1 solution saline (pH 7,2)

5 mM de HEPES

70 mM de NaCl,

5 mM KCI

1,5 mM de CaCl2 (omettre de Ca 2+ solution saline -free)

4 mM de MgCl2

10 mM NaHCO 3

mM tréhalose 5

115 mM de saccharose,

Filtre stériliser et conserver à 4 ° C

imite Composition insectes hémolymphe: Note

Tableau 1. Composition de Cold Saline.

2. Positionner la larve à la face ventrale. La surface ventrale de la larve peut être identifiée par les ceintures abdominales et dentical la face dorsale par les principaux tubes trachéaux larvaires course d'avant en arrière. Étirez la larve dans le sens antéro-postérieur et la broche de la tête et la queue à unélastomère silicone disséquant plat utilisant des broches d'insectes. Utilisez des ciseaux fins de dissection pour couper le long de la ligne médiane ventrale, en commençant à une extrémité et en progressant vers l'autre.
   NOTE: Cette orientation préserve le cluster dorsal couramment étudié des neurones DA.
3. Après la larve est découpée, épingler les quatre coins de la boîte de dissection, comme si l'ouverture d'un livre. Utilisez une pince pour saisir et retirer les organes internes, y compris le système nerveux central, de l'intestin et de la trachée. Ajustez les broches d'insectes de sorte que le filet est tendu mais pas au maximum étiré.
   NOTE: Les muscles sont ancrés à la paroi du corps au niveau des limites segmentaires. Bien que les muscles couvrent la majeure partie de la paroi du corps, ils sont absents dans une région étroite à proximité de la ligne médiane dorsale.

2. Muscle Removal

1. Repérez la ligne médiane dorsale de la larve, où le tissu musculaire est absent. Positionner une pince à broche unique de telle sorte qu'il puisse être inséré sous le tissu musculaire dans la plate orientation possible.
2. À partir dela ligne médiane dorsale, près de la limite antérieure du segment, faites glisser soigneusement la griffe de pince entre le muscle et de l'épiderme, en prenant soin de réduire au minimum le contact entre la pince et de l'épiderme.
3. Tirez la pince vers le haut pour briser l'attachement du muscle à la paroi du corps à un point d'ancrage. Répétez ce processus pour l'hémi-segment (s) d'intérêts restants.
   NOTE: Ce protocole permet d'optimiser la préservation de la partie postérieure de chaque champ dendritique des neurones da. Afin de préserver la partie antérieure du champ dendrites, il est préférable d'insérer la pince griffe à l'extrémité postérieure de chaque segment.
4. Re-ajuster les broches d'insectes tels que le filet larvaire est au maximum tendue dans toutes les directions.
5. Fixer le filet alors qu'il est encore cloué au plat de dissection en utilisant le froid, fraîchement préparé formaldéhyde 4% dans du PBS pendant 25 min.
6. Rinçage 5 fois dans du PBS.
7. Utilisez une pince pour tirer précieusement le tissu musculaire à partir des points d'ancrage restants, en prenant soin de minimiser contact avec l'épiderme.
8. Détacher et retirer le filet du plat de dissection à un tube de 1,5 ml. Effectuer toutes les lessives, le blocage, et des étapes ultérieures immunofluorescence de coloration, comme décrit précédemment ^11.

3. Monter le larvaire Fillet

1. Tout d'abord enlever la tête et la queue en utilisant des ciseaux fins de dissection afin de rendre l'échantillon le plus plat possible. Monter le filet sur une lamelle en antifade milieu de montage avec la surface intérieure du filet face à la lamelle.
2. Placez une lame de microscope sur la lamelle et appuyez doucement pour disperser le milieu de montage. Retournez la lame de microscope sur et sceller la lamelle sur la lame à l'aide de vernis à ongles. Les diapositives peuvent être conservés à -20 ° C pendant au moins un mois.

Résultats

Nous démontrons l'utilité de la procédure de retrait des muscles pour améliorer le rapport signal sur bruit dans des expériences d'immunofluorescence pour co-visualiser les protéines cloisonnées de jonction Coracle (Cora) et disques-large (DLG) ainsi que des neurones da classe IV marquées avec le marqueur membranaire CD4- tdTomato.

Cora a déjà été utilisé pour identifier les secteurs où da dendrites neuronales sont entourées par des cel...

Discussion

Ici , un protocole est décrit pour le retrait manuel du tissu musculaire à partir des filets de Drosophila larves. Ce protocole modifie précédemment décrit les techniques de dissection larvaires ^10,11. Après la larve est disséquée dans un plat en élastomère de silicone, la ligne médiane dorsale est située. Une pince à broche unique, dans son orientation la plus plane possible, est soigneusement inséré entre le tissu musculaire et l'épiderme, à proximité de la ligne médiane dors...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4
Zeiss Stemi 2000	Carl Zeiss Microscopy
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	for confocal microscopy
Prolong Diamond antifade mountant	Life Technologies	P36970	for structured illumination microscopy
Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5	VWR	48366-227
Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm	Fisherbrand	12-550-15
Mouse anti-Coracle antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	C615.16	supernatant, dilute 1:50
Mouse anti-Discs large antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	supernatant, dilute 1:50
Rabbit anti-dsRed antibody	Clontech	632496	dilute 1:1,000
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated	ThermoFisher Scientific	A-11011	dilute 1:1,000
Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	ThermoFisher Scientific	A-11001	dilute 1:500