Rimozione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuto muscolare da larvali Filetti per l&#39;analisi di immunofluorescenza dei neuroni sensoriali e cellule epidermiche

Riepilogo

Studi di morfogenesi neuronale utilizzando Drosophila larvale arborizzazione dendritiche (bis) i neuroni beneficiano di visualizzazione situ delle proteine neuronali e epidermiche mediante immunofluorescenza. Descriviamo una procedura che migliora l'analisi di immunofluorescenza di DA neuroni e cellule epidermiche circostanti, rimuovendo il tessuto muscolare dalla parete del corpo larvale.

Abstract

Larvali arborizzazione dendritica (DA) neuroni Drosophila sono un modello popolare per lo studio dei meccanismi di morfogenesi neuronale. Da neuroni sviluppano in comunicazione con le cellule epidermiche che innervano e quindi le loro prestazioni di analisi da in situ visualizzazione di entrambe le proteine neuronally e epidermally espresse mediante immunofluorescenza. I metodi tradizionali di preparazione di filetti larvale per esperimenti di immunofluorescenza lasciano intatto il tessuto muscolare che copre la maggior parte della parete del corpo, che presenta diverse sfide per l'imaging neuronale e epidermiche proteine. Qui si descrive un metodo per la rimozione di tessuto muscolare dalla Drosophila filetti larvale. Questo protocollo permette l'imaging di proteine ​​che sono altrimenti oscurata da tessuto muscolare, migliora il rapporto segnale rumore, e facilita l'utilizzo della microscopia super-risoluzione per studiare da sviluppo neurone.

Introduzione

Larvali arborizzazione dendritica (DA) neuroni Drosophila forniscono un modello valido per lo studio dello sviluppo neuronale a causa della loro riconducibilità alla manipolazione genetica e la facilità con cui possono essere esposte. Questi neuroni sensoriali sono state fondamentali per l'identificazione di numerosi sentieri che controllano dendrite morfogenesi ^1-3.

Quattro classi di Da neuroni (classe I - IV) innervare l'epidermide larvali. Questi neuroni si trovano tra la membrana basale e l'epidermide, con i loro dendriti formazione di matrici sostanzialmente bidimensionali ^4,5. Dei quattro classi, la classe IV DA neuroni hanno le pergole più altamente ramificata e, come i neuroni sensoriali di altri animali, l'elaborazione di questi pergole richiede fattori intrinseci come pure spunti da tessuti vicini, in particolare l'epidermide, per il loro sviluppo ^6-9 .

Gli studi per determinare come tale neuronale e infatti extra-neuronaleors controllare beneficio morfogenesi dei dendriti dalla capacità di rilevare l'espressione della proteina in situ mediante immunofluorescenza. La cuticola esterno della larva è impenetrabile agli anticorpi, ma questo impedimento è facilmente superabile dalla preparazione di filetti larvale attraverso metodi dissezione consolidati ^10,11. Tuttavia, il tessuto muscolare parete del corpo che si trova appena interno alla membrana basale presenta varie sfide verso visualizzazione DA neuroni e cellule epidermiche. Innanzitutto, il tessuto muscolare, quali linee maggior parte della parete del corpo, oscura notevolmente segnali fluorescenti provenienti da tessuto neuronale o epidermico. Questo riduce notevolmente il rapporto segnale-rumore nel campione. Secondo, molte proteine ​​rilevanti possono essere espressi nel tessuto muscolare e nei neuroni o dell'epidermide. Questo segnale di fluorescenza muscolare derivato probabilmente ancora rilevamento oscura di un segnale di fluorescenza dal neurone o epidermide. Infine, i progressi nelle tecnologie di microscopia nol'imaging permesso w di campioni con risoluzione sub-diffrazione e può essere particolarmente utile nel discernere la localizzazione delle proteine che vengono espresse in neuroni e cellule epidermiche circostanti ^12,13. Tuttavia, l'imaging via super-risoluzione benefici microscopia da un forte rapporto segnale-rumore e la vicinanza del campione al vetrino. Oltre a ridurre il rapporto segnale rumore, la parete del corpo larvali distanze muscolari DA neuroni dal vetrino, limitando così la risoluzione dell'immagine migliorata che può essere ottenuto con metodi di microscopia super-risoluzione. Oltre le sfide per l'analisi di immunofluorescenza, tessuto muscolare presenta una barriera alla registrazione elettrofisiologica da neuroni sensoriali nella parete del corpo larvale. La sua rimozione beneficia pertanto manipolazione neurofisiologica dei neuroni sensoriali ^14.

Qui un metodo per la rimozione manuale di Drosophila tessuto muscolare larvale è descritto. Abbiamo dimostrato che il nostro protocollo permits immagini immunofluorescenza di proteine ​​che sono altrimenti oscurata da tessuto muscolare, migliora il rapporto segnale-rumore per la visualizzazione di classe IV DA neuroni, e consente l'utilizzo della microscopia super-risoluzione per discriminare meglio relazioni spaziali di proteine ​​e strutture cellulari in DA neuroni e l'epidermide.

Protocollo

Nota: La procedura per la rimozione muscolare (Figura 1) è una modifica di metodi precedentemente descritti per la preparazione di filetti larvale. Le fasi che precedono e seguono la rimozione del muscolo sono descritti brevemente e si rinvia al precedente lavoro ^{10, 11} per una descrizione più dettagliata.

1. Dissect Larva a Saline freddo

1. Preparare una diluizione di lavoro di freddo HL3.1 salina ¹⁵ o Ca ²⁺ freddo -free HL3.1 salina ¹¹ (Tabella 1). Posizionare la larva in un elastomero siliconico piatto con sufficiente soluzione salina fredda per coprire il fondo del piatto.
   NOTA: Si veda la discussione per quanto riguarda la scelta di soluzione salina.

1x HL3.1 salina (pH 7,2)

5 mM HEPES

70 mM NaCl

5 mM KCl

1,5 mm CaCl 2 (omettere per Ca 2+ salina-free)

4 mM MgCl 2

10 mM NaHCO 3

5 mM trealosio

115 mm di saccarosio

Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C

imita Composizione insetti emolinfa: Nota

Tabella 1. Composizione del freddo Saline.

2. Posizionare la larva con il lato ventrale. La superficie ventrale della larva può essere identificato dalle cinture dentical addominali e dal lato dorsale dai tubi tracheali larvali primarie in esecuzione da anteriore a posteriore. Allungare la larva in direzione antero-posteriore e il pin la testa e la coda a unelastomero di silicone dissezione piatto con perni di insetti. Utilizzare forbici dissezione fini per tagliare lungo la linea mediana ventrale, cominciando ad un'estremità e procedendo verso l'altro.
   NOTA: Questo orientamento conserva il cluster dorsale comunemente studiate di DA neuroni.
3. Dopo la larva è tagliato aperto, appuntare i quattro angoli al piatto dissezione come se l'apertura di un libro. Utilizzare pinze per afferrare e rimuovere gli organi interni, tra cui il sistema nervoso centrale, intestino, e la trachea. Regolare i perni di insetti in modo che il filetto è tesa, ma non al massimo allungato.
   NOTA: I muscoli sono ancorati alla parete del corpo ai confini dei singoli settori. Sebbene muscoli coprono la maggior parte della parete del corpo, sono assenti in una stretta regione vicino alla linea mediana dorsale.

Rimozione 2. muscolare

1. Individuare la linea mediana dorsale della larva, dove il tessuto muscolare è assente. Posizionare una singola pinza polo tale da poter essere inserito sotto il tessuto muscolare nella piatta orientamento possibile.
2. A partire dalinea mediana dorsale, vicino al confine anteriore del segmento, far scorrere con attenzione la pinza polo tra il muscolo e dell'epidermide, avendo cura di minimizzare il contatto tra le pinze e dell'epidermide.
3. Estrarre la pinza verso l'alto per rompere l'attacco del muscolo alla parete del corpo in un punto di ancoraggio. Ripetere questo processo per il restante emi-segmento (s) di interesse.
   NOTA: Questo protocollo ottimizza preservazione posteriore di ciascun campo dendrite da neurone. Per preservare la parte anteriore del campo dendrite, è preferibile inserire il polo pinza alla estremità posteriore di ciascun segmento.
4. Riadattare perni insetti tale che il filetto larvale è massimamente stirato in tutte le direzioni.
5. Fissare il filetto mentre è ancora bloccato al piatto dissezione con freddo, preparati al momento formaldeide 4% in PBS per 25 min.
6. Lavare 5 volte in PBS.
7. Utilizzare pinze per estrarre delicatamente via il tessuto muscolare dai punti di ancoraggio restanti, avendo cura di ridurre al minimo contact con l'epidermide.
8. Sblocca e rimuovere il filetto dal piatto dissezione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Eseguire tutte le successive di lavaggio, il blocco, e passi immunofluorescenza, come descritto in precedenza ^11.

3. Montare il larvale Filetto

1. Prima rimuovere la testa e la coda con le forbici dissezione sottili al fine di rendere il campione più piatta possibile. Montare il filetto su un vetrino in antifade di montaggio con la superficie interna del raccordo di fronte al vetrino.
2. Posizionare un vetrino da microscopio sul vetrino e premere delicatamente per disperdere la soluzione di montaggio. Capovolgere il vetrino da microscopio sopra e sigillare il vetrino sul vetrino utilizzando smalto. Diapositive possono essere conservati a -20 ° C per almeno un mese.

Risultati

Dimostriamo l'utilità della procedura di rimozione del muscolo per migliorare rapporto segnale-rumore in esperimenti di immunofluorescenza di co-visualizzare le proteine ​​di derivazione settate Coracle (Cora) e dischi-grandi dimensioni (DLG) insieme con classe IV DA neuroni marcati con il marcatore di membrana CD4- tdTomato.

Cora è stato utilizzato in precedenza per identificare tratti dove DA dendriti dei neuroni sono racchiusi da cellule epidermi...

Discussione

Qui un protocollo è descritto per la rimozione manuale del tessuto muscolare da Drosophila filetti larvale. Questo protocollo modifica precedentemente descritto tecniche di dissezione larvali ^10,11. Dopo la larva è sezionato in un piatto elastomero siliconico, la linea mediana dorsale si trova. Una singola pinza polo, nella sua più piatto possibile orientamento, è attentamente inserito tra il tessuto muscolare e l'epidermide, vicino alla linea mediana dorsale. Le pinze sono delicatamente tira...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4
Zeiss Stemi 2000	Carl Zeiss Microscopy
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	for confocal microscopy
Prolong Diamond antifade mountant	Life Technologies	P36970	for structured illumination microscopy
Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5	VWR	48366-227
Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm	Fisherbrand	12-550-15
Mouse anti-Coracle antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	C615.16	supernatant, dilute 1:50
Mouse anti-Discs large antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	supernatant, dilute 1:50
Rabbit anti-dsRed antibody	Clontech	632496	dilute 1:1,000
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated	ThermoFisher Scientific	A-11011	dilute 1:1,000
Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	ThermoFisher Scientific	A-11001	dilute 1:500