录音伽玛乐队在振荡脚桥核神经元

摘要

脚桥核（PPN）位于脑干和神经元在清醒和快速眼动（REM）睡眠大脑状态最大限度地激活。这部作品描述了实验方法在 PPN神经元体外伽玛带阈下膜振荡记录。

摘要

从PPN突触传出已知的几种调节丘脑板内核区域的神经元活动（ 例如 ，centrolateral /束旁;氯/ PF核）。无论是PPN 或体内氯/ Pf的核的活化已经描述以诱 ​​导动物的觉醒和伽玛频带活性皮质脑电图（EEG）的增量。在网状活化系统伽马频带的振荡的产生的细胞机制（RAS）的神经元的那些相同发现生成其他大脑原子核伽玛波段振荡。期间PPN神经元的电流钳记录（从9矢状切片 - 40日龄鼠），使用去极化平方步骤的快速激活电压依赖性钾通道，阻止PPN神经元被去极化超出-25毫伏。

注射1 - 2秒长的去极化电流逐渐逐渐去极化PPN膜电位资源婷对0毫伏值。然而，注射去极化方形脉冲产生的膜电位的伽玛波段振荡即表明要与由斜面所产生的振动的振幅变小。所有实验都在电压 - 门控钠通道和快速突触受体阻断剂的存在下进行。它已经表明，高阈值电压依赖性钙通道的活化背后伽马波段振荡活性PPN神经元。具体的方法和药物干预在这里描述的，提供了必要的工具来诱导和维持PPN阈下伽玛波段振荡体外 。

引言

PPN核被解剖列入尾脑被盖。该PPN是RAS ¹的重要组成部分。该PPN参与维护行为激活状态（ 即清醒，REM睡眠^）2。 体内 PPN电刺激诱 ​​发的快速振荡（20 - 40赫兹）在皮层脑电图^3，而双侧病变PPN在大鼠中减少或消除REM睡眠^4。虽然大多数PPN神经元开火β/γ波段频率动作电位（20 - 80赫兹），一些神经元呈现自发放电率较低（<10赫兹^）5。此外，PPN似乎参与的行为其他方面，如动机和关注^6。直接高频（40 - 60赫兹）在去大脑动物PPN核⁷电刺激可以促进运动。近年来，深部脑刺激（DBS）PPN的已被用于治疗来回患者涉及步态缺陷米障碍，例如帕金森氏病^（PD）8。

以前的报告显示，几乎所有的神经元PPN可以用平方电流脉冲去极化⁹时在伽马射线波段频率发射动作电位。因为电压 - 门控钾通道的过程中方形脉冲去极化到或在-25毫伏的急剧的活化。其结果是，阻止使用河豚毒素¹⁰动作电位产生之后没有观察到鲁棒伽马振荡。在努力绕过这样的问题，1 - 2秒长的去极化电流斜坡中使用。坡道从休息值高达0毫伏逐渐去极化膜电位，而部分失活的电压 - 门控钾通道。清除伽玛带膜振荡高门槛钙通道的电压依赖性窗口内是明显的（ 即 -25 mV至-0之间毫伏^）10。总之，γ-带活性状况TY在PPN神经元⁹观察到的，和两个P / Q-和N型电压门控钙通道需要，以便产生在PPN ¹⁰伽玛波段振荡被激活。

一系列的研究确定了PPN神经元的高门槛钙通道的位置。注射染料的组合， 比例荧光成像通过在不同的树突激活使用电流斜¹¹去极化时的电压门控钙通道表明钙瞬变。

PPN神经元的固有特性已建议允许唤醒和REM睡眠，从而诱发RAS和丘脑皮层环路之间高频振荡神经元活动中这些细胞的同时激活。这种长期深远的互动被认为是支持能够在连续的基础上¹²可靠地评估我们周围的世界的大脑状态。这里，我们描述了实验必要人条件，以产生和维持伽马频带振荡PPN细胞在体外 。该协议还没有被先前所描述，并有助于若干组研究固有膜性能在其他脑区介导伽马带活性。此外，目前的步骤可能会导致错误的结论伽马射线波段活动不能在这些细胞中产生。

研究方案

所有的实验方案得到阿肯色大学医学科学（协议号＃3593）的机构动物护理和使用委员会批准，均符合卫生准则的国家机构的协议照顾和使用实验动物。

1.标准人工脑脊液的制备（学联）

1. 原液的制备
   1. 添加化学品前加入700毫升蒸馏水至一个干净的1升烧杯中。
   2. 同时连续搅拌下在500毫升体积，添加136.75克的NaCl，6.99克氯化钾，2.89克_硫酸镁 ，并2.83克的NaH ₂ PO ₄的。
   3. 添加更多的蒸馏水中以达到1升的最终体积稀释后，将各化合物的最终浓度为117毫摩尔NaCl，4.69毫摩尔的KCl，1.2毫_硫酸镁 ，和1.18毫摩尔的NaH ₂ PO _4。
   4. 在4℃冷藏保存长达2周。
2. B原液的制备
   1. 添加化学品前加入700毫升蒸馏水到一个干净的1升烧杯中。
   2. 同时连续搅拌下在500毫升体积，添加41.45克D-葡萄糖和41.84克的NaHCO _3。
   3. 添加更多的蒸馏水中以达到1升的最终体积稀释后，将各化合物的最终浓度为11.5毫D-葡萄糖和24.9毫_碳酸氢钠 。
   4. 在4℃冷藏保存长达2周。
   5. 每个实验混合之前50ml料A的用50ml库存B和带来到1L蒸馏水中，得到最终浓度脑脊液溶液并在RT离开而连续地卡波金（95％O ₂ - 5％CO ₂的混合物）充氧它至少30分钟。仅在每个实验开始制备最终浓度脑脊液和在一天结束时丢弃。

2.蔗糖人工脑脊液的制备（蔗糖学联）

1. 库存溶液 C 的制备
   1. 添加化学品前加入700毫升蒸馏水至一个干净的1升烧杯中。
   2. 同时连续搅拌500毫升蒸馏水，加入240克蔗糖，6.55克_碳酸氢钠的，0.671克氯化钾，4.88克_的 MgCl _2，0.22克CaCl ₂和0.21g的抗坏血酸。
   3. 添加更多的蒸馏水中以达到1升的最终体积稀释后，将各化合物的最终浓度为701.1毫蔗糖，78毫_碳酸氢钠 ，9毫米氯化钾，24毫_氯化镁 ，1.5mM的_氯化钙和1.2mM的抗坏血酸。
   4. 保持股票溶液C在4℃下长达一个星期。
   5. 每次实验混合之前300毫升50 ml储备下用蒸馏水以获得终浓度的蔗糖学联溶液并在RT离开而连续地卡波金（95％O ₂ - 5％CO ₂的混合物）充氧它将600ml至少30分钟。

   3.切片准备

   1. 放置一个干净的烧杯在冰100毫升蔗糖学联溶液中，同时用卡波金充氧，并使用pH计，同时加入0.1M的NaOH溶液几滴7.4固定pH值（在pH <7.4）或0.1M的HCl溶液（当pH值> 7.4）。
   2. 填补了蔗糖学联一个vibratome的切割室和氧化它。转联接到所述切割室的基于甘油的冷冻装置上，并等待15分钟，以允许它冷却到0 - 4℃。
   3. 麻醉大鼠幼仔用氯胺酮（成年定时怀孕的Sprague-Dawley大鼠9岁至12）（70毫克/ kg， 腹腔 ;使用<50微升最终体积）。当小狗很平静，仔细检查尾巴捏反射不存在。
   4. 斩首幼崽。
      1. 从前面纵向切割头部皮肤用碳钢手术刀刀片向后，和皮肤拉向两侧使用镊子。切骨保护大脑移动SC横向issors，完全删除它暴露大脑。
      2. 然后，迅速去除用刮刀（最初置于嗅球下以轻轻地从最喙朝向最尾区压出大脑）的大脑。轻轻推脑入冰冷却的含氧蔗糖人工脑脊液（蔗糖ACSF）。
   5. 使在右侧半球一个矢状切口（除去半球的大约三分之一），和大脑的修整侧胶上，将被磁性固定到vibroslicer的切割室切割含有矢状400微米的部分的金属盘脚桥核（PPN）。保持PPN切片在RT之前全细胞膜片钳记录45分钟。

   4. PPN切片录音伽玛波段振荡

   1. 钾细胞内葡萄糖溶液的制备（高K ⁺解决方案）
      1. 放入冰一个干净的烧杯用10毫升蒸馏水。在不断搅拌下加入:K ⁺ -葡萄糖，90.68毫克磷酸迪的Tris盐，47.66毫克HEPES，1.5毫克EGTA，40.58毫克镁^离子 -ATP和4毫克的Na ⁺ ₂ -GTP。
      2. 调节pH至7.3，用KOH（100毫在蒸馏水中）。加蒸馏水至达到20毫升的最终体积。如果需要的话，调节摩尔渗透压浓度与蔗糖（100mM的蒸馏水中）为280 - 290毫渗透摩尔浓度。稀释后，将各化合物的最终浓度为124毫K ⁺ -葡萄糖，10mM的磷酸二的Tris盐，10毫米的HEPES，0.2mM的EGTA，4mM的镁^离子 -ATP和0.3毫米^的 Na ⁺ ₂ -GTP。
      3. 在1ml试管等分试样的细胞内溶液并冷冻在-20℃。使用一个等份每一天，在实验过程中保持在4℃。
   2. 全细胞膜片钳记录
      1. 放置切片中的浸渍室和含氧灌注他们（1.5毫升/分钟）（95％ _的 O ₂ - ，5％CO _2）含有下列受体拮抗剂脑脊液:选择性NMDA受体拮抗剂的2-氨基-5- phosphonovaleric酸（APV，40μM），竞争性AMPA /红藻氨酸盐型谷氨酸受体拮抗剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX，10μM），甘氨酸受体拮抗剂士的宁（STR，10μM），具体_的 GABA _A受体拮抗剂gabazine（GBZ，10μM）和钠通道阻滞剂河豚毒素（TTX，3μM）
         注:在结果和附图，这些拮抗剂统称为突触阻滞剂或SBS。
      2. 填记录补丁移液器;与细胞内高-K ⁺溶液使用与市售的膜片吸管填料（电阻2-7兆欧从常规，可商购的厚壁硼硅玻璃1.0毫米外径和0.6内径的毛细管制造）解决方案过滤器。插入其放大器的持有人的吸管。取一小POS机可持续的竞争压力用1ml注射器连接到使用连接到一个三通阀的硅管的吸移管支架。连接吸管保持器到一个膜片钳放大器的背面。
      3. 移动使用使用4X物镜相结合，近红外微分干涉对比光学的PPN核附近的机械显微记录吸管。
         注:PPN核可在背片可以观察到小脑上脚（SCP;观察到轴突的厚束）。录音移液器均位于PPN 的致密部 ，这是直接位于背侧脚的后端。
      4. 带来与PPN神经元接触记录吸管，同时用40X水浸透镜可视化，并迅速施加负抽吸，以形成与电池的密封。
      5. 使用电压钳密封使用的软件制造商的协议来监测负压吸引过程中吸管阻力。
         1. 当负小​​号，减税缓慢增加，电阻值通过在吸液管的尖端的膜片钳显示器读达到80 - 100兆欧姆，快速改变保持电位至-50毫伏并释放负压。开始连续施加负抽吸直至破裂神经元的膜和电访问在全细胞构造来实现的。
         2. 如果由电压钳密封软件来测量接入电阻值为10兆欧或更高，然后继续在较小量施加负吸力。
      6. 补偿电容和串联电阻在电压钳模式（ 即 ，慢速和快速瞬变破裂细胞的细胞膜后观察到的）。切换录音模式电流钳，并迅速弥补桥值（ 例如 ，移动放大器旋钮或按使用鼠标computer's自动补偿菜单上）。
         1. PPN神经元的连续监测静息电位被记录ū唱制造商的协议。如果休息朝去极化或超极化值的膜电位的移位，然后使用少量的直流（高达100帕），以保持最佳-50毫伏最终值。
            注:仅保留PPN神经元-48 mV的稳定的静息膜电位（RMP）以上超极化（ 即 RMP <-48 mV的）。

结果

最初，伽马振荡采用方形电流脉冲引起的。突触阻滞剂和TTX的存在PPN神经元的电流钳记录连续监测，以确保静息膜电位在约-50 mV的（ 图1A）保持稳定。两个第二长方形的电流脉冲是由通过记录吸管膜片钳放大器细胞内注射，增加其幅度从200 pA的600 PA（ 图1A）。膜电位去极化电压等级接近-20 mV的时候600 pA的，造成小幅度的伽马振荡。伽玛振荡的权力...

讨论

PPN神经元有内在属性，使他们在从动物醒着REM睡眠过程中，而不是在慢波睡眠^2,3,5,13-17 体内录音开火β/γ频段频率动作电位。其他作者发现，脑干横断在更前水平在脑电图记录比减少PPN伽玛频率。然而，当脑干病变后路到这个核心所在，PPN的直接刺激所允许的EEG ^2,3,5,18-21皮质伽玛活动的表现。伽马带神经活动已经报道在小鼠PPN 体外 ^22，在大鼠REM睡眠诱导区域...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501	C12H22O11, molecular weight = 342.30
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014	NaHCO3, molecular weight = 84.01
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911	KCl, molecular weight = 74.55
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272	MgCl2 · 6H2O, molecular weight =  203.30
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881	CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	C6H12O6, molecular weight = 180.16
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960	C6H8O6, molecular weight =176.12
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025	NaCl, molecular weight =  58.44
Potassium Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	C6H11KO7, molecular weight =  234.25
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight =  453.38
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma-Aldrich	A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18
Tetrodotoxin citrate	Alomone Labs	T-550	C11H17N3O8, molecular weight = 319.27
DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid	Sigma-Aldrich	A5282	C5H12NO5P, molecular weight = 197.13
CNQX disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12
Strychnine	Sigma-Aldrich	S0532	C21H22N2O2, molecular weight = 334.41
Mecamylamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	M9020	C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75
Gabazine (SR-95531)	Sigma-Aldrich	S106	C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23
Ketamine hydrochloride	Mylan	67457-001-00
Microscope	Nikon	Eclipse E600FN
Micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
Heater	Warner Instruments	TC-324B
Pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
Pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
Camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200 S
Refrigeration system	Vibratome Instruments	900R
Equipment
microscope	Nikon	Eclipse E600FN
micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
heater	Warner Instruments	TC-324B
pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
pipette puller	Sutter Instruments	P-97
camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C