Grabación de la banda gamma oscilaciones en pedunculopontino Núcleo neuronas

Resumen

El núcleo pedunculopontino (PPN) se encuentra en el tronco del encéfalo y sus neuronas están máximamente activa durante la vigilia y el movimiento ocular rápido (REM) del sueño cerebrales estados. Este trabajo describe el enfoque experimental para registrar en la banda gamma oscilación de la membrana por debajo del umbral vitro en neuronas PPN.

Resumen

Eferentes sinápticas de la PPN son conocidos para modular la actividad neuronal de varias regiones talámicas intralaminares (por ejemplo, la centrolateral / parafascicular; núcleo Cl / Pf). La activación de cualquiera de los PPN o núcleos Cl / PF en vivo se ha descrito para inducir el despertar del animal y un incremento en la actividad de la banda gamma en el electroencefalograma cortical (EEG). Los mecanismos celulares para la generación de oscilaciones de la banda gamma en el Sistema de Activación Reticular (RAS), las neuronas son las mismas que las que se encuentran para generar oscilaciones de la banda gamma en otros núcleos cerebros. Durante las grabaciones de corriente-clamp de neuronas (PPN de rebanadas de parasagittal 9 - ratas 25 días de edad), el uso de despolarización pasos cuadrados activa rápidamente los canales de potasio dependientes de voltaje que impedían neuronas PPN de ser despolarizado allá de -25 mV.

La inyección de 1 - 2 seg tiempo de despolarización rampas de corriente despolariza gradualmente PPN potencial de membrana resting valores hacia 0 mV. Sin embargo, la inyección de despolarizantes pulsos cuadrados generan oscilaciones de banda gamma de potencial de membrana que mostraron ser más pequeña en amplitud en comparación con las oscilaciones generadas por rampas. Todos los experimentos se realizaron en presencia de los canales de sodio dependientes de voltaje y rápidas bloqueadores de receptores sinápticos. Se ha demostrado que la activación de los canales de calcio dependientes de voltaje de umbral alto subyacen la actividad oscilatoria de banda gamma en las neuronas PPN. Intervenciones farmacológicas y metodológicos específicos se describen aquí, proporcionando las herramientas necesarias para inducir y mantener la PPN por debajo del umbral de oscilación banda gamma in vitro.

Introducción

núcleo PPN se incluye anatómicamente en el tegmento mesencefálico caudal. El PPN es un componente clave de RAS ^1. El PPN participa en el mantenimiento de los estados activados de comportamiento (es decir, el despertar, el sueño REM) ^2. La estimulación eléctrica de la PPN in vivo induce la oscilación rápida (20 - 40 Hz) en el EEG cortical ^3, mientras que las lesiones bilaterales PPN en la rata reducen o eliminan el sueño REM ^4. Si bien la mayoría de las neuronas PPN disparar los potenciales de acción en frecuencia / gamma-banda beta (20 - 80 Hz), algunas neuronas presentan bajas tasas de activación espontánea (<10 Hz) ^5. Por otra parte, la PPN parece estar implicado en otros aspectos del comportamiento tales como la motivación y la atención ^6. Alta frecuencia directa (40 - 60 Hz) ⁷ estimulación eléctrica del núcleo PPN en animales descerebrados puede promover la locomoción. En los últimos años, la estimulación profunda del cerebro (DBS) de PPN se ha utilizado para tratar a pacientes que sufren frotrastornos que implican déficits m de la marcha, como la enfermedad (PD) ⁸ de Parkinson.

Los informes previos demostraron que casi todas las neuronas PPN pueden disparar potenciales de acción en la frecuencia de la banda gamma cuando se despolariza el uso de pulsos de corriente ⁹ cuadrados. Debido a la activación drástica de los canales de potasio dependientes de voltaje durante las despolarizaciones pulsos cuadrados hasta o bajo -25 mV. Como consecuencia, no se observaron fuertes oscilaciones gamma después de bloquear la generación de potenciales de acción utilizando la tetrodotoxina ^10. En un esfuerzo por evitar tal problema, 1 - Se han usado 2 seg largo de despolarización rampas de corriente. Rampas despolariza gradualmente el potencial de membrana a partir de valores de hasta 0 mV en reposo, mientras se inactiva parcialmente los canales de potasio dependientes de voltaje. Claras oscilaciones de la membrana de la banda gamma fueron evidentes dentro de la ventana de dependencia de voltaje de los canales de calcio de alto umbral (es decir, entre -25 mV y -0 mV) ^10. En conclusión, la banda gamma activiTy se observó en las neuronas PPN ^9, y Q y los canales de calcio dependientes de voltaje tipo N necesita / P tanto para ser activado con el fin de generar las oscilaciones de la banda gamma en el PPN ^10.

Una serie de estudios determinó la ubicación de los canales de calcio en las neuronas de alto umbral PPN. La inyección de la combinación de colorantes, imágenes de fluorescencia radiométrica mostró transitorios de calcio a través de los canales de calcio dependientes de voltaje que se activan en diferentes dendritas cuando despolarizado utilizando rampas de corriente ^11.

propiedades intrínsecas de las neuronas PPN se han sugerido para permitir la activación simultánea de estas células durante la vigilia y el sueño REM, induciendo así la actividad neuronal oscilatoria de alta frecuencia entre el SRA y bucles thalamocortical. Dicha interacción de largo alcance se considera para apoyar un estado cerebral capaz de evaluar de manera fiable el mundo que nos rodea de forma continua ^12. A continuación, describimos el experimentoAL condiciones necesarias para generar y mantener la oscilación gamma banda en células in vitro PPN. Este protocolo no se ha descrito anteriormente, y ayudaría a una serie de grupos para estudiar las propiedades intrínsecas de membrana que median la actividad de la banda gamma a otras áreas del cerebro. Por otra parte, las medidas actuales podrían conducir a la conclusión errónea de que la actividad de la banda gamma no se puede generar en estas células.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas (Protocolo número # 3593) y estaban de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Preparación de líquido cefalorraquídeo Standard-artificial (ACSF)

1. Preparación de la disolución de la A
   1. Añadir 700 ml de agua destilada a un vaso de precipitados limpio 1 L antes de la adición de productos químicos.
   2. Mientras se agitaba continuamente un volumen de 500 ml, añadir 136,75 g de NaCl, 6,99 g de KCl, 2,89 g de MgSO _4, y 2,83 g de NaH ₂ PO _4.
   3. Añadir más agua destilada hasta alcanzar un volumen final de 1 L. Después de la dilución, la concentración final de cada compuesto es 117 mM NaCl, KCl 4,69 mM, 1,2 mM de _MgSO4, y 1,18 mM NaH ₂ PO _4.
   4. Mantener refrigerado a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
2. Preparación de la disolución de la B
   1. Añadir 700 ml de agua destilada a un vaso de precipitados de 1 l limpia antes de la adición de productos químicos.
   2. Mientras se agitaba continuamente un volumen de 500 ml, añadir 41,45 g de D-glucosa y 41,84 g de NaHCO _3.
   3. Añadir más agua destilada hasta alcanzar un volumen final de 1 L. Después de la dilución, la concentración final de cada compuesto es de 11,5 mM de D-glucosa y 24,9 mM _{de NaHCO3.}
   4. Mantener refrigerado a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
   5. Antes de cada mezcla de ensayo de 50 ml de la acción A con 50 ml de solución madre B y llevar a 1 l con agua destilada para obtener una solución definitiva LCRa concentración y dejar a temperatura ambiente mientras se continua la oxigenación con Carbógeno (95% O ₂ - 5% de CO ₂ de la mezcla) durante al menos 30 min. Preparar LCRa concentración final sólo al comienzo de cada experimento y desechar al final del día.

2. Preparación de líquido cefalorraquídeo sacarosa-artificial(Sacarosa-LCRa)

1. Preparación de la solución de la C
   1. Añadir 700 ml de agua destilada a un vaso de precipitados limpio 1 L antes de la adición de productos químicos.
   2. Mientras se agita continuamente a 500 ml de agua destilada, añadir 240 g de sacarosa, 6,55 g de NaHCO _3, 0,671 g de KCl, 4,88 g de MgCl _2, 0,22 g de CaCl ₂ y 0,21 g de ácido ascórbico.
   3. Añadir más agua destilada para llegar a un volumen final de 1 L. Después de la dilución, la concentración final de cada compuesto es sacarosa 701,1 mM, 78 mM NaHCO _3, 9 mM de KCl, 24 mM MgCl _2, CaCl 1,5 mM de ácido ascórbico ₂ y 1,2 mM .
   4. Mantenga disolución madre C a 4 ° C durante un máximo de una semana.
   5. Antes de cada mezcla experimento 300 ml de 50 ml de Stock C con 600 ml de agua destilada para obtener la solución de sacarosa-LCRa a la concentración final y dejar a temperatura ambiente mientras que continuamente la oxigenación con carbógeno (95% O ₂ - 5% de CO ₂ de la mezcla) durante al menos 30 min.

3. Preparación de la rebanada

1. Coloque un vaso de precipitados limpio con 100 ml de solución de sacarosa-LCRa en hielo, mientras que la oxigenación con carbógeno y corregir el pH a 7,4 usando un medidor de pH, mientras que la adición de unas gotas de solución 0,1 M de NaOH (cuando pH <7,4) o solución de HCl 0,1 M (cuando pH> 7,4).
2. Llenar una cámara de corte de un vibratome con sacarosa-ACSF y oxigenar la misma. Encienda el sistema de refrigeración basado en glicerol acoplado a la cámara de corte y esperar 15 minutos para permitir que se enfríe a 0 - 4 ° C.
3. Anestesiar a las crías de rata (9 a 12 años de adulto oportuna embarazadas ratas Sprague-Dawley) con ketamina (70 mg / kg, ip, usando <50 l de volumen final). Cuando las crías está en calma, vuelve a comprobar que el reflejo de pinzamiento del rabo está ausente.
4. Decapitar a los cachorros.
   1. Cortar la piel de la cabeza longitudinalmente desde el frente hacia atrás utilizando una hoja de bisturí de acero al carbono, y tire de la piel a los lados con fórceps. Cortar el hueso que cubre el cerebro se mueva el indicador scissors lateralmente y totalmente quitarlo para exponer el cerebro.
   2. A continuación, retire rápidamente el cerebro usando una espátula (inicialmente colocado bajo el bulbo olfatorio con el fin de empujar suavemente el cerebro desde la más rostral hacia las zonas más caudal). Empuje suavemente el cerebro en el líquido enfriado con hielo oxigenada sacarosa-cefalorraquídeo artificial (ACSF-sacarosa).
5. Haga un corte parasagital en el hemisferio derecho (la eliminación de aproximadamente un tercio del hemisferio), y la cola de la parte recortada del cerebro en un disco metálico que se fija magnéticamente a la cámara de corte de un vibroslicer para cortar sagitales 400 micras secciones que contienen la núcleo pedunculopontino (PPN). Mantenga rebanadas PPN a temperatura ambiente durante 45 minutos antes de patch-clamp grabaciones de células enteras.

4. Las oscilaciones Grabaciones gamma-banda en PPN Rebanadas

1. Preparación de la solución intracelular de potasio-gluconato (alta-K Solution ⁺⁾
   1. Colocar enhielo en un vaso de precipitados limpio con 10 ml de agua destilada. Mientras se agitaba continuamente añadir: K ⁺ -gluconate, 90.68 mg fosfocreatina di Tris sal, HEPES 47.66 mg, 1,5 mg de EGTA, 40,58 mg de Mg ^{2 +} -ATP, y 4 mg ^de Na ⁺ ₂ -GTP.
   2. Ajustar el pH a 7,3 con KOH (100 mM en agua destilada). Añadir agua destilada hasta alcanzar un volumen final de 20 ml. Si es necesario, ajustar la osmolaridad con sacarosa (100 mM en agua destilada) a ser 280 a 290 mOsm. Después de la dilución, la concentración final de cada compuesto es 124 mM K ⁺ -gluconate, 10 mM fosfocreatina di sal Tris, HEPES 10 mM, EGTA 0,2 mM, Mg2 ⁺ -ATP 4, y Na 0,3 mM ⁺ ₂ -GTP.
   3. soluciones alícuota de 1 ml intracelulares en tubos y congelación a -20 ° C. Utilice una alícuota por día y mantener a 4 ° C durante los experimentos.
2. De células enteras Patch Clamp Grabaciones
   1. Coloque las rebanadas en una cámara de inmersión y perfundir ellos (1,5 ml / min) con oxigenada(95% O ₂ - 5% de CO ₂₎ LCRa que contiene los siguientes antagonistas de los receptores: antagonista del receptor de ácido selectivo de NMDA 2-amino-5-fosfonovalérico (APV, 40 M), competitivo AMPA / kainato antagonista del receptor de glutamato 6-ciano-7- nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX, 10μM), antagonista del receptor de glicina estricnina (STR, 10 M), el GABA específica _A gabazine antagonista del receptor (GBZ, 10 M), y sodio tetrodotoxina bloqueador de los canales (TTX, 3μM)
      NOTA: En los resultados y las cifras, estos antagonistas se denominan colectivamente como bloqueadores sinápticas o SBS.
   2. Llenar las pipetas de parche de grabación (2-7 Resistencia mO; hecha de gruesos tubos capilares regulares, disponibles en el mercado de vidrio de borosilicato de pared de 1,0 mm de diámetro exterior y 0,6 mm de diámetro interior) con la solución intracelular de alto K ⁺ utilizando rellenos patch-pipetas disponibles en el mercado con una filtro de la solución. Inserte la pipeta en el soporte de su amplificador. Aplicar una pequeña pospresión itive usando una jeringa de 1 ml conectada al soporte de pipeta usando un tubo de silicona conectado a una válvula de tres vías. Conecte la parte posterior del soporte de pipeta a un amplificador de patch clamp.
   3. Mover la pipeta de grabación utilizando un micromanipulador mecánico cerca del núcleo PPN usando un objetivo 4X combinado de interferencia diferencial óptica de contraste en el infrarrojo cercano.
      NOTA: núcleo PPN se puede observar en rodajas dorsal al pedúnculo cerebeloso superior (SCP; observable como un grueso manojo de los axones). Pipetas de registro se encuentran en la PPN pars compacta, que se encuentra inmediatamente dorsal al extremo posterior del pedúnculo.
   4. Llevar la pipeta de grabación en contacto con una neurona PPN mientras visualizaron utilizando un objetivo de inmersión 40X agua, y rápidamente aplicar succión negativa para formar un sello con la célula.
   5. Utilice el software de sellado de fijación de voltaje para controlar la resistencia de la pipeta durante la succión negativa usando el protocolo del fabricante.
      1. Cuando s negativosucción se aumenta lentamente y los valores de resistencia de lectura por el monitor de patch-clamp en la punta de la pipeta alcanzar 80 a 100 MOhm, cambiar rápidamente el potencial de mantenimiento de -50 mV y liberar la presión negativa. Iniciar la aplicación continua de succión negativa hasta la ruptura de membrana y eléctrica acceso de la neurona se consigue en la configuración de célula completa.
      2. Si los valores de resistencia de acceso medidos por el software de sellado de fijación de voltaje son de 10 MOhm o superior, y luego continuar aplicando succión negativa en cantidades más pequeñas.
   6. Compensar capacitancia (es decir, transitorios lentos y rápidos observados después de la ruptura de la membrana de la célula) y la resistencia en serie en el modo de fijación de voltaje. Cambiar el modo de grabación de fijación de corriente, y rápidamente compensar los valores de puente (por ejemplo, mover botón del amplificador o haga clic en el menú de compensación automática a través del ratón computer's).
      1. Un seguimiento continuo de descanso potencial de membrana de la neurona PPN está grabando ucantar el protocolo del fabricante. Si el potencial de membrana en reposo cambio hacia valores de despolarización o hiperpolarización, a continuación, utilizar pequeñas cantidades de corriente continua (hasta 100 Pa) para mantener el valor final óptimo -50 mV.
         NOTA: Mantener sólo las neuronas PPN con un potencial de membrana en reposo estable (PGR) de -48 mV o más hiperpolarizado (es decir, RMP <-48 mV).

Resultados

Inicialmente, oscilaciones gamma fueron evocados utilizando impulsos de corriente cuadrados. Grabación abrazadera actual de las neuronas PPN en presencia de bloqueadores sinápticas y TTX se monitorizó continuamente para asegurar que el potencial de reposo de la membrana se mantuvo estable a ~ -50 mV (Figura 1A). Dos segundos impulsos de corriente largos cuadrados fueron inyectadas intracelularmente por el amplificador de pinzamiento zonal a través de la pipeta de la ...

Discusión

PPN neuronas tienen propiedades intrínsecas que les permiten disparar potenciales de acción en las frecuencias de la banda beta / gamma durante las grabaciones en vivo de los animales que están despiertos o durante el sueño REM, pero no durante el sueño de ondas lentas ^2,3,5,13-17. Otros autores han mostrado que los cortes transversales del tallo cerebral en más niveles anteriores de PPN reduce frecuencias gamma durante los registros de EEG. Sin embargo, cuando las lesiones del tronco cerebral ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501	C12H22O11, molecular weight = 342.30
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014	NaHCO3, molecular weight = 84.01
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911	KCl, molecular weight = 74.55
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272	MgCl2 · 6H2O, molecular weight =  203.30
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma-Aldrich	C3881	CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	C6H12O6, molecular weight = 180.16
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960	C6H8O6, molecular weight =176.12
Sodium Chloride	Acros Organics	327300025	NaCl, molecular weight =  58.44
Potassium Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	C6H11KO7, molecular weight =  234.25
Phosphocreatine di(tris) salt	Sigma-Aldrich	P1937	C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight =  453.38
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma-Aldrich	A9187	C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G8877	C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18
Tetrodotoxin citrate	Alomone Labs	T-550	C11H17N3O8, molecular weight = 319.27
DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid	Sigma-Aldrich	A5282	C5H12NO5P, molecular weight = 197.13
CNQX disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	C239	C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12
Strychnine	Sigma-Aldrich	S0532	C21H22N2O2, molecular weight = 334.41
Mecamylamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	M9020	C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75
Gabazine (SR-95531)	Sigma-Aldrich	S106	C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23
Ketamine hydrochloride	Mylan	67457-001-00
Microscope	Nikon	Eclipse E600FN
Micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
Heater	Warner Instruments	TC-324B
Pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
Pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
Camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200 S
Refrigeration system	Vibratome Instruments	900R
Equipment
microscope	Nikon	Eclipse E600FN
micromanipulator	Sutter Instruments	ROE-200
micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
A/D converter	Molecular Devices	Digidata 1440A
heater	Warner Instruments	TC-324B
pump	Cole-Parmer	Masterflex L/S 7519-20
pump cartridge	Cole-Parmer	Masterflex 7519-85
pipette puller	Sutter Instruments	P-97
camera	Q-Imaging	RET-200R-F-M-12-C