分离培养犬从动脉和静脉主血管内皮细胞

摘要

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

摘要

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

引言

狗被用作大型动物模型为心血管疾病的研究和也可以从天生（基因）血管异常^1,2受到影响。为了研究这些疾病的商业内皮细胞系通常用于评估内皮细胞（EC）的功能。狗有可用（CnAOEC）一家商业内皮细胞线，从犬主动脉的。该细胞系在研究，作为控制正常内皮细胞^3-5个最常用的。在人类心血管疾病研究中最常用的内皮细胞系分别来自人脐静脉和动脉，派生人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人脐动脉内皮细胞（HUAECs）。内皮细胞已被用来作为自1980年代以来⁶在血管研究的金标准。它们被认为是研究内皮功能和疾病适应的经典模型系统。从不同的血管分离的内皮细胞的变化appearance和由于遗传背景和暴露于微环境^7的功能。另外，内皮细胞和HUAECs从脐带衍生的，可能不会完全模拟成人血管相对于该条件下，它们被暴露于并响应于疾病发展的血管结构。因此，在一般翻译内皮细胞中发现的结果和HUAECs心血管疾病是不够的。

当学习适应和成年内皮细胞的行为，从感兴趣的容器主内皮应作为一个更直接的方法。为了分离这些细胞，已报道的几种方法。一种广泛描述的方法，它也用于内皮细胞，用酶消化溶液⁸冲洗容器。这通常会导致与非内皮细胞污染如平滑肌细胞和成纤维^9。为隔离另一种常用的方法是剁碎血管组织的酶消化，随后通过荧光 -激活细胞根据分化（CD）的31 ^7，8。FACS分选的内皮细胞标记物群集和随后的细胞培养分选（FACS）需要相对大量的细胞的，因此不适合于内皮细胞的小血管的隔离。因此，我们旨在开发用于从各种犬血管具有高纯度的分离出纯的内皮细胞群的新的鲁棒方法。为了测试新的隔离方法的有效性，我们分离并从不同的犬动脉和静脉，大型和小型纯获得主犬内皮细胞（CAPEC）文化。这种方法还可以使从患病和/或异常血管始发如先天内或肝外门体分流，犬²的常见疾病的内皮细胞的培养。该方法允许额外的相关细胞类型相同的容器，如血管平滑肌细胞的分离，因为大多数的船只保持INT在操作过程中起作用。

研究方案

伦理声明:在本研究中所用的血管收获是从新鲜尸体犬获得的剩余材料（N = 4）安乐死其他无关的研究（大学3R政策）健康的狗。异常血管（内和肝外门体分流术，N = 1个）收获从提交给大学医院的乌得勒支大学的伴侣动物狗的业主知情同意后验尸。

1.隔离主犬内皮细胞的培养和

1. 用2ml /孔的0.5％w / v的明胶和预涂层6孔板，在37℃用5％CO ₂的潮湿气氛离开2小时在恒温箱。播种原代细胞之前，除去多余的明胶溶液。
2. 无菌删除从新鲜尸体犬（ 图1A）血管（S）的利益（ 例如，主动脉，下腔静脉，肝门静脉）。维持血管系统的解剖结构通过将直镊子感兴趣的容器的两端。避免与镊子的组织的不必要的操作，以防止对血管内皮细胞的损伤。
   1. 切断与手术剪两端夹紧容器，并从尸体除去。运输中Hank氏冰上平衡盐溶液（HBSS）中。
      注:大约5厘米的容器长度是优选的此过程，但那些测量1厘米还将向培养提供足够的细胞。
3. 血管转移至培养皿填充用冰冷的HBSS。用手术剪，从容器的外侧除去任何粘附的组织和脂肪，保持容器本身完整（ 图1B）。确保切割时船舶在任何时候都清晰可见:拉拨周围组织用夹子或镊子最佳视图。
   1. 关闭船只的任何分支机构，连字（ 例如 ，聚乳糖3-0），随后将其删除与外科剪刀或手术刀。
4. 小心进入具有弯曲霍尔斯特德蚊子镊子的容器端，在容器的另一端夹住钳子的前端，然后缩回，慢慢倒转容器中，直至其完全内向外（ 图1C-G）。外部现在由内皮细胞层的。如果任何困难是在反相容器中遇到，淹没在HBSS再次以减少摩擦。
5. 放置荷包缝合在容器的两端完全关闭它，并防止任何非内皮血管组织的消化过程（ 图1H）的曝光。使用绑带末端操纵倒置容器中。
6. 如果消化和文化稍后进行冷冻保存前的消化协议（步骤1.7）倒船。
   1. 将倒船只混和，细胞培养冻存液填充。冻结下降到-80℃，用冷冻合作ntainer。储存于-80℃，如果船只要在一周内使用。对于长期储存，在-180℃的冷冻管到位。当执行欧共体隔离，迅速解冻冷冻管在水浴（37℃），并立即放置在冰冷的HBSS。请按照1.7所示。
      注意:考虑到该内皮细胞的分离后的总产率将降低，由于在冷冻过程中丧失活力。
7. 容器转移至50ml管中，并在HBSS冲洗两次以除去红细胞（或剩余冷冻介质在解冻的情况下）（ 图1I）。
8. 消化在50ml管中在容器用30 ml胶原酶II型（0.15单位/ ml）和分散酶（0.15单位/毫升）的犬内皮细胞生长培养基（CECGM）1小时，在37℃，间歇温和溶液搅动。
9. 从管中取出容器，并在250离心细胞悬浮液5分钟×g下。
10. 重悬在CECGM一个细胞沉淀第二，每孔种子2毫升细胞悬液（1 - 3井取决于容器的大小）。培养在5％的CO ₂在空气中的潮湿气氛中的细胞在37℃，并改变它的培养基每周两次。
11. 通道中的细胞70汇合时 - 在达到80％以上。
    1. 清洗细胞与预热HBSS去除死或非贴壁细胞。加入200μl重组细胞解离酶（1倍），以每个孔，并放回培养箱中5分钟或直到所有的细胞分离。
    2. 转移细胞到15毫升管中并通过加入10ml培养基（CEGM）含10％胎牛血清（FCS）的停止胰蛋白酶消化。离心机在250×g下5分钟。继续培养明胶预涂板或瓶。

2.表征

1. 培养犬主动脉内皮细胞（CnAOECs）并比较初级和商业细胞系用显微镜每周两次的形态。
   注:t他典型的成长内皮细胞的图案补丁是达到> 70％汇合时，最能观察到。
   1. 培养CnAOECs在CECGM上的0.5％重量/预涂-V明胶T75烧瓶中。传代细胞每周一次当汇合为70％ - 80％。
      1. 为传代，用预温热的HBSS洗涤细胞一次，并加入1 ml重组细胞解离酶（1×）。放置烧瓶放回培养箱中5分钟或直到所有的细胞分离。通过加入10ml培养基（CEGM）含10％FCS的灭活胰蛋白酶。离心细胞悬浮液5分钟，在250 xg离心，弃去上清，重悬在1ml培养基中的细胞。
      2. 取细胞悬浮液的10微升等分试样和稀释1:1 0.4％台盼蓝。计数使用自动细胞计数器的细胞，并在新的T75烧瓶积垢4.0×10 ^5个活细胞。在37℃下在5％的CO ₂的潮湿气氛中加入10 mL预热CECGM的烧瓶中并培养。
2. 从培养CaPECs和CnAOECs的通道1分离RNA。
   1. 收集至少为1×10 ^3个细胞作为沉淀，加入20微升样品制备试剂（SPR）的孵育1分钟以裂解细胞。培养后，小心收集含在-70℃下的总RNA和存储的细胞裂解物。
3. 使用按照制造商的指示的cDNA合成试剂盒（ 例如，的iScript）转换的mRNA合成cDNA。在4℃长达一个星期，或者在-20℃储存的cDNA长期直至准备执行的qPCR。
4. 测量血管内皮标记CD31基因的表达，以确认内皮细胞来源。执行实验装置和量化使用MIQE简要记录准则^10。对于标准化，测量参考基因GAPDH，RPS19和B2MG ¹¹的表达。
   1. 在无核酸酶的水制备得到的cDNA的10倍稀释。
   2. 准备从合并的cDNA样品的4倍稀释的标准线，并使用不含核酸酶的水作为非模板对照。稀释样本五次以达到定量PCR反应的50倍的总稀释度。一式两份移取10微升的反应中使用4μl的cDNA和6微升反向和正向引物（ 表1）的20皮摩尔混合荧光团的一个384孔格式。
   3. 程序设定为95℃，在95℃5分钟为Taq聚合酶活化，然后用10秒的39个循环变性，和在Tm 30秒退火和延伸。上述Tm为每个引物组示于表1中 。
   4. 进行熔解曲线分析下列每一次运行，以确保只有一个产品被放大。正常化使用参考基因​​的平均相对量的样品的表达水平，并计算ΔCT如果反应效率为95％和105％之间。
5. 与ANGI评估EC功能ogenesis检测。
   1. 添加10微升的细胞外基质的一预冷却的血管发生滑动的各孔，并用移液管尖端扩散到覆盖的表面良好。保持在冰上的细胞外基质和避免引入气泡进入凝胶。通过用水浸湿的纸巾在37℃，5％的CO ₂将所述滑动在培养皿在培养箱中30分钟固化的凝胶。
   2. 添加1.0×10 ^4个主 内皮在50μl内皮生长培养基每孔。孵育6小时，在37℃，5％的CO ₂的幻灯片。
   3. 6小时后拍照用放大20倍，并确保包括整个很好的形象。

结果

不同的血管被成功经受所描述的隔离协议（ 图2）。这是可能的剖析和反转主动脉，下腔静脉，肝门静脉和冠状动脉健康的狗（从每只犬的所有船只，N = 4）。用同样的方法进行内皮两个先天性门体分流术（肝和肝内，N = 1个）隔离。虽然主动脉很容易倒，胸主动脉段均高于腹主动脉更具挑战性。在胸段中的主动脉有许多肋间动脉从它的分支，这需要单独连接?...

讨论

在研究中注重对犬内皮细胞的CnAOEC主线路用于狗^3，12，13的内皮细胞谱系的模型。在人类的研究中，HUVEC文化仍然被认为是黄金标准。显然，仅仅着眼于从脐带来源的内皮细胞是心血管研究的坚定限制。内皮细胞具有特定的基因表达模式确定动规范。为了占产后血管这些差异，我们提出了一种基于血管内皮细胞的特定解剖位置这种新的隔离法。通常用于主乳油分离方法被冲洗用酶溶液的容?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM (1x) + GlutaMAX	Life Technologies	31966-021
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-050
Canine Endothelial Cells Growth Medium	Cell Applications	Cn211-500
CnAOECs	Cell Applications	Cn304-05
Fetal Calf Serum (FCS)	GE Healthcare	16000-044
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013
SPR	Bio-Rad	170-8898
iScript synthesis kit	Bio-Rad	170-8891
SYBR green super mix	Bio-Rad	170-8886
Recovery Cell Freezing Medium	Gibco/Life Technologies	12648-010	Keep on ice prior to use
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)	B. Braun Medical	BC555R
Mosquito forceps	B. Braun Medical	FB440R
Mosquito forceps curved	B. Braun Medical	FB441R
polyglactin 3-0	Ethicon	VCP311H
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013
Automated counting chamber	Bio-Rad	145-0102
Counting Slides, Dual Chamber	Bio-Rad	145-0011
Matrigel	BD Biosciences	BD356231	Slowly thaw on ice
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	81501
Endothelial Growth Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit	Lonza	CC-4176