개 동맥과 정맥에서 차 내피 세포의 분리 및 문화

요약

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

초록

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

서문

개는 심혈관 질환의 연구에 큰 동물 모델로서 사용하고 또한 선천적 (유전 적), 혈관 이상 ^{(1, 2)으로} 고생 할 수있다. 상업적 내피 세포주 종종 내피 세포 (EC)의 기능을 평가하기 위해 사용되는 이들 질병을 연구. 개를위한 개 대동맥에서 파생 된 (CnAOEC) 가능한 한 상업 내피 세포 라인이있다. 이 세포주는 주로 제어되는 EC 통상 ^3-5과 같은 연구에 사용된다. 인간 심장 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 내피 세포주 각각 인간 제대 정맥 및 동맥 유래의 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC를) 및 인간 배꼽 동맥 내피 세포 (HUAECs)가있다. HUVECs를 1980 년대 ⁶ 이후 혈관 연구의 황금 표준으로 사용되어왔다. 그들은 내피 세포의 기능과 질병 적응을 연구하는 고전적인 모델 시스템으로 간주됩니다. 다른 혈관 내피 세포로부터 분리는 외관 창출 다양전자 및 미세 ⁷ 유전 적 배경과 노출로 인한 기능을 제공합니다. 또한, HUVECs를하고 HUAECs은 탯줄에서 조건에 대해 완벽하게 모방 성인 혈관 그들이에 질병에 대응하여 노출되지 않을 수 있습니다 발달 혈관 구조를 유도된다. 따라서, 일반적으로 심혈관 질환에 HUVECs를 발견 결과와 HUAECs을 번역하는 것은 부적절하다.

적응과 성인되는 EC의 행동을 연구 할 때, 관심있는 선박에서 주되는 ​​EC는보다 직접적인 방법으로 사용되어야한다. 이들 세포를 분리하기 위해 여러 가지 방법이보고되어있다. 또한 HUVECs를 위해 사용되는 광범위하게 설명 된 방법은, 효소 적 소화 용액 ^(8)과 용기를 세척한다. 이것은 종종 평활 근육 세포 및 섬유 아세포 ⁹ 비되는 EC의 오염을 초래한다. 분리를위한 또 다른 자주 사용되는 방법은 다음 fluorescence- 다진 혈관 조직의 소화 효소 인분화 (CD) (31) ^{(7, 8).} FACS 분류의 내피 세포 마커 클러스터 이후 세포 배양에 기초한 (FACS)를 정렬 활성화 전지 셀의 비교적 대용량을 필요로하며, 따라서 작은 혈관의 내피 세포의 분리에는 적합하지 않다. 우리는 따라서, 고순도의 각종 송곳니 혈관으로부터 순수한 내피 세포 집단을 분리하기위한 새로운 강력한 방법을 개발 목표로. 새로운 분리 방법의 효율성을 테스트하기 위해, 우리는 고립과 크고 작은 여러 개 동맥과 정맥에서 순수한 개 주 내피 세포 (CaPEC) 문화를 획득했습니다. 이 방법은 또한 선천적 인트라 또는 여분 간 문맥 정맥 션트, 개 ^2에서 일반적인 질환과 같은 질병 및 / 또는 비정상적인 혈관에서 발생하는 내피 세포의 배양을 할 수 있습니다. 용기의 대부분이 남아 INT 이후 방법은 혈관 평활근 세포와 같은 용기의 추가적인 중요한 세포 유형의 분리를 허용절차를 수행하는 동안 역할을합니다.

프로토콜

윤리 문 : 본 연구에 사용 된 혈관은 신선한 개 사체에서 얻은 잉여 재료로 수확 (N = 4) 기타 관련이없는 연구 (대학 3R 정책)에 대한 안락사 건강한 개에서. 비정상적인 혈관 (인트라과 간외 문맥 정맥 션트, N = 1 각) 위트레흐트 대학의 반려 동물에 대한 대학 병원에 제출 개에서 소유자의 동의 후 사후을 수확했다.

1. 분리 및 문화 차 개 내피 세포의

1. 2 ㎖ /도 0.5 % w / v를 젤라틴과와 사전 코트 6 웰 플레이트는 37 ° C에서 5 % CO _2의 가습 분위기 인큐베이터에서 2 시간 동안 둡니다. 이전의 기본 세포를 파종을 초과 젤라틴 용액을 제거합니다.
2. 무균 신선한 개 사체 (그림 1A)에서 혈관 (들)의 관심 (예를 들어, 대동맥, 대정맥, 대정 간이)를 제거합니다. 용기 시스템의 해부학 유지관심있는 선박의 양단에 직선 집게를 배치하여. 내피 세포의 손상을 방지하기 위해 집게로 조직의 불필요한 조작을하지 마십시오.
   1. 수술 가위로 양쪽 끝에있는 고정 용기를 잘라 시신에서 제거합니다. 얼음에 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 전송.
      참고 : 약 5cm의 혈관 길이는이 절차 바람직하지만 1cm를 측정하는 것과도 문화에 충분한 세포를 제공 할 것입니다.
3. 얼음처럼 차가운 HBSS 가득 페트리 접시에 혈관을 전송합니다. 수술 가위를 사용하여 용기 자체의 손상 (그림 1B)를 유지, 용기의 외부에서 모든 부착 조직과 지방을 제거합니다. 최적의 뷰의 클램프 또는 집게로 옆으로 주변 조직을 당겨 : 절단시 반드시 선박이 항상 명확하게 볼 수 있습니다합니다.
   1. 합자로 선박의 어떤 지점을 닫습니다 (예를 들면, 3-0 polyglactin)이어서 제거수술 가위 나 메스와.
4. 주의 깊게 만곡 홀스 테드 모기 집게 용기 단부 입력 용기의 타 단부에 나이프의 선단부를 클램핑하고 외부 (도 1C-G)를 완전히 안쪽까지 서서히 상기 용기를 반전 후퇴. 외부는 이제 내피 세포 층으로 구성되어 있습니다. 어떤 어려움이 용기 반전시에 발생되는 경우, 마찰을 줄이기 위해 다시 HBSS에 잠기.
5. 완전히 폐쇄하고 소화 절차 (그림 1H)에 비 내피 혈관 조직의 노출을 방지하기 위해 선박의 양쪽 끝에서 지갑 문자열 봉합을 놓습니다. 반전 용기를 조작 할 수 합자 끝을 사용합니다.
6. 소화 배양 후에 수행되면, 소화 프로토콜 (단계 170) 전에 반전 용기 cryopreserve.
   1. cryovial에 반전 용기를 놓고 세포 배양 매체를 동결 채우기. 동결 공동 사용 아래 -80 ° C에 고정의 ntainer. -80 ℃에서 저장은 선박 1 주일 이내에 사용하는 경우. 장기 보관, -180 ° C에서 장소 크리오 바이알 (cryovial)하십시오. EC의 격리를 수행 할 때, 수조 (37 ℃)에서 급속 해동 크리오 바이알 (cryovial)를 즉시 얼음처럼 차가운 HBSS에 놓는다. 1.7에 표시된대로 진행합니다.
      참고 : 분리 후 내장 컴퓨터의 총 생산량이 때문에 냉동 과정에서 생존 능력의 손실에 낮은 것을 고려.
7. 50 ML 튜브에 용기를 전송하고 (그림 1I) (해동의 경우 또는 잔류 동결 매체) 적혈구를 제거 HBSS로 두 번 씻어.
8. 간헐 부드러운 37 ° C에서 1 시간 동안 개 내피 세포에서 30 ㎖의 콜라게나 제 유형 II (0.15 U / ml) 및 디스 파제 (0.15 U / ㎖)의 용액 성장 중간 (CECGM)와 50ml의 튜브 용기 다이제스트 동요.
9. g 튜브로부터 상기 용기를 분리하고, X (250)에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리.
10. CECGM A의 세포 펠렛을 재현 탁ND 시드 2ml의 세포 현탁액은 웰 당 (1 - 웰 용기의 크기에 따라). 문화 공기에서 5 % CO _2의 가습 분위기 37 ℃에서 세포는 일주일에 두 번 배지를 변경.
11. 80 % 도달 - 70의 포화 상태가 통로 셀.
    1. 죽은 또는 비 부착 세포를 제거하기 위해 미리 예열 HBSS로 세포를 씻으십시오. 각 웰에 200 ㎕의 재조합 세포 분해 효소 (1 배)를 추가하고 5 분 동안 또는 모든 셀이 분리 될 때까지 다시 인큐베이터에 배치합니다.
    2. 15 ㎖의 튜브에 세포를 옮기고, 10 % 소 태아 혈청 (FCS)을 포함한 배지 10 ㎖ (CEGM)을 첨가함으로써 트립신을 멈춘다. 250 × g에서 5 분 동안 원심 분리기. 젤라틴 미리 코팅 된 플레이트 또는 플라스크에 문화를 계속합니다.

2. 특성

1. 문화 개 대동맥 내피 세포 (CnAOECs)와 현미경으로 두 번 주간 기본 및 상업 세포주의 형태를 비교합니다.
   참고 : T그 대표적인> 70 %의 컨 플루 언시에 도달 할 때 가장 잘 관찰 될 수있는 패치의 ECS에 패턴을 성장.
   1. 0.5 % W / V 젤라틴은 미리 코팅 T75 플라스크에 CECGM 문화 CnAOECs. 일주일에 한번 통과 셀 생장이 70 - 80 %.
      1. 계대를 들어, 미리 예열 HBSS 한 번 세포를 씻어 1 ml의 재조합 세포 분해 효소 (1 배)를 추가합니다. 5 분 동안 또는 모든 셀이 분리 될 때까지 다시 인큐베이터에서 플라스크를 놓습니다. 10 % FCS를 포함한 10 ㎖ 배지 (CEGM)을 첨가함으로써 트립신을 비활성화한다. 250 XG에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리하여 상등액을 버리고 1 ml의 배양 배지에서 세포를 재현 탁.
      2. 세포 현탁액의 10 μL 나누어지는을 가지고 1 희석 : 0.4 % 트리 판 블루로 1. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수 및 새로운 T75 플라스크에서 4.0 × 10 ⁵ 생세포를 접시. 5 % CO _2와 가습 분위기에서 37 ° C에서 플라스크와 문화에 미리 예열 CECGM의 10 ML을 추가합니다.
2. 배양 CaPECs 및 CnAOECs의 통과 일로부터 RNA를 분리합니다.
   1. , 펠릿 적어도 1 × ¹⁰³ 세포를 수집 시료 전처리 시약 (SPR)의 20 μL를 추가하고, 세포를 용균 1 분 동안 배양한다. 배양 후, 조심스럽게 -70 ℃에서 총 RNA 및 저장을 포함하는 세포 용 해물을 모은다.
3. 제조업체의 지시에 따르는 cDNA 합성 키트 (예를 들어, iScript)를 사용하여 cDNA를에 mRNA의 변환합니다. qPCR에를 수행 할 준비가 될 때까지 오랜 기간 동안 4 ° C 일주까지, 또는 -20 ° C에서의 저장소의 cDNA.
4. 내피 세포 원점을 확인하기 위해 내피 세포 마커 CD31의 유전자 발현을 측정한다. MIQE의 PRECIS 가이드 라인 ^(10)을 사용하여 실험 장치 및 정량화를 수행합니다. 정규화, 참조 GAPDH 유전자, RPS19 및 B2MG ^11의 발현을 측정한다.
   1. 뉴 클레아없는 물에서 얻어진 cDNA를 10 배 희석을 준비합니다.
   2. 준비표준 라인 풀링 된 cDNA 샘플로부터 4 배 희석하고 비 템플릿 대조군 클레아없는 물을 사용한다. qPCR의 반응에 대한 50 배의 총 희석 도달 샘플 다섯 배 희석. 4 ㎕의 cDNA를 역방향 및 정방향 프라이머 (표 1) 20 pmol의 혼합 형광 6 μl를 이용하여 384 웰 포맷에서 중복 피펫 10 μL 반응.
   3. 변성 95 ° C에서 10 초 39주기 다음 Taq 중합 효소 활성화를위한 5 분, 어닐링 및 신장을위한 Tm은 30 초 동안 95 ° C에 프로그램을 설정합니다. 각 프라이머 세트에 대한 Tm은 표 1에 나타낸다.
   4. 곡선을 용융 수행하는 증폭 단 하나의 제품을 보장하기 위해 모든 실행에 따라 분석한다. 참조 유전자의 상대적인 양을 평균하여 샘플의 발현 수준을 정상화하고, 반응 효율은 95 %와 105 % 사이 인 경우 ΔCT을 계산한다.
5. ANGI와 EC의 기능을 평가ogenesis 분석.
   1. 미리 냉각 된 혈관 슬라이드의 각 웰에 세포 외 기질의 10 μl를 첨가하고 잘의 표면을 덮도록 피펫 팁으로 확산. 얼음에 세포 외 매트릭스를 유지하고, 겔에 기포의 도입을 피한다. 30 분 동안 5 % CO _2, 37 ℃에서 항온 물로 적신 페이퍼 타월로 페트리 접시에 슬라이드를 배치하여 겔 고화.
   2. 1.0 × 10 ⁴ 차 추가 되는 EC 50 μl의 내피 성장 중간마다 잘. 5 % CO _2와 37 ° C에서 6 시간 동안 슬라이드를 품어.
   3. 6 시간 후 이미지의 전체도를 포함해야하고, 20 배 배율로 사진을 찍을.

결과

다른 혈관 성공적 설명 분리 프로토콜 (도 2)을 행 하였다. 해부하고 건강한 개에서 대동맥, 대정맥, 대정 간이 및 관상 동맥 반전 할 수 있었다 (각 개 모든 혈관을, N = 4). 같은 접근되는 EC는이 선천성 문맥 정맥 션트 (간외 및 간내, N = 1 각)에서 분리 하였다으로. 대동맥 쉽게 반전되었지만 대동맥 세그먼트 복부 대동맥 이상 도전했다. 흉부 세그먼트에서 대동?...

토론

송곳니되는 EC에 초점을 맞춘 연구에서 CnAOEC 기본 회선은 개 ^{3, 12, 13의} 내피 계통을 모델링하는 데 사용됩니다. 인간의 연구에서, HUVEC 문화는 여전히 황금 표준으로 간주됩니다. 분명히, 탯줄에서 파생되는 EC에 단지 집중하는 것은 심장 혈관 연구에서 확고한 제한입니다. 내피 세포는 동정맥 사양을 결정하는 특정 유전자의 발현 패턴을 갖는다. 생후 혈관 이러한 차이를 고려하기 위해, 우...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM (1x) + GlutaMAX	Life Technologies	31966-021
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-050
Canine Endothelial Cells Growth Medium	Cell Applications	Cn211-500
CnAOECs	Cell Applications	Cn304-05
Fetal Calf Serum (FCS)	GE Healthcare	16000-044
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013
SPR	Bio-Rad	170-8898
iScript synthesis kit	Bio-Rad	170-8891
SYBR green super mix	Bio-Rad	170-8886
Recovery Cell Freezing Medium	Gibco/Life Technologies	12648-010	Keep on ice prior to use
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)	B. Braun Medical	BC555R
Mosquito forceps	B. Braun Medical	FB440R
Mosquito forceps curved	B. Braun Medical	FB441R
polyglactin 3-0	Ethicon	VCP311H
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013
Automated counting chamber	Bio-Rad	145-0102
Counting Slides, Dual Chamber	Bio-Rad	145-0011
Matrigel	BD Biosciences	BD356231	Slowly thaw on ice
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	81501
Endothelial Growth Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit	Lonza	CC-4176