Isolement et culture de cellules endothéliales primaires de Artères Canine et Veins

Résumé

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Résumé

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Introduction

Les chiens sont utilisés comme modèle animal grande pour la recherche sur les maladies cardiovasculaires et peuvent également souffrir de innés (génétiques) anomalies vasculaires ^{1, 2.} Pour étudier ces maladies des lignées de cellules endothéliales commerciales sont souvent utilisés pour évaluer des cellules endothéliales (CE) fonctionnalité. Pour les chiens il y a une ligne de cellules endothéliales commerciale disponible (CnAOEC), dérivé de l'aorte canine. Cette lignée cellulaire est surtout utilisé dans les études comme témoin normal CEs ^3-5. Dans la recherche cardiovasculaire humain lignes de cellules endotheliales les plus couramment utilisées sont des cellules humaines endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) et ombilicale humaine Artère cellules endothéliales (HUAEC) provenant de la veine du cordon ombilical humain et de l'artère, respectivement. HUVEC ont été utilisés comme la norme d' or dans la recherche vasculaire depuis les années 1980 ^6. Ils sont considérés comme le système de modèle classique pour étudier la fonction endothéliale et de l'adaptation de la maladie. Les cellules endothéliales isolées à partir de différents vaisseaux sanguins varient en appearance et la fonctionnalité en raison de fond génétique et l' exposition au microenvironnement ^7. En outre, HUVEC et HUAEC sont dérivées du cordon ombilical, une structure vasculaire de développement qui pourraient ne pas pleinement imiter les vaisseaux sanguins des adultes par rapport aux conditions qu'ils sont exposés à et de la réponse à la maladie. Par conséquent, la traduction des résultats trouvés dans HUVEC et HUAEC aux maladies cardiovasculaires en général est insuffisant.

Lorsque l'on étudie l'adaptation et le comportement des adultes CEs, CEs primaires du navire d'intérêt devrait être utilisé comme une approche plus directe. Pour isoler ces cellules, plusieurs procédés ont été rapportés. Un procédé largement décrit, qui est également utilisé pour HUVEC, est le rinçage de la cuve avec une solution de digestion enzymatique ^8. Il en résulte souvent une contamination par des non telles que les cellules endothéliales et les fibroblastes ⁹ musculaires lisses. Une autre méthode fréquemment utilisée pour l'isolement est la digestion enzymatique du tissu de vaisseau émincé suivie par fluorescencetri des cellules activées (FACS) en fonction endothéliale Cluster marqueur de cellules de différenciation (CD) , 31 ^{7, 8.} tri FACS et la culture cellulaire ultérieure exige des quantités relativement importantes de cellules et ne convient donc pas pour l'isolement de l' endothélium des petits vaisseaux sanguins. Nous avons donc cherché à mettre au point une nouvelle méthode robuste pour isoler une population de cellules endothéliales pur à partir de divers vaisseaux sanguins canine avec une grande pureté. Pour tester l'efficacité de la nouvelle méthode d'isolement, nous avons isolé et obtenu Canine endothéliale primaire cellulaire (CAPEC) des cultures pures de différentes artères et les veines canines, grandes et petites. Ce procédé permet également la culture des cellules endothéliales provenant de malades et / ou des vaisseaux aberrants tels que des shunts portosystémiques intra ou extra-hépatiques congénitaux, une maladie courante chez les chiens ^2. Le procédé permet l'isolement de types cellulaires appropriés supplémentaires du même navire, tels que des cellules musculaires lisses vasculaires, puisque la majeure partie du bateau reste intagir au cours de la procédure.

Protocole

Éthique déclaration: Les vaisseaux sanguins utilisés dans cette étude ont été récoltées en tant que matériau de surplus obtenu à partir de cadavres frais canins (n ​​= 4) des chiens en bonne santé euthanasiés pour d'autres recherches sans rapport (politique de l'Université 3R). vaisseaux sanguins aberrants (shunts portosystémiques intra- et extrahépatiques, n = 1 chacun) ont été récoltées post-mortem après le consentement éclairé des propriétaires de chiens présentés à la clinique universitaire pour les animaux de compagnie de l'Université d'Utrecht.

1. Isolement et culture de cellules primaires Canine endothéliales

1. Pré-manteau des plaques 6 puits avec 2 ml / puits de 0,5% p / v de gélatine et laisser reposer pendant 2 h dans un incubateur avec une atmosphère humidifiée de 5% de CO ₂ à 37 ° C. Retirer la solution de gélatine en excès avant l'ensemencement des cellules primaires.
2. Retirer aseptique du vaisseau sanguin (s) d'intérêt (par exemple, l' aorte, la veine cave, la veine porte) à partir d' une nouvelle canine cadaver (figure 1A). Maintenir l'anatomie du système de récipienten plaçant une pince droite sur les deux extrémités du vaisseau d'intérêt. Éviter des manipulations inutiles du tissu avec une pince pour éviter tout dommage aux cellules endothéliales.
   1. Couper le récipient serré sur les deux extrémités avec des ciseaux chirurgicaux et retirer du cadavre. Transport en solution saline équilibrée de Hank (HBSS) sur la glace.
      NOTE: Une longueur du navire d'environ 5 cm est préférée pour cette procédure, mais ceux qui mesurent 1 cm également fournir suffisamment de cellules à la culture.
3. Transférer le vaisseau sanguin dans une boîte de Pétri remplie de HBSS glacé. Avec des ciseaux chirurgicaux, enlever tous les tissus et la graisse adhérente de l'extérieur du navire, en gardant le navire lui - même intacte (figure 1B). Assurez-vous que le navire est clairement visible en tout temps lors de la coupe: tirez de côté le tissu environnant avec une pince ou une pince pour une vue optimale.
   1. Fermez toutes les branches de la cuve avec ligatures (par exemple, polyglactine 3-0) et retirer ensuite lesavec des ciseaux chirurgicaux ou un scalpel.
4. Entrez soigneusement une extrémité de l' enceinte avec un incurvées pince mosquito Halsted, serrer la pointe de la pince à l'autre extrémité de la cuve, puis se rétracter, inverser lentement le navire jusqu'à ce qu'il soit complètement à l' intérieur (Figure 1C-G). L'extérieur se compose désormais de la couche de cellules endothéliales. Si une difficulté est rencontrée lors de l'inversion du navire, plonger dans HBSS à nouveau pour réduire la friction.
5. Placer des sutures cordon de bourse aux deux extrémités de la cuve pour la fermer complètement , et pour empêcher l' exposition d'un tissu vasculaire non endothelial à la procédure de digestion (figure 1H). Utilisez les extrémités ligatures pour manipuler le récipient inversé.
6. Si la digestion et la culture est réalisée plus tard, le récipient renversé cryoconservation avant le protocole de digestion (étape 1.7).
   1. Placer le récipient inversé dans un cryovial et remplir avec la culture cellulaire milieu de congélation. Le gel jusqu'à -80 ° C en utilisant un gel container. Conserver à -80 ° C si les navires doivent être utilisés dans une semaine. Pour le stockage à long terme, le lieu cryovials à -180 ° C. Lors de l'isolement CE, dégeler les cryotubes rapidement dans un bain d'eau (37 ° C) et placer immédiatement glacée HBSS. Procéder comme indiqué en 1.7.
      NOTE: Prendre en compte que le rendement total de CEs après isolement sera moindre en raison de la perte de viabilité pendant le processus de congélation.
7. Transférer le navire vers un tube de 50 ml et rincer deux fois dans HBSS pour éliminer les érythrocytes (ou milieu de congélation résiduelle en cas de dégel) (Figure 1I).
8. Digérer le récipient dans un tube de 50 ml avec une solution de 30 ml de collagénase de type II (0,15 U / ml) et la dispase (0,15 U / ml) dans des cellules canines Endothelial Growth Medium (CECGM) pendant 1 heure à 37 ° C avec intermittente en douceur agitation.
9. Retirez le récipient du tube et centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 250 x g.
10. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un CECGMnd semences 2 suspension de cellules ml par puits (1 - 3 puits en fonction de la taille du navire). Culture des cellules à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO ₂ dans l' air et changer le milieu de culture deux fois par semaine.
11. Passage des cellules quand une confluence de 70 - 80% est atteint.
    1. Laver les cellules avec pré-chauffé HBSS pour éliminer les cellules mortes ou non-inscrits. Ajouter 200 ul enzyme de dissociation de cellules recombinant (1x) à chaque puits et placer dans l'incubateur pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que toutes les cellules sont détachées.
    2. Transférer les cellules à un tube de 15 ml et arrêter trypsinisation en ajoutant 10 ml de milieux de culture (CEGM) dont 10% de sérum de veau fœtal (FCS). Centrifuger pendant 5 min à 250 x g. Continuer la culture dans une plaque ou un flacon de gélatine pré-enduit.

2. Caractérisation

1. Culture des cellules endothéliales aortiques Canine (CnAOECs) et comparer la morphologie des lignes primaires et commerciales cellulaires deux fois par semaine avec un microscope.
   NOTE: Til de plus en plus typique modèle de CEs en plaques peut être mieux observé quand une confluence de> 70% est atteint.
   1. La culture dans CnAOECs CECGM sur un flacon T75 0,5% en poids / volume de gélatine pré-revêtue. cellules Passage une fois par semaine lorsque la confluence est de 70 - 80%.
      1. Pour repiquage, laver les cellules une fois avec HBSS préchauffé et ajouter 1 ml d'enzyme de dissociation de cellules recombinant (1x). Placer le ballon dans l'incubateur pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que toutes les cellules sont détachées. Inactiver trypsine en ajoutant un milieu de culture de 10 ml (CEGM) dont 10% de FCS. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 250 x g, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu de culture.
      2. Prélever une partie aliquote de 10 ul de la suspension cellulaire et on dilue 1: 1 avec 0,4% de bleu trypan. Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatisé et la plaque à 4,0 x 10 ⁵ cellules viables dans un nouveau flacon T75. Ajouter 10 ml de pré-chauffé CECGM dans le ballon et la culture à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO _2.
2. Isoler ARN du passage 1 des CAPEC cultivées et CnAOECs.
   1. Collecter au moins 1 x 10 ³ cellules sous forme d' une pastille, ajouter 20 ul de réactif de préparation de l' échantillon (SPR) et incuber pendant 1 min pour lyser les cellules. Après incubation, recueillir soigneusement le lysat cellulaire contenant l'ARN total et conserver à -70 ° C.
3. Convertir l' ARNm en ADNc en utilisant un kit de synthèse d'ADNc (par exemple, iScript) en suivant les instructions du fabricant. ADNc de magasin à 4 ° C jusqu'à une semaine, ou à -20 ° C pour le long terme avant d'être prêt à effectuer la qPCR.
4. Mesurer l'expression du gène du marqueur CD31 endothéliale pour confirmer l'origine des cellules endothéliales. Effectuez la configuration expérimentale et la quantification en utilisant les lignes directrices PRECIS MIQE ^10. Pour la normalisation, mesurer l' expression des gènes de référence GAPDH, RPS19 et B2MG ^11.
   1. Préparer une dilution de 10 fois de l'ADNc obtenu dans l'eau sans nucléase.
   2. Préparerune dilution de 4 fois à partir d'échantillons d'ADNc mis en commun pour la ligne standard et utiliser l'eau sans nucléase comme un contrôle non-modèle. Diluer les échantillons de cinq fois pour atteindre une dilution totale de 50 fois pour les réactions de qPCR. Introduire à la pipette 10 ul de réactions en double dans un format de 384 puits avec 4 ul d' ADNc et 6 pi du fluorophore mélangé avec 20 pmol d'amorce inverse et vers l' avant (tableau 1).
   3. Définir le programme à 95 ° C pendant 5 minutes pour l'activation de la polymérase Taq, suivie par 39 cycles de 10 s à 95 ° C pour la dénaturation et 30 secondes à Tm pour l'hybridation et l'allongement. La Tm pour chaque jeu d' amorces est indiquée dans le tableau 1.
   4. Effectuer la courbe de fusion analyse après chaque course pour assurer un seul produit est amplifié. Normaliser les niveaux des échantillons en utilisant la quantité relative moyenne des gènes de référence d'expression, et calculer la ACt si l'efficacité de la réaction se situe entre 95% et 105%.
5. Évaluer la fonctionnalité CE avec un angiogenesis dosage.
   1. Ajouter 10 ul de matrice extracellulaire à chaque puits d'une lame pré-refroidi l'angiogenèse et la propagation avec une pointe de pipette pour couvrir la surface du puits. Gardez la matrice extracellulaire sur la glace et éviter l'introduction de bulles d'air dans le gel. Solidifier le gel en plaçant la lame dans une boîte de Pétri avec du papier absorbant imbibé d'eau dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant 30 min.
   2. Ajouter 1,0 x 10 ⁴ primaire CEs dans 50 pl de croissance endothélial moyenne par puits. Incuber la lame pendant 6 heures à 37 ° C avec 5% de CO _2.
   3. Après 6 h de prendre des photos avec un grossissement 20X, en veillant à inclure l'ensemble bien dans l'image.

Résultats

Les vaisseaux sanguins différents ont été soumis avec succès au protocole d'isolement décrit (figure 2). Il était possible de disséquer et inverser l'aorte, la veine cave, la veine porte et l'artère coronaire des chiens en bonne santé (tous les navires de chaque chien, n = 4). Avec les mêmes CEs d'approche ont été isolés à partir de deux shunts portosystémiques congénitales (extrahépatique et intrahépatique, n = 1 chacun). Bien que l'...

Discussion

Dans les études portant sur canine CEs la ligne primaire CnAOEC est utilisé pour modéliser les lignées endothéliales du chien ^{3, 12, 13.} Dans les études humaines, la culture HUVEC est toujours considéré comme l'étalon-or. De toute évidence, en se concentrant uniquement sur CEs dérivées du cordon ombilical est une restriction ferme dans la recherche cardiovasculaire. Les cellules endothéliales ont un profil d'expression génique spécifique déterminant la spécification artérioveineuse. ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM (1x) + GlutaMAX	Life Technologies	31966-021
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-050
Canine Endothelial Cells Growth Medium	Cell Applications	Cn211-500
CnAOECs	Cell Applications	Cn304-05
Fetal Calf Serum (FCS)	GE Healthcare	16000-044
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013
SPR	Bio-Rad	170-8898
iScript synthesis kit	Bio-Rad	170-8891
SYBR green super mix	Bio-Rad	170-8886
Recovery Cell Freezing Medium	Gibco/Life Technologies	12648-010	Keep on ice prior to use
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)	B. Braun Medical	BC555R
Mosquito forceps	B. Braun Medical	FB440R
Mosquito forceps curved	B. Braun Medical	FB441R
polyglactin 3-0	Ethicon	VCP311H
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013
Automated counting chamber	Bio-Rad	145-0102
Counting Slides, Dual Chamber	Bio-Rad	145-0011
Matrigel	BD Biosciences	BD356231	Slowly thaw on ice
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	81501
Endothelial Growth Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit	Lonza	CC-4176