Isolamento e cultura de células endoteliais primárias de Artérias e Veias canina

Resumo

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Resumo

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Introdução

Cães são usados como modelo animal grande para a pesquisa da doença cardiovascular e também podem sofrer de anormalidades vasculares (genéticas) inatos ^{1, 2.} Para estudar estas doenças linhas de células endoteliais comerciais são muitas vezes utilizados para avaliar a funcionalidade das células endoteliais (CE). Para os cães que há uma linha de células endoteliais comercial disponível (CnAOEC), derivadas da aorta canino. Esta linha celular é usado principalmente em estudos como controlo normal ECs ^3-5. Na pesquisa cardiovascular humano as linhas de células endoteliais mais utilizados são células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e umbilical humano, Artéria células endoteliais (HUAECs) derivados da veia do cordão umbilical humano e artéria, respectivamente. HUVECs foram usados como o padrão de ouro na pesquisa vascular desde a década de 1980 ^6. Eles são considerados como sendo o sistema de modelo clássico para estudar a função endotelial e doença de adaptação. As células endoteliais isoladas a partir de diferentes vasos sanguíneos variam em appearance e funcionalidade devido às características genéticas e exposição ao microambiente ^7. Além disso, células HUVEC e HUAECs são derivados a partir do cordão umbilical, uma estrutura vascular do desenvolvimento que não pode vasos sanguíneos adulto totalmente mímica com respeito às condições a que estão expostos e resposta à doença. Assim, traduzindo resultados encontrados em HUVECs e HUAECs a doenças cardiovasculares, em geral, é inadequada.

Ao estudar a adaptação e comportamento do adulto ECs, ECs primários do vaso de interesse deve ser usado como uma abordagem mais direta. Para isolar estas células, vários métodos têm sido relatados. Um método amplamente descrito, que também é usada para HUVEC, é a lavagem do recipiente com uma solução de digestão enzimática ^8. Isto muitas vezes resulta na contaminação com não-CEs, tais como células de músculo liso e de fibroblastos ^9. Outro método frequentemente utilizado para o isolamento é a digestão enzimática do tecido navio picada seguido por fluorescence-de células activadas (FACS) com base no marcador de células endoteliais de Cluster de diferenciação (CD) 31 ^{7, 8.} separação por FACS e cultura de células subsequente requer quantidades relativamente grandes de células e, portanto, não é apropriado para o isolamento do endotélio de pequenos vasos sanguíneos. Por conseguinte, objectivo desenvolver um novo método robusto para isolamento de uma população pura de células endoteliais a partir de vários vasos sanguíneos caninos com elevado grau de pureza. Para testar a eficiência do novo método de isolamento, foram isoladas e obteve culturas puras Canine primária de células endoteliais (Capec) de diferentes artérias caninas e veias, grandes e pequenas. Este método também permite a cultura de células endoteliais provenientes do doente e / ou vasos aberrantes, tais como desvios portossistêmicos intra ou extra-hepáticas inatos, uma doença comum em cães ^2. O método permite o isolamento de tipos de células relevantes adicionais do mesmo recipiente, tais como as células do músculo liso vascular, uma vez mais da embarcação permanece intagir durante o procedimento.

Protocolo

Ética declaração: Os vasos sanguíneos utilizados neste estudo foram colhidas como material excedente obtido a partir de cadáveres caninos frescos (n = 4) a partir de cães saudáveis ​​sacrificados para outras pesquisas independentes (a política Universidade 3R). vasos sanguíneos anormais (desvios portossistêmicos intra e extra-hepáticos, n = 1 cada) foram colhidas post-mortem após consentimento informado dos proprietários de cães apresentados com a Clínica Universitária de Animais de Companhia da Universidade de Utrecht.

1. Isolamento e Cultura de pilhas Canine endoteliais

1. Pré-revestir placas de 6 cavidades com 2 ml / poço de 0,5% w / v de gelatina e deixar durante 2 horas num incubador com uma atmosfera humidif içada de 5% de _CO2 a 37 ° C. Remova o excesso de solução de gelatina antes de semear as células primárias.
2. Assepticamente remover do vaso sanguíneo (s) de interesse (por exemplo, da aorta, da veia cava, da veia porta) a partir de um cadáver fresco canino (Figura 1A). Manter a anatomia do sistema de vasoscolocando fórceps rectas em ambas as extremidades do vaso de interesse. Evitar a manipulação desnecessária do tecido com uma pinça para evitar danos nas células endoteliais.
   1. Cortar o navio fixada em ambas as extremidades com tesouras cirúrgicas e remover a partir do cadáver. Transporte em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) em gelo.
      NOTA: Um comprimento do vaso de cerca de 5 cm é preferida para este procedimento, mas aqueles que medem 1 cm também proporcionará número suficiente de células para a cultura.
3. Transferir o vaso sanguíneo para uma placa de Petri cheio com HBSS arrefecida em gelo. Utilizando uma tesoura cirúrgica, remover todo o tecido aderente e gordura a partir do exterior do recipiente, mantendo o vaso em si intacta (Figura 1B). Certifique-se o navio está claramente visível em todos os momentos durante o corte: puxe de lado o tecido circundante com uma pinça ou fórceps para visualização ideal.
   1. Feche todos os ramos do navio com ligaduras (por exemplo, poliglactina 3-0) e, posteriormente, removê-loscom tesoura cirúrgica ou bisturi.
4. Cuidadosamente inserir uma extremidade navio com um fórceps curvo mosquito Halsted, prender a ponta do fórceps, na outra extremidade do recipiente e, em seguida, retrai, lentamente, invertendo o recipiente, até que esteja completamente dentro para fora (Figura 1C-G). O exterior consiste agora a camada de células endoteliais. Se alguma dificuldade é encontrada em cima invertendo a embarcação, submergir em HBSS novamente para reduzir o atrito.
5. Coloque suturas em bolsa de nas duas extremidades do recipiente para o fechar completamente e para evitar a exposição de qualquer tecido vascular endotelial não para o procedimento de digestão (Figura 1H). Use as pontas da ligadura para manipular o recipiente invertido.
6. Se a digestão e a cultura é realizada mais tarde, o navio de criopreservar invertida antes da digestão protocolo (passo 1.7).
   1. Colocar o recipiente invertido num criotubo e encher com meio de cultura de células de congelação. Congelamento até -80 ° C utilizando um co congelaçãontainer. Armazenar a -80 ° C, se os recipientes forem para ser usado no prazo de uma semana. Para armazenamento a longo prazo, cryovials lugar a -180 ° C. Ao realizar o isolamento CE, descongelar as criotubos rapidamente num banho de água (37 ° C) e colocar imediatamente em HBSS arrefecido com gelo. Prosseguir como indicado em 1.7.
      NOTA: Ter em conta que o rendimento total de ECs após o isolamento será menor devido à perda de viabilidade durante o processo de congelamento.
7. Transferir o navio para um tubo de 50 ml e lave-o duas vezes em HBSS para remover os eritrócitos (ou meio de congelamento residual em caso de degelo) (Figura 1I).
8. Digerir o recipiente em um tubo de 50 ml com uma solução de 30 mL de colagenase tipo II (0,15 U / ml) e dispase (0,15 U / ml) em células caninas endoteliais Meio de Crescimento (CECGM) durante 1 h a 37 ° C com suave intermitente agitação.
9. Retirar o recipiente do tubo e centrifuga-se a suspensão de células durante 5 min a 250 x g.
10. Ressuspender o sedimento de células em um CECGMND semente 2 ml de suspensão de células por poço (1 - 3 poços dependendo do tamanho do recipiente). Cultura das células a 37 ° C em uma atmosfera humidificada com 5% de CO ₂ em ar e alterar o meio de cultura duas vezes por semana.
11. A passagem das células quando uma confluência de 70-80% é atingido.
    1. Lavam-se as células com HBSS pré-aquecido para remover células mortas ou não-ligados. Adicionou-se 200 células-enzima recombinante dissociação ul (1x) a cada poço e colocar de volta na incubadora durante 5 min ou até que todas as células são separadas.
    2. Transferir as células para um tubo de 15 ml e parar tripsinização adicionando 10 ml de meio de cultura (CEGM) incluindo 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS). Centrifugar durante 5 minutos a 250 x g. Continuar a cultura numa placa pré-revestida de gelatina ou balão.

2. Caracterização

1. Culturas células caninas aórtica endoteliais (CnAOECs) e comparar a morfologia das linhas celulares primárias e comerciais, duas vezes por semana com um microscópio.
   NOTA: Tele típica crescente padrão de ECs em manchas pode ser melhor observado quando uma confluência de> 70% é atingido.
   1. Cultura CnAOECs em CECGM em um frasco T75 0,5% w / v de gelatina, pré-revestido. células de passagem, uma vez por semana, quando a confluência é de 70 - 80%.
      1. Para Passaging, lave as células uma vez com HBSS pré-aquecido e adicionar 1 ml de enzima celular recombinante de dissociação (1x). Colocar o balão de volta na incubadora durante 5 min ou até que todas as células são separadas. Inactivar a tripsina por adição de meio de cultura de 10 ml (CEGM) incluindo 10% de FCS. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 250 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura de 1 ml.
      2. Tomar uma aliquota de 10 uL da suspensão de células e diluir 1: 1 com 0,4% de azul de tripano. Contar as células utilizando um contador de células automatizado, e placa para 4,0 x 10 ⁵ células viáveis em um novo frasco T75. Adicionar 10 ml de CECGM pré-aqueceu-se ao balão e cultura a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO _2.
2. Isolar RNA de passagem 1 dos CaPECs cultivadas e CnAOECs.
   1. Recolher pelo menos 1 x 10 ³ células como um sedimento, adicionar 20 ul de reagente de preparação da amostra (SPR) e incubar durante 1 min para lisar as células. Após a incubação, recolher cuidadosamente o lisado celular contendo o ARN total e armazenar a -70 ° C.
3. Converter o ARNm em ADNc utilizando um kit de síntese de ADNc (por exemplo, iScript) seguindo as instruções do fabricante. ADNc Armazenar a 4 ° C até uma semana, ou a -20 ° C durante a longo prazo até estar pronto para executar o qPCR.
4. Medir a expressão do gene do marcador endotelial CD31 para confirmar a origem das células endoteliais. Faça a configuração experimental e quantificação utilizando as diretrizes Precis MIQE ^10. Para a normalização, medir a expressão de genes de referência GAPDH, RPS19 e B2MG ^11.
   1. Prepara-se uma diluição de 10 vezes do ADNc obtido em água isenta de nuclease.
   2. Prepararuma diluição de 4 vezes a partir de amostras de cDNA reunidos para a linha de padrão e usar a água livre de nuclease, como um controlo não-molde. Dilui-se as amostras cinco vezes para obter um total de diluição de 50 vezes para as reacções qPCR. Pipetar 10 ul reacções em duplicado em um formato de 384 poços utilizando 4 ul de cDNA e 6 uL do fluoróforo misturada com 20 pmol de iniciador directo e inverso (Tabela 1).
   3. Definir o programa a 95 ° C durante 5 min para a activação da polimerase Taq, seguido por 39 ciclos de 10 seg a 95 ° C para desnaturação, 30 segundos e a Tm para o emparelhamento e alongamento. A Tm para cada conjunto de iniciadores está mostrado na Tabela 1.
   4. Executar derretendo curva analisa a seguir a cada corrida para garantir que apenas um produto é amplificado. Normalizar os níveis das amostras utilizando o valor médio relativo dos genes de referência da expressão, e calcular a eficiência da reacção ΔCt se estiver compreendida entre 95% e 105%.
5. Avaliar a funcionalidade CE, com um angiensaio ogenesis.
   1. Adicionar 10 ul de matriz extracelular em cada cavidade de uma lâmina pré-arrefecida a angiogénese e espalhar com uma ponta de pipeta para cobrir a superfície do poço. Manter a matriz extracelular em gelo e evitar a introdução de bolhas de ar no gel. Solidificar o gel, colocando a lâmina numa placa de Petri com água embebido toalhas de papel numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 30 min.
   2. Adicionar 1,0 x 10 ⁴ primário ECs em 50 ul de Crescimento Endotelial de meio por poço. Incubar a lâmina durante 6 h a 37 ° C com 5% de CO _2.
   3. Após 6 horas tirar fotografias com uma ampliação de 20X, certificando-se de incluir todo o bem na imagem.

Resultados

Vasos sanguíneos diferentes foram submetidas com sucesso para o protocolo de isolamento descrito (Figura 2). Foi possível dissecar e inverter aorta, veia cava, veia porta e artéria coronária em cães saudáveis ​​(todos os vasos de cada cão, n = 4). Com os mesmos ECs abordagem foram isolados a partir de dois desvios portossistêmicos congênitos (extra-hepáticas e intra-hepática, n = 1 cada). Embora aorta foi facilmente invertida, segmentos da aorta torácica ...

Discussão

Em estudos com foco em ECs canino a linha primária CnAOEC é usado para modelar as linhagens endoteliais do cão ^{3, 12, 13.} Em estudos humanos, a cultura HUVEC ainda é considerada o padrão-ouro. Claramente, concentrando-se apenas em ECs derivadas do cordão umbilical é uma restrição firme na investigação cardiovascular. As células endoteliais têm um padrão de expressão de genes específicos de determinar especificação arteriovenosa. A fim de levar em conta essas diferenças nos vasos pós-natal ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM (1x) + GlutaMAX	Life Technologies	31966-021
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-050
Canine Endothelial Cells Growth Medium	Cell Applications	Cn211-500
CnAOECs	Cell Applications	Cn304-05
Fetal Calf Serum (FCS)	GE Healthcare	16000-044
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013
SPR	Bio-Rad	170-8898
iScript synthesis kit	Bio-Rad	170-8891
SYBR green super mix	Bio-Rad	170-8886
Recovery Cell Freezing Medium	Gibco/Life Technologies	12648-010	Keep on ice prior to use
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)	B. Braun Medical	BC555R
Mosquito forceps	B. Braun Medical	FB440R
Mosquito forceps curved	B. Braun Medical	FB441R
polyglactin 3-0	Ethicon	VCP311H
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013
Automated counting chamber	Bio-Rad	145-0102
Counting Slides, Dual Chamber	Bio-Rad	145-0011
Matrigel	BD Biosciences	BD356231	Slowly thaw on ice
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	81501
Endothelial Growth Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit	Lonza	CC-4176