局部场荧光显微镜:成像在完整的心蜂窝信号

摘要

在心脏，分子事件坐标器官的电气和收缩功能。一套这里提出局域场荧光显微镜技术能使在完整的心中蜂窝变量的记录。识别定义心脏功能的机制是关键了解的心脏在病理情况下是如何工作的。

摘要

在心脏，分子信号研究在离体心肌细胞通常执行。然而，许多如局部缺血和心律失常病理情况只能完全在整个器官水平的理解。在这里，我们提出局域场荧光显微镜（LFFM）的光谱技术，允许在完整心脏细胞信号的测量。该技术是基于一个的Langendorff灌注的心脏和光纤，记录荧光信号的组合。 LFFM在心血管生理学领域的各种应用研究正常和病理条件下的心脏。多个心肌变量可以使用不同的荧光指标进行监测。这些措施包括细胞内钙^离子浓度 ，内肌浆网^内钙和膜电位。外源荧光探针很高兴与LFFM落射荧光技术的三种不同的安排检测发出的荧光■在本文提出。这些技术中的中心差异是用于激励和激励光进行调制的方式的光源的类型。脉冲LFFM（PLFFM）采用激光光脉冲，同时连续波LFFM（CLFFM）使用连续激光激发。最后，发光二极管（LED）被用作第三光源。该非相干安排被称为脉冲LED荧光显微镜（PLEDFM）。

引言

心脏是心血管系统的中央机关。心脏的收缩是由细胞内增加钙^离子浓度开始。在细胞内Ca ²⁺释放电兴奋和变化之间的关系已经在历史研究了酶促解离的细胞^1,2。然而，心脏细胞电，代谢和机械地联接^3,4。当隔离，肌细胞不仅是身体上脱开，但是从不同层细胞的解离⁵中混合。此外，尽管已经从分离细胞的研究中出现电压钳条件下的巨大优势^，6，7，8心脏的内在性质为电合胞体ALWAYS构成如何功能不同的是从那些存在于组织³解离的细胞的问题。

在这个手稿中，我们描述了在完整的心脏采用局部场荧光显微镜（LFFM）技术在心脏生理知识获得的进步。 LFFM使用荧光指标来衡量多种生理变量，如细胞内钙^离子 ，内肌质网（SR） ^钙和膜电位。这些测量可以同时并结合心室压^9,10，心电图^9，电气动作电位（AP）的，离子电流的录音和笼化合物⁴的闪光光解^，11来获得。此外，这些测量可以通过在更高的频率接近起搏完整心脏得到R以生理率。尽管一些文章^{9，11，12，13，14}已使用LFFM技术我们集团公布，技术与该技术相关的复杂的推定阻止在心脏和其他器官研究体外生理现象它的大规模使用。

所述LFFM技术（ 图1）是基于使用在与组织接触的多模光纤获得萤光测量。像任何接触荧光成像技术，光学分辨率取决于直径和光纤的数值孔径（NA）。光纤的较高NA和较小直径将增加测量的空间分辨率。的NA和纤维直径的范围可以从0.22至0.66，并从50微米至1毫米。在压痕的NA将通过接受从较大的立体角到达光子提高信噪比（S / N）。为了充当萤光设备中，光束被聚焦到光纤用的非球面透镜或落射荧光物镜，其中透镜的NA和光纤匹配。该匹配最大化为激励和用于收集回由荧光团发射的光子的能量传递。

为了激发在组织中加载的外源性荧光指示器，不同的光源和照明模式都可以被利用。我们使用脉冲局部场荧光显微镜^{3，12（PLFFM）}开拓性的研究中采用的低成本皮秒激光器（ 图1a，PLFFM）。这种类型的光源的具有照明区域下荧光团分子的激发大级分的巨大优势，而基本上不漂白由于染料以短脉冲持续时间^12。此外，使用超短脉冲的允许的染料¹²的荧光寿命的评估。荧光寿命是可用于量化绑定到^的 Ca ²⁺染料分子的分数属性。不幸的是，从脉冲到脉冲的脉冲和变化的幅度的时间抖动限制本实验策略来的情况下通过配体结合到染料产生的荧光变化是大的应用程序。

连续波（CW）激光器通常用作LFFM（ 图1b，CLFFM）的主要照明源。激光束可以连续照亮组织或可以ferroelectrically调制。的光束的强电介质调制让光微秒脉冲的产生。这种调制可以通过外部硬件进行控制。这个过程不仅极大地降低了Ť他光脉冲的时间抖动也可以让混合不同波长的光束。束的混合是通过从不同的激光器多路复用射线进行。其结果是，具有不同的光谱特性的多个染料可兴奋来执行的各种生理变量的测量，例如，RHOD-2细胞内的Ca ^{2+，MagFluo4}帧内-SR ^的 Ca ²⁺和二-8- ANEPPS为膜电位。

尽管激光器本各种优点如LFFM光源，其它类型的光源可以使用，包括发光二极管（LED）。在这种情况下，激励光源组成的InGaN LED（ 图1c，PLEDFM）的。在发光二极管中，当从导带的电子与价带中空穴复合光子自发发射。与固态激光器的区别在于，发射不被其他光子激发。这导致了非相干光束和LED的更宽的光谱发射。

可用于不同类型的高功率LED。对于AP的记录用迪-8- ANEPPS和钙使用的Fluo-4或幅度-的Fluo-4，我们使用了在485纳米（蓝）和20nm的半值宽度具有典型的峰值发射的LED记录²⁺瞬变（ 图1d）。对于记录有RHOD-2 ^的 Ca ²⁺瞬变，该LED在540nm（绿色）和35纳米（ 图1d）的半高宽了一个典型的峰值发射。 LED发出的波长频段，因此需要过滤器来缩小他们的光谱发射。另外，可在1.6千赫为20微秒的持续时间的比率来产生脉冲光。这些LED用一个快速的功率MOSFET场效应晶体管脉冲。同时进行的录像用不同的指标可通过时分复用的指示灯来执行。不幸的是，由LED发射的光更难以集中到光纤相比的激光束。因此，我们的主要缺点ING的LED是，它们的发射轮廓具有从主轴线的角位移（±15°），和一个辅助光学必须使用纠正它。

在所有先前描述的光学结构中，激发光被反射用的分色镜的帮助。光束随后通过非球面透镜和一个显微镜物镜上被定位在组织中的多模光纤聚焦。正如在任何萤光布置中，分色镜还用于激励从所发射的光中分离出来。所发出的光频谱旅行回到通过屏障过滤器，以消除任何反射的激发。最后，发射的光与目标聚焦到光检测器（ 图1）。

从光到电的电流的传导是由硅雪崩光电二极管进行。这些二极管具有快速响应和高灵敏度，允许低光检测。该由雪崩光电二极管产生的光电流可以用两种方法来扩增:具有跨阻抗放大器的电阻反馈元件（ 图1E）或通过积分将电流转换成电压（ 图1F）。使用第一种方式，输出电压正比于光电流和反馈电阻。电阻检测皮秒激光脉冲的一个典型的例子示于图2a，2b和2c。面板2a示出了跨阻放大器的输出和面板2b示出了具有一个星号（*）指示的时间间隔的一个时间扩展。峰值跟踪算法被实施以检测荧光反应¹²峰（红色）和底座（绿色）。碱荧光的测量提供了受环境韧带引入两个雪崩光电二极管的暗电流和干扰的信息HT和电磁耦合。峰和碱的表示示于图2c中。该图中示出了由打浆鹦鹉心脏的心动周期中结合到^钙染料（RHOD-2）发出的荧光。

在第二种方法中，积分器的输出电压是电流和电容反馈的函数（ 图2d，2e和2f）的 。 图2F示出了两个连续的积分周期:第一，没有外部照明和所述第二带从一个脉冲的LED施加的光脉冲。的详细描述示于图2g和2小时 。这种方法，虽然更费力，提供了一个较大的S / N由于没有在反馈电容器热噪声。仪器包括产生激发光的所有的控制和多路复用并命令探头整合和水库的定时阶段等周期。这通常是用一个数字信号处理电路，还通过计算数据的一个在线回归进行综合输出信号的数字分化进行。在使用电阻反馈的情况下，可使用任何A / D采集板。

最后，我们的LFFM技术是高度通用的，并且可以适合于从一个以上的区域进行记录。在光路中加入一光束分离器可以使我们的光分成两个光纤。然后各光纤可以被放置在一个组织，以独立地，激发并从外源荧光探针记录发射的不同区域。这一修改使我们能够评估区域如何解剖学上的差异影响生理变量。 图3示出一个分束器所采用分裂，使得两个光纤被用来测量透电或细胞内的CW激发光的[Ca ^2+]的水平机智^ h轻微的侵入性。透的信号可以通过将在内膜一种纤维和其它心室壁的外膜层上进行记录。因此，LFFM技术具有以测量蜂窝信号的不同区域的时间过程的能力，并且可以使用，如果在病理情况下发生的区域的变化进行测试。

研究方案

该协议并且所有小鼠处理批准了加州大学默塞德机构动物护理和使用委员会（编号2008-201）。与鹦鹉实验于1999年根据由委内瑞拉科学研究所（IVIC）的科学委员会设立动物使用一般政策进行的。

1.的Langendorff成立准备

1. 制备的台罗德氏溶液含有以mM以下溶质浓度:140的NaCl，5.4氯化钾，2的CaCl _2，1 MgCl ₂的，0.33 _的 Na ₂ HPO _4，10葡萄糖，10 HEPES。调整台罗德氏溶液，以7.4用NaOH的pH值和过滤通过0.22微米的过滤器将溶液。
2. 装载台氏溶液到60毫升的注射器和设置在图4所示^11，12中的水平的Langendorff的所有管道。确保消除所有气泡。
3. 下平衡的Tyrode溶液用100％O ₂的用浸没塑料"空气石"，如图4所示。
   1. 塑料管连接到O ₂罐。
   2. 添加塑料底座适配器降低5"管插入的60毫升注射器台氏液。
   3. 塑料气石连接来了5"管的末端所以O ₂将泡出到台氏液。
4. 放置一个非吸收性外科缝线围绕用作套管针。针被连接到歧管（ 见图4），允许复古灌注不同的解决方案。最后，心脏的主动脉将空心进针。

2.动物的制备与心脏解剖

1. 肝素称量并注入鼠标（例如，鼠标的重量20克，用20单位或200微升注入）颈椎脱臼安乐死前15分钟。麻醉鹦鹉根据:Ø您的IACUC协议的动物使用教程，然后继续进行颈椎脱位。
   注:使用8周龄小鼠或20克鹦鹉。
2. 从安乐死后胸腔中取出心脏。作为描述小鼠中提取完全相同的方式鹦鹉心。
   1. 清洁用乙醇鼠标胸口。
   2. 使用夹层剪刀，做一个切口下腹部，然后切开两侧朝脖子。
   3. 拉回切割组织和引脚下来。
   4. 切隔膜。切割膜片时要避免损坏心脏要小心。
   5. 取出肺和周围的组织。
   6. 使用镊子舀心脏不受挤压它。尽可能长时间地切主动脉。
3. 与约1毫升台氏液运送一个小权衡船的心脏。
4. 使用非吸收性外科缝线，通过扎到大动脉水平的Langendorff设备针。领带的心脏主动脉有两个细镊子的帮助。打开位于与含台氏液60毫升注射器系列阀门开始复古灌注。
5. 让心脏稳定10分钟。利用这段时间来清洁血液和加载染料之前心脏周围的脂肪组织。拉用镊子心脏的基地附近的脂肪组织，并用小解剖剪刀剪。一定要做到这一点解剖显微镜的视野下。

3.胞质^钙测量:准备染料RHOD-2AM

1. 添加20％普朗尼克20μL的（非离子表面活性剂）在DMSO中，通过在含有该染料的50微克的染料制造商提供的特殊包装的塑料小瓶中。
2. 吹打向上和向下，避免气泡混合。
3. 与非离子表面活性剂和从特殊包装的塑料管形瓶中的染料成透明玻璃小瓶转移混合DMSO中。加入1毫升台氏SOLU的重刑透明玻璃小瓶。
4. 超声处理用于在槽式声波处理器15-20分钟。
5. 使用蠕动泵在室温下30分钟灌注染料。
   1. 放置染料在染料腔室。
   2. 使用机械夹具压缩所有连接到歧管的另一管道线。夹具被放置在歧管的上方。这将防止任何回流到连接到60毫升的注射器管。
   3. 打开灌注蠕动泵开始循环的染料。立即关闭60毫升注射器低于三通阀。
   4. 定位连接到旁边的心脏抽吸蠕动泵再循环已灌注到心脏的染料的小管。

4.内部-SR ^钙测量:准备染料幅度- Fluo4AM

1. 以相同的方式作为RHOD-2AM制备幅度 - Fluo4AM。请参见3逐步说明。
2. AFTER装入染料，打开位于含台氏液，开始复古灌注的60毫升注射器系列阀门。一定要去掉上面歧管钳。
3. 加台罗德氏溶液，以在水平腔和温热至37℃。
4. 复古与灌流45分钟台氏液以去除细胞内的染料。

5.膜电位测量:准备染料迪8 ANEPPS

1. 加入5毫升99％的乙醇对包含5毫克染料的染料小瓶中。
2. 分装10μL到使用中继器吸管500个人的1毫升塑料小瓶。
3. 变干的速度真空并储存在-20℃。
4. 添加20μL的20％泊洛尼克于DMSO至塑料小瓶中的干燥的染料的10微克。
5. 吹打向上和向下，避免气泡混合。
6. 含DMSO加普朗尼克和染料混合传输从塑料小瓶量筒（10毫升）中。加台氏溶液至最终沃5毫升lume明。
7. 超声处理用于在槽式声波处理器20-25分钟。
8. 灌注到心脏，使用蠕动泵30分钟。请参阅逐步说明3.5节。

6。心外膜录音信号

1. 装载染料后，通过去除所述歧管上方的钳复古灌注与台罗德氏溶液的心脏。打开位于与含有台罗德氏溶液的60毫升注射器系列阀门。 10分钟复古灌流台氏液，以稳定心脏。
2. 填充台氏溶液的水平腔和转动珀尔帖单元上以使浴温至37℃。
3. 心脏的表面上的光纤位置。
   1. 放置一个2毫升吸管内的光纤，然后将吸管连接到一个显微。
   2. 使用显微稍微按下光纤对LV的表面上。
4. 外部的步伐老天由波发生器控制的刺激室温。
   1. 程序中的波发生器提供方波脉冲为1ms的宽度。
   2. 设置为外部同步刺激器和外部输入连接到波发生器。
   3. 为了刺激器的每个输出，并在最后的焊接针针连接线。
   4. 放置两个针灸针在心脏约3mm彼此分开的顶点。
   5. 针被放置在组织后才，打开刺激器的输出，以防止触电。
5. 在采集软件，调整频率采集到10kHz。

7。记录心内膜信号

1. 参照步骤6.1和6.2加载染料后，以稳定的心脏。
2. 关于使用光纤的规模急剧23Ga点，使心脏的表面的小孔中隔附近的LV。
3. 将一玻璃体内手术巩膜适配器在使用显微第一光纤定位到心内膜，以帮助。
4. 外部踱步的心脏。参见步骤6.4。
5. 在采集软件，调整频率采集到10kHz。

结果

美联社和^钙 瞬变的心内膜和心外膜

以横跨心室壁比较信号，一个光纤被定位在内膜和另一个在外膜。从心内膜从心外膜记录与一个AP的形态相比较是评估透功能的最佳方式。室壁是高度异质性，因此，受影响的形态是在这两个区域有很大不同。这是众所周知的，该心内膜少我_到...

讨论

本文在描述局部场荧光技术来评估心肌细胞体外的功能中心。这些细胞在耦合环境的研究不仅更加生理，但也是高度适宜用于评估器官级病状。底层兴奋-收缩偶联（ECC）的蜂窝事件可以在与使用监测细胞内Ca ²⁺动力学分子探针的整个器官水平进行评估（RHOD 2细胞内的Ca ^2+，幅度- Fluo4 SR的Ca ^2+）和电活动（二 - 8-ANEPPS）。这里，我们已经提出了三种LFFM萤光技术，既激?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma	7647-14-5
D-(+)-glucose	Sigma	50-99-7
Potassium chloride	Sigma	7447-40-7
HEPES	Sigma	7365-45-9
Sodium phosphate	Sigma	10049-21-5
Calcium chloride solution	Sigma	10043-52-4
Magnesium chloride solution	Sigma	7786-30-3
Sodium hyrdoxide	Sigma	S-8045
0.2 μm nylon membrane filter	Whatman	7402-004
Manifold MPP	Warner	64-0216
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)	AllMech Tech	LOOK-SP105
Heparin sodium injection 1000USP/mL	AllMech Tech	NDC63323-540-11
DMSO D8779	Sigma	67-68-5
Blebbistatin	Sigma	856925-71-8
Pluronic F-127 20% solution	Biotium	59004
Materflex C/L peristaltic pump	Cole-Parmer	77122-26
Isostim stimulator	World Precision Instruments	A320RC
Waveform generator	Teledyne Lecroy	WaveStation 2012
Ultrasonic cleaner FS20	Fisher Scientific	1533530
Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-031A
Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-094A
Adapter luer lock to 3-way valve	Cole-Parmer	EW-31200-80
Tee adapters and plastic fittings	Cole-Parmer	6365-90
Plastic clamp	WaterZoo	2465
Peltier	TE Technology	TE-127-2.0-2.5
Rhod-2AM	ThermoFisher Scientific	R1245MP
Di-8-ANEPPS	ThermoFisher Scientific	D3167
Mag-Fluo-4AM	ThermoFisher Scientific	M14206
Acupunture needles	LHASA	TC1.20x13
60 mL BD syringe with luer-lok	Fisher Scientific	14-820-11
LabView	National Instruments
Speed vacuum Eppendorf Vagufuge	Fisher Scientific	07-748-13
Digital signal processing circuit DSP TMS 320	Texas Instrument
Longpass Dichroic mirror 567 nm	ThorLabs	DMLP567L
Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-437
Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-438
Longpass colored glass filter 590 nm	ThorLabs	FGL590
Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW
Micromanipulator for laser	Siskiyou	MX130R
Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39	ThorLabs	FT200UMT
LEDs blue	Lumileds	L135-B475003500000
LEDs green	Lumileds	L135-G525003500000
Cube beam splitter, non-polarizing	ThorLabs	BS007
36" Length, Dovetail Optical Rail	Edmund Optics	54-402
2.5" Width, Dovetail Carrier	Edmund Optics	54-404
0.75" Travel, micrometer stage	Edmund Optics	37-983
Dovetail optical rail 3"	ThorLabs	RLA075/M
Dovetail rail carrier 1"	ThorLabs	RC1
Avalanche photodiode Helix 902	Digi-Key	HELIX-902-200
Objective holder XY Translator	ThorLabs	ST1XY-S
Aluminum breadboard 6" x 6"	ThorLabs	MB6
Nexus otpical table 4' x 6'	ThorLabs	T46HK
Stainless steel cap screws	ThorLabs	HW-KIT5/M
Acrylic  sheet	Home Depot/Lowes
Sylgard Silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184
Epoxy gel	Walmart/Home Depot	2-part 5 min clr 1oz
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
23G Precision glide needle	B-D	305145
Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm	ThorLabs	BA1/M
Wire shelve posts 36"	Alera	AALESW59PO36SR
Wire shelves	Alera	ALESW582424SR
Post and angle clamp	ThorLabs	SWC/M-P5
Glass syringe for dye chamber	Wheaton	W851020
Rubber stopper	Home Science Tools	CE-STOP01C