ローカルフィールド蛍光顕微鏡：無傷の心の中に携帯電話の信号のイメージング

要約

心臓では、分子事象は器官の電気的および収縮機能を調整します。ここで紹介する地元の視野蛍光顕微鏡技術のセットは、無傷の心の中の細胞の変数の記録を可能にします。心機能を定義するメカニズムを識別することは心が病的な状況下でどのように機能するかを理解する上で重要です。

要約

心臓では、分子シグナリング研究は、通常、単離された筋細胞で行われています。しかしながら、このような虚血および不整脈などの多くの病的状態は、完全に全臓器レベルで理解することができます。ここでは、無傷の心の中の細胞の信号の測定を可能にするローカルフィールド蛍光顕微鏡（LFFM）の分光技術を提示します。技術は、蛍光シグナルを記録するランゲンドルフ灌流心臓および光ファイバの組み合わせに基づいています。 LFFMは正常および病的条件下で心を勉強する心血管生理学の分野で様々な用途があります。複数の心臓の変数は異なる蛍光指示薬を用いてモニターすることができます。これらは、細胞質ゾルの[Ca ^2+]、イントラ筋小胞体の[Ca ^2+]および膜電位が含まれます。外因性蛍光プローブが励起され、放出される蛍光はLFFM落射蛍光技術の三つの異なるアレンジで検出します本論文での。これらの技術の中で中心的な違いは、励起用の励起光が変調されている方法で使用される光源の種類です。連続波LFFM（CLFFM）は、励起用の連続レーザ光を使用しながら、パルスLFFM（PLFFM）は、レーザ光パルスを使用しています。最後に、発光ダイオード（LED）は、第3の光源として使用しました。この非コヒーレント構成は、パルス状のLED蛍光顕微鏡（PLEDFM）と呼ばれています。

概要

心臓は心臓血管系の中心的な器官です。心臓の収縮は、細胞内の[Ca ^{2+] i}の増加によって開始されます。細胞内Ca ²⁺放出における電気的興奮と変化の関係は、歴史的に、酵素的に解離した細胞^1、2で研究されています。しかし、心臓の細胞は、電気的であり、代謝的及び機械的に結合された^3、4。単離された場合、筋細胞だけでなく、物理的にカップリングしていないですが、異なる層から筋細胞を解離⁵中に混合されます。また、電圧クランプ条件下で単離された細胞の研究から浮上している巨大な利点^、6、7、8電気シンシチウムALWAとして心の本質的な性質にもかかわらず、YS組織³に存在するものから細胞を解離する方法を機能的に異なるという問題を提起します。

本稿では、我々は、無傷の心臓における局所電場蛍光顕微鏡（LFFM）技術の使用により、心臓生理学の知識で得られた進歩について説明します。 LFFMは、細胞質ゾルのCa ^2+、イントラ筋小胞体（SR）のCa ²⁺および膜電位などの複数の生理学的変数を測定するための蛍光指示薬を使用しています。これらの測定は^、同時に心室圧⁹に関連して^10、心電図^9、電気的活動電位（APS）、イオン電流の記録とケージド化合物^4、11のフラッシュ光分解を得ることができます。また、これらの測定値は、近い高い周波数で無傷の心臓をペーシングすることによって得ることができます生理率rと。いくつかの記事^{9、11、12、13、14は} LFFM技術を使用して、我々のグループによって公開されているが、この技術に関連した技術的な複雑の推定は、心臓や他の臓器におけるex vivoの生理現象を研究する上での大規模な使用を妨げてきました。

LFFM技術（ 図1）は、組織と接触しているマルチモード光ファイバを使用して得られたエピ蛍光測定値に基づいています。任意の接触の蛍光イメージング技術と同様に、光学的分解能は、ファイバの直径と開口数（NA）に依存します。ファイバのNAが高い小径の測定の空間分解能を増加させます。 NASおよび繊維径は、0.22から0.66まで、50ミクロンからそれぞれ1mmとの範囲とすることができます。にNAのしわは、より大きな立体角から到来する光子を受け入れることによって信号対雑音比（S / N）に信号を改善します。落射蛍光装置として機能させるために、光ビームは、非球面レンズまたはレンズとファイバ一致NA落射蛍光対物レンズで光ファイバに集光されます。このマッチングは、励起用およびフルオロフォアによって放出された光子をバック収集するためのエネルギー伝達を最大化します。

組織内にロードされた外因性の蛍光標識を励起するために、異なる光源及び照明モードを利用することができます。パルス局所視野蛍光顕微鏡^{3、12（PLFFM）}を使用して我々の先駆的な研究では、低コストのピコ秒レーザー（ 図1a、PLFFM）を用います。光源のこのタイプは、実質的に起因する色素を漂白することなく、照明領域の下のフルオロフォア分子の励磁大きな画分の大きな利点を有しています短パルス持続時間¹²へ。また、超短パルスの使用は、色素¹²の蛍光寿命の評価を可能にしました。蛍光寿命は、Ca ²⁺に結合した色素分子の割合を定量化するために使用することができる特性です。残念なことに、パルス間の振幅のパルスと変動の時間的なジッタは、色素に結合するリガンドによって生じる蛍光の変化が大きい場合に、この実験ストラテジーの適用を制限します。

連続波（CW）レーザは、通常LFFM（ 図1b、CLFFM）の主照明源として使用されます。レーザビームは、連続的に、組織を照明することができるか、ferroelectrically調節することができます。ビームの強誘電体の変調は、光のマイクロ秒のパルスの生成を可能にします。この変調は、外部ハードウェアによって制御することができます。この手順では、劇的トンを低減するだけでなく彼の光パルスの時間的ジッタだけでなく、異なる波長の光を混合することができます。光の混合は、異なるレーザからの多重線によって行われます。結果として、異なるスペクトル特性を有する複数の色素は、例えば、生理学的変数の種々の測定を実行するために励起することができるRhod-2細胞質ゾル^の Ca ²⁺のための、MagFluo4イントラSR ^の Ca ^2+、ジ-8-ANEPPS用用膜電位。

LFFM光源としてレーザは、存在する種々の利点があるが、他のタイプの光源は、発光ダイオード（LED）などを用いることができます。この場合、励起光源は、InGaNのLED（ 図1c、PLEDFM）から成っていました。伝導帯から電子が価電子帯の正孔と再結合するときのLEDにおいて、光子が自然に放出されます。固体レーザとの違いは、発光が他の光子によって刺激されないことです。これは、非コヒーレントなビームをもたらすとLEDの広いスペクトル放射。

ハイパワーLEDの異なる種類を使用することができます。 Fluo-4またはマグのFluo-4を使用して記録ディ-8-ANEPPSを使用して、APの記録のためにおよびCa ²⁺過渡現象のために、我々は485nmの（青）で、典型的なピーク発光および20nmの半分の幅を有するLEDを使用しました（ 図1D）。 Rhod-2で記録し^た Ca ²⁺過渡現象のために、LEDは540nmの（緑）、35 nmの（ 図1D）の半分の幅で、典型的なピーク発光を有していました。 LEDは、バンドの波長で発光するので、それらのスペクトル放射を絞り込むためのフィルタを必要とします。また、パルス光は、20マイクロ秒の持続時間で1.6キロヘルツのレートで生成することができます。 LEDは、高速パワーMOSFET電界効果トランジスタを用いてパルスしました。異なる指標との同時記録は時間多重LEDによって行うことができます。残念ながら、LEDによって放射される光は、レーザ光に比べて光ファイバに集中することはより困難です。このように、私たちの主な欠点LEDをることは、それらの放出プロファイルは、メイン軸からの角度変位（±15°）を持っており、補助光学部品は、それを修正するために使用しなければならないことです。

前述の光学的構成のすべてにおいて、励起光は、ダイクロイックミラーを用いて反射されます。ビームは、その後、組織に配置されているマルチモード光ファイバに非球面レンズと顕微鏡対物レンズによって集束されます。任意の落射蛍光装置のように、ダイクロイックミラーは、また、放射された光から励起を分離するのに役立ちます。放出された光スペクトルは、任意の反射された励起を除去するために、バリアフィルタを通って戻って移動します。最後に、放出された光は光検出器（ 図1）上に目的に集束されます。

光から電流への変換は、シリコンアバランシェフォトダイオードによって実行されます。これらのダイオードは、高速応答、低光の検出を可能にする高感度を持っています。ザアバランシェフォトダイオードによって生成される光電流は、2つの方法で増幅することができる：トランスインピーダンス増幅器は、帰還抵抗素子（ 図1eの）を有するまたは電圧（ 図1F）に電流を変換する積分器。第一のアプローチを使用して、出力電圧は、光電流と帰還抵抗に比例します。ピコ秒レーザパルスの抵抗検出の典型的な例は、 図2a、2b及び2cに示されています。パネル2aは、トランスインピーダンスアンプの出力を示し、パネル2bは、アスタリスク（*）で示された区間の時間展開を示しています。ピーク追跡アルゴリズムは、蛍光応答¹²のピーク（赤）とベース（緑）を検出するために実装されました。ベース蛍光の測定は、周囲LIGによって導入アバランシェフォトダイオードの暗電流および干渉の両方の情報を提供しますHTと電磁結合。ピークと塩基の表現は、 図2cに示されています。この図は、鼓動しているインコの心臓の心周期中^の Ca ²⁺に結合した色素（Rhod-2）が発する蛍光を示しています。

第二の方法では、積分器の出力電圧は、電流と容量性フィードバック（ 図2D、2E、及び2F）の関数です。 図2Fは、2つの連続した統合サイクルを示していますなし外部照明およびパルスLEDから照射された光パルスと第二と第一。詳細な説明は 、 図2Gおよび2Hに示されています。このアプローチは、より面倒が、によりフィードバックコンデンサにおける熱雑音が存在しないため、より大きなS / Nを提供します。機器は、励起光の全ての制御および多重化を生成し、ヘッドステージの統合及び解像度を指示するタイミング段階を含みますらの期間。これは、通常、データのオンライン回帰を計算することによって、統合された出力信号のデジタル分化を行うデジタル信号処理回路を用いて行われます。抵抗性フィードバックを用いた場合には、任意のA / D取得ボードを使用することができます。

最後に、我々のLFFM技術は、非常に汎用性であり、複数の領域から記録するように適合させることができます。光路中にビームスプリッタを追加すると、私たちは2本の光ファイバに光を分割することができます。各光ファイバは、その後、外因性の蛍光プローブから、独立して、励起する組織と記録放出の異なる領域に配置することができます。この変更は、生理学的変数にどのように影響するかを解剖学的な地域差を評価するために私達を許可します。 図3は、2本の光ファイバを経電気または細胞内の[Ca ^{2+] i}レベルのウィットを測定するために使用されるようにCW励起光を分割するために使用されるビームスプリッタを示します時間マイナー侵襲。経た信号は、1つの心内膜上のファイバと心室壁の心外膜層の上に他方を配置することによって記録することができます。したがって、LFFM技術は、異なる領域における細胞シグナルの経時変化を測定する能力を有しており、地域の変化は、病理学的状況で起こるかどうかをテストするために使用することができます。

プロトコル

このプロトコルは、すべてのマウスの取り扱いは、UCマーセド施設内動物管理使用委員会（第2008から201）によって承認されました。インコを用いた実験は、科学研究のためのベネズエラ研究所（IVIC）の科学委員会によって確立された動物の使用のための一般的なポリシーに従って、1999年に実施しました。

1.ランゲンドルフセットアップの準備

1. 140のNaCl、5.4のKCl、2のCaCl _2、1のMgCl _2、0.33 HPO _4、10グルコース、10 HEPES ₂のNa：MMで、次の溶質濃度を含むタイロード溶液を調製します。 NaOHで7.4にタイロード溶液のpHを調整し、0.22μmのフィルターを通してソリューションをフィルタリングします。
2. 60 mLの注射器と水平ランゲンドルフセットアップ^11、 図4に示す¹²の全てのチューブにタイロード溶液をロードします。すべての気泡を排除することを確認します。
3. 図4に示すように沈めプラスチック「エアストーン」を使用して、100％のO ₂と平衡タイロード液。
   1. O ₂タンクにプラスチックチューブを接続します。
   2. 60 mLシリンジ中のタイロード溶液に5 "チューブを下げるためにプラスチック製のティーアダプタを追加します。
   3. タイロード溶液中に₂意志バブルうちOので、5 "チューブの端部にプラスチック製のエアストーンを取り付けます。
4. カニューレとして使用する針の周りの非吸収性縫合糸を配置します。針は、異なるソリューションでレトロ灌流を可能にするマニホールド（ 図4参照）に接続されています。最後に、心臓の大動脈は、針にカニューレされます。

2.動物の準備と心解剖

1. 頚椎脱臼により安楽死の前に計量し、注入マウスをヘパリン（体重20グラムの例：マウス、20単位または200μLに注入する）15分。麻酔インコ応じトン頸椎脱臼を進め、あなたのIACUCプロトコルの動物使用ガイドoおよび。
   注：8週齢のマウスまたは20グラムのインコを使用してください。
2. 安楽死の後の胸腔から心臓を取り出します。マウスについて説明したように全く同じようにインコの心を抽出します。
   1. エタノールでマウスの胸をきれいにしてください。
   2. 解剖ハサミを使用して、下腹部に切開を行い、その後、首に向かって側面をカット。
   3. 切断組織を引いて、それを突き止めます。
   4. 振動板をカットします。心臓の損傷を防ぐために、振動板をカットするときは注意してください。
   5. 肺と周囲の組織を削除します。
   6. それを圧迫することなく、心をすくうためにピンセットを使用してください。できるだけ長く大動脈をカットします。
3. 約1 mLのタイロード溶液で小さな計量ボートに乗って心を運びます。
4. 非吸収性縫合糸を使用して、経由して水平ランゲンドルフ装置上に大動脈を結びます針。 2細かいピンセットの助けを借りて、心臓大動脈を結びます。タイロード溶液を含む60 mLの注射器と直列に位置バルブを開くことにより、レトロ灌流を開始します。
5. 心臓を10分間安定化させます。血液や染料をロードする前に心臓を取り囲む脂肪組織をきれいにするために、この時間を使用します。ピンセットで心の底部近くの脂肪組織を引き、小さな解剖ハサミを用いて切断。解剖顕微鏡の視野の下にこれを行うにしてください。

3.細胞質ゾルのCa ²⁺測定：染料Rhod-2AMの準備

1. 染料の50μgのを含む染料メーカーが提供する特別なパッケージ化されたプラスチックバイアルにDMSO中の20％のプルロニック（非イオン性界面活性剤）の20μLを追加します。
2. 泡を避け、ピペッティングにより混和します。
3. 透明なガラスバイアルに特別にパッケージプラスチックバイアルから非イオン性界面活性剤と混合し、DMSOおよび色素を転送します。タイロードソリューの1 mLを加え透明なガラスバイアルにる。
4. バス超音波処理器で15〜20分間超音波処理。
5. 室温で30分間、蠕動ポンプを使用して染料を灌流。
   1. 染料チャンバ内で染料を置きます。
   2. マニホールドに接続された他の全てのチューブラインを圧縮する機械的クランプを使用してください。クランプは、マニホールドの上方に配置されています。これは、60 mLのシリンジに接続チューブ内に任意の逆流を防止します。
   3. 染料を循環開始する灌流蠕動ポンプをオンにします。すぐに60 mLシリンジ、以下の3ウェイバルブを閉じます。
   4. 位置心臓内に灌流された染料を再循環するために、心臓の隣に吸引蠕動ポンプに接続されている小さなチューブ。

4.イントラ-SRのCa ²⁺測定：染料マグ-Fluo4AMの準備

1. Rhod-2AMと同様にマグFluo4AMを準備します。段階的な手順については、セクション3を参照してください。
2. AFTE染料をロードR、レトロ灌流を開始するタイロード溶液を含む60 mLの注射器と直列に配置さ弁を開きます。マニホールドの上にクランプを削除してください。
3. 水平室にタイロード溶液を加え、37℃まで温めます。
4. 細胞質ゾル色素を除去するために45分間のタイロード液でレトロ灌流。

5.膜電位測定：色素ジ8-ANEPPSの準備

1. 染料5mgを含有する染料バイアルに99％エタノールを5mLを加えます。
2. リピーターピペットを用いて、500個々の1mLのプラスチックバイアルにアリコート10μLを。
3. -20℃で高速真空や店舗で乾燥します。
4. 乾燥染料10μgのプラスチックバイアルにDMSO中の20％のプルロニックの20μLを追加します。
5. 泡を避け、ピペッティングにより混和します。
6. プラスチックバイアルからメスシリンダー（10ミリリットル）にプルロニックおよび染料でDMSOを含むミックスを転送します。最終Voにタイロード液を追加5ミリリットルのLUME。
7. バス超音波処理器で20〜25分間超音波処理。
8. 蠕動ポンプを用いて30分間心に灌流します。 3.5節で段階的な手順を参照してください。

6。心外膜の信号を記録

1. 色素をロードした後、マニホールドの上にクランプを除去することにより、タイロード溶液で心をレトロ灌流。タイロード溶液を含む60 mLの注射器と直列に位置バルブを開きます。心を安定させるために10分間レトロ散らすタイロード溶液。
2. タイロード溶液で水平室を記入し、37℃に浴温度をもたらすためにペルチェユニットの電源をオンにします。
3. 心臓の表面に光ファイバを配置します。
   1. 2 mLのピペット内部に光ファイバを配置し、マイクロマニピュレーターにピペットを取り付けます。
   2. 少しLVの表面に対して光ファイバを押すようにマイクロマニピュレーターを使用してください。
4. 外部ょんのペース波動発生器によって制御される刺激で室温。
   1. プログラム1ミリ秒の幅矩形パルスを提供するために、波発生器。
   2. 外部で同期をとるための刺激を設定し、波発生器への外部入力に接続します。
   3. 刺激の各出力に、最後に半田付け鍼灸針で線を接続します。
   4. 約3mm離間心尖の両方で鍼を置きます。
   5. 針が組織内に配置された後にのみ、感電を防止するために、刺激の出力をオンにします。
5. 取得ソフトウェアでは、10 kHzに取得頻度を調整します。

7 。心内膜信号を記録

1. 色素をロードした後、心臓を安定させるために6.1および6.2のステップを参照してください。
2. 光ファイバのサイズに関する鋭い23Gaポイントを使用して、中隔に近いLVに心臓の表面に小さな穴を作ります。
3. マイクロマニピュレーターを用いて、心内膜に第一の光ファイバの位置決めを支援するために硝子体内手術強膜切開アダプタを置きます。
4. 外部から心臓のペース。 6.4ステップを参照してください。
5. 取得ソフトウェアでは、10 kHzに取得頻度を調整します。

結果

心内膜および心外膜における APおよびCa ²⁺ 過渡現象

心室壁を横切って信号を比較するためには、光ファイバは、心外膜での心内膜及び他方に配置されています。心外膜からのものと心内膜から記録されたAPの形態を比較すると、貫機能を評価するための最良の方法?...

ディスカッション

本稿では、心筋細胞のex vivoでの機能を評価するために、ローカルフィールドの蛍光技術を説明するのに集中しています。接続された環境でのこれらの細胞の研究だけではなく、より生理的であるだけでなく、臓器レベルの病理を評価するための非常に適切です。興奮収縮連関（ECC）を基礎となる細胞事象は、細胞内Ca ²⁺動態（Rhod 2細胞質ゾルのCa ^2+、マグFLUO4 SRのCa ^...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma	7647-14-5
D-(+)-glucose	Sigma	50-99-7
Potassium chloride	Sigma	7447-40-7
HEPES	Sigma	7365-45-9
Sodium phosphate	Sigma	10049-21-5
Calcium chloride solution	Sigma	10043-52-4
Magnesium chloride solution	Sigma	7786-30-3
Sodium hyrdoxide	Sigma	S-8045
0.2 μm nylon membrane filter	Whatman	7402-004
Manifold MPP	Warner	64-0216
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)	AllMech Tech	LOOK-SP105
Heparin sodium injection 1000USP/mL	AllMech Tech	NDC63323-540-11
DMSO D8779	Sigma	67-68-5
Blebbistatin	Sigma	856925-71-8
Pluronic F-127 20% solution	Biotium	59004
Materflex C/L peristaltic pump	Cole-Parmer	77122-26
Isostim stimulator	World Precision Instruments	A320RC
Waveform generator	Teledyne Lecroy	WaveStation 2012
Ultrasonic cleaner FS20	Fisher Scientific	1533530
Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-031A
Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-094A
Adapter luer lock to 3-way valve	Cole-Parmer	EW-31200-80
Tee adapters and plastic fittings	Cole-Parmer	6365-90
Plastic clamp	WaterZoo	2465
Peltier	TE Technology	TE-127-2.0-2.5
Rhod-2AM	ThermoFisher Scientific	R1245MP
Di-8-ANEPPS	ThermoFisher Scientific	D3167
Mag-Fluo-4AM	ThermoFisher Scientific	M14206
Acupunture needles	LHASA	TC1.20x13
60 mL BD syringe with luer-lok	Fisher Scientific	14-820-11
LabView	National Instruments
Speed vacuum Eppendorf Vagufuge	Fisher Scientific	07-748-13
Digital signal processing circuit DSP TMS 320	Texas Instrument
Longpass Dichroic mirror 567 nm	ThorLabs	DMLP567L
Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-437
Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-438
Longpass colored glass filter 590 nm	ThorLabs	FGL590
Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW
Micromanipulator for laser	Siskiyou	MX130R
Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39	ThorLabs	FT200UMT
LEDs blue	Lumileds	L135-B475003500000
LEDs green	Lumileds	L135-G525003500000
Cube beam splitter, non-polarizing	ThorLabs	BS007
36" Length, Dovetail Optical Rail	Edmund Optics	54-402
2.5" Width, Dovetail Carrier	Edmund Optics	54-404
0.75" Travel, micrometer stage	Edmund Optics	37-983
Dovetail optical rail 3"	ThorLabs	RLA075/M
Dovetail rail carrier 1"	ThorLabs	RC1
Avalanche photodiode Helix 902	Digi-Key	HELIX-902-200
Objective holder XY Translator	ThorLabs	ST1XY-S
Aluminum breadboard 6" x 6"	ThorLabs	MB6
Nexus otpical table 4' x 6'	ThorLabs	T46HK
Stainless steel cap screws	ThorLabs	HW-KIT5/M
Acrylic  sheet	Home Depot/Lowes
Sylgard Silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184
Epoxy gel	Walmart/Home Depot	2-part 5 min clr 1oz
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
23G Precision glide needle	B-D	305145
Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mm	ThorLabs	BA1/M
Wire shelve posts 36"	Alera	AALESW59PO36SR
Wire shelves	Alera	ALESW582424SR
Post and angle clamp	ThorLabs	SWC/M-P5
Glass syringe for dye chamber	Wheaton	W851020
Rubber stopper	Home Science Tools	CE-STOP01C