JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

kalbinde, moleküler olaylar organın elektrik ve kasılma fonksiyonunu koordine ederler. Burada sunulan yerel alan floresan mikroskopi teknikleri bir dizi sağlam kalplerinde hücresel değişkenlerin kaydedilmesini sağlar. kalp fonksiyonlarını tanımlayan mekanizmaları belirleme kalp patolojik durumlar altında nasıl çalıştığını anlamada önemlidir.

Özet

kalbinde, moleküler sinyal çalışmaları genellikle izole miyositlerde yapılmaktadır. Ancak, bu tür iskemi ve aritmi gibi birçok patolojik durum sadece tamamen tüm organ düzeyinde anlaşılabilir. Burada, bozulmamış kalbinde hücresel sinyallerin ölçümünü sağlar yerel alan floresan mikroskobu (LFFM) spektroskopik tekniğini sunuyoruz. teknik, bir Langendorff perfüze kalp ve flüoresan sinyal kaydetmek için bir optik elyafın bir kombinasyonuna dayanmaktadır. LFFM normal ve patolojik şartlar altında kalbi incelemek için kardiyovasküler fizyoloji alanında çeşitli uygulamalar vardır. Birden fazla kalp değişkenler farklı floresan göstergeler kullanılarak izlenebilir. Bunlar sitozolik [Ca2 +], intra-sarkoplazmik retikulum [Ca2 +] ve membran potansiyelleri bulunmaktadır. eksojen floresan sondalar heyecanlı ve yayılan floresan LFFM Epifloresans tekniğinin üç farklı düzenlemeler ile tespitBu çalışmada sunulan s. Bu teknikler arasında merkezi farklar uyarma ve ikaz ışığı modüle edilir yolda kullanılan ışık kaynağının türü vardır. sürekli dalga LFFM (CLFFM) uyarma sürekli lazer ışığı kullanır iken darbeli LFFM (PLFFM) lazer ışık darbeleri kullanır. Son olarak, ışık yayan diyotlar (LED), bir üçüncü ışık kaynağı olarak kullanıldı. Bu sigara, tutarlı bir düzenleme darbeli LED floresan mikroskobu (PLEDFM) olarak adlandırılır.

Giriş

Kalp damar sisteminin merkezi organıdır. Kalbin kasılma intrasellüler artışa [Ca2 +] tarafından başlatılır. Hücre içi Ca 2 + sürümde elektrik uyarılabilmenin ve değişimler arasındaki ilişki tarihsel enzimatik ayrışmış hücreleri 1, 2 olarak ele alınmıştır. Bununla birlikte, kalp hücreleri, elektriksel olarak, metabolik ve mekanik, 4 3 bağlanmış. Izole zaman miyositler sadece fiziksel Kuplajsız değildir, fakat farklı katmanlardan miyositler ayrışma 5 boyunca karıştırılır. Bundan başka, voltaj kenetleme şartları altında izole edilmiş hücrelerin çalışma ortaya çıkan büyük bir avantaj, 6, 7, 8, bir elektrik sinsityum ALWA olarak kalbin iç doğasına rağmenys dokusunda 3 bulunanların hücreleri ayrışmış nasıl işlevsel olarak farklı sorusunu oluşturmaktadır.

Bu yazıda, sağlam kalbinde yerel alan floresan mikroskobu (LFFM) tekniklerinin kullanımı ile kardiyak fizyoloji bilgisine elde gelişmeleri açıklar. LFFM gibi sitozolik Ca 2+, içi sarkoplazmik retikulum (SR) Ca 2+ ve membran potansiyeli gibi çoklu fizyolojik değişkenleri ölçmek için floresan göstergeler kullanır. Bu ölçümler ventrikül basıncı 9, 10, Elektrokardiyogram 9, elektrik aksiyon potansiyeli (AP), iyon akımı kayıtları ve kafesli bileşikler 4 flaş fotoliz 11 ile aynı anda ve bağlantılı olarak elde edilebilir. Buna ek olarak, bu ölçümler yakınında yüksek frekanslarda sağlam kalp ilerleme hızı ile elde edilebilirFizyolojik oranlarda r. Çeşitli makaleler rağmen 9, 11, 12, 13, 14 LFFM teknikleri kullanarak grubumuz tarafından yayınlanmıştır, bu teknikle ilgili teknik karmaşıklıklar karinesi kalp ve diğer organlarda ex vivo fizyolojik olayları okuyan büyük miktarlarda kullanımını engellemiştir.

LFFM tekniği (Şekil 1) doku ile temas halinde olan bir çoklu optik fiber kullanılarak elde epifloresans ölçümlerine dayanır. herhangi bir temas floresan görüntüleme tekniği gibi, optik çözünürlük çapı ve lif sayısal açıklık (NA) bağlıdır. lif A NA yüksek ve daha küçük çaplı ölçümlerinin uzaysal çözünürlüğü artacaktır. NAS ve elyaf çapları sırasıyla 0.22 mm 0.66 ve um 1 ila 50 arasında olabilir. İçindeNA katlama bir büyük katı açı gelen fotonları kabul ederek gürültü oranı (S / N) sinyali artıracaktır. Epifloresans cihazı olarak hareket etmek amacıyla, ışık huzmesi bir asferik lens veya Epifloresans amacı ile optik fiber içine odaklanmış nerede lens NA ve fiber maç. Bu eşleştirme uyarma ve fluorofor tarafından yayılan fotonlar geri toplamak için enerji transferini maksimuma çıkarır.

dokuda yüklenen eksojen floresan göstergeleri heyecanlandırmak için, farklı ışık kaynakları ve aydınlatma modları kullanılabilir. Darbeli yerel alan floresan mikroskobu 3, 12 (PLFFM) kullanarak ilk çalışmalarda düşük maliyetli pikosaniye lazer (Şekil 1a, PLFFM) kullanılmıştır. ışık kaynağının Bu tip büyük ölçüde nedeniyle boya kasar olmadan aydınlatma alanı altında florofor moleküllerinin heyecan verici büyük bir fraksiyonun büyük bir avantaja sahiptirkısa nabız 12 süreleri. Buna ek olarak, ultra bakliyat kullanımı boya 12 floresan ömrü değerlendirmesini sağladı. Floresans ömrü Ca2 + bağlanmış boya molekülleri kısmını ölçmek için kullanılabilecek bir özelliktir. Ne yazık ki, Darbeli darbe genliği bakliyat ve varyasyon zamana jittering boyasına ligand tarafından üretilen parlaklıkta meydana gelen değişiklikler büyük olduğu durumlarda, bu deney strateji uygulanmasını sınırlar.

Sürekli dalga (CW) lazeri genellikle LFFM (Şekil 1b, CLFFM) içindeki ana aydınlatma kaynağı olarak kullanılır. Lazer ışını sürekli olarak doku aydınlatmak veya ferroelektrik modüle edilebilir. kirişin ferroelektrik modülasyon ışığın mikrosaniye bakliyat üretimi sağlar. Bu modülasyon dış donanım ile kontrol edilebilir. Bu prosedür sadece dramatik t azaltırO ışık darbeleri zamansal jittering değil, aynı zamanda farklı dalga boylarında ışınları karıştırma sağlar. Kirişlerin karıştırma farklı lazerler çoklayıcı ışınları ile yapılır. Bunun bir sonucu olarak, farklı bir spektral özelliklere sahip olan birden fazla boya, örneğin, fizyolojik değişikliklerin çeşitli ölçümler yapmak için büyük bir heyecan olabilir Rhod-2 sitosolik Ca2 + için MagFluo4-içi SR Ca2 + ve di-8-ANEPPS için için membran potansiyeli.

LFFM ışık kaynağı olarak lazer mevcut çeşitli avantajları olmasına rağmen, ışık kaynaklarının başka tür ışık yayan diyot (LED) gibi kullanılabilir. Bu durumda, uyarım ışığı kaynağı, bir InGaN LED (Şekil 1c, PLEDFM) oluşuyordu. iletim bandı elektronlar değerlik bandında deliklerle recombine zaman LED'ler, fotonlar kendiliğinden yayılır. katı hal lazerleri ile farkı emisyon diğer fotonlar tarafından uyarılan olmadığıdır. Bu eşevrelı olmayan bir kiriş meydana getirir veLED'ler için daha geniş bir spektral emisyon.

yüksek güç LED Farklı türleri kullanılabilir. Di-8-ANEPPS Ca kullanılarak AP kayıtları için 2 + geçici Fluo-4 veya MAG-Fluo-4, 485 nm'de (mavi) ve 20 nm'lik bir yarı genişliği tipik tepe emisyon olan bir LED kullanılan kullanılarak kaydedildi (Şekil 1d). Rhod-2 ile kaydedilmiş Ca 2 + transientler için, LED 540 nm (yeşil) ve 35 nm (Şekil 1d) yarım genişlikte tipik bir tepe emisyonu vardı. LED'ler bir grup dalga boyunda yayar ve bu nedenle onların spektral emisyon daraltmak için filtreleri gerektirir. Buna ek olarak, darbeli ışığı 20 ms'den süresi 1.6 kHz'lik bir hızda oluşturulabilir. LEDLER hızlı bir güç MOSFET alan etkili transistör ile pulse edildi. Farklı göstergeler ile eş zamanlı olarak kayıtlar zaman çoklama LED'ler tarafından yapılabilir. Ne yazık ki, LED'ler tarafından yayılan ışık, bir lazer ışınına göre fiber optik üzerine odaklanmak daha zordur. Böylece, bize büyük dezavantajıLED'ler ing emisyon profilleri, ana eksenden açısal yer değiştirmelere (± 15 °), ve bir yardımcı optik düzeltmek için kullanılması gerekir olmasıdır.

Daha önce tarif edilmiş olan optik konfigürasyonlarda tümünde, uyarım ışık dikroik ayna yardımıyla yansıtılır. kiriş sonra doku üzerinde konumlandırılmış bir modlu fiber optik üzerine bir asferik lens ve mikroskop objektif ile odaklanmıştır. Herhangi bir epifluorışıma düzenlemede olduğu gibi, dikroik ayna da yayılan ışık uyarma ayırmak için hizmet eder. yayılan ışık spektrumu herhangi yansıyan uyarma çıkarmak için geri bariyer filtresi üzerinden geçecek. Son olarak, yayılan ışık, bir fotodetektör (Şekil 1) üzerinde bir hedefi ile odaklanmıştır.

elektrik akımına ışık iletim silikon çığ fotodiyotları ile gerçekleştirilir. Bu diyotlar hızlı tepki ve düşük ışık algılama sağlayan yüksek duyarlılığa sahip.çığ fotodiyotlar tarafından üretilen fotoakım iki şekilde amplifiye edilebilir: a transempedans kuvvetlendirici bir voltaj (Şekil 1 f) içine mevcut dönüştürmek için bir direnç geribesleme elemanı (Şekil 1 E) sahip olan ya da entegratör tarafından. İlk yaklaşımı kullanarak, çıkış voltajı fotoakım ve geri bildirim direnci ile doğru orantılıdır. Pikosaniye lazer darbelerinin direnç tespit tipik bir örneği Şekil 2a, 2b ve 2c'de gösterilmiştir. Paneli 2a transempedans yükselticinin çıkışı göstermektedir ve panel 2b bir yıldız işareti (*) ile belirtilen aralığın bir zaman genişleme gösterir. Bir tepe izleme algoritması floresan yanıtları 12 zirve (kırmızı) ve taban (yeşil) saptamak amacıyla yapılmıştır. Baz floresan ölçümü ortam lig getirdiği çığ fotodiyot karanlık akımı ve etkileşimler hem bilgi sağlarht ve elektromanyetik kavrama. Tepe ve bazların bir temsili Şekil 2c'de gösterilmektedir. Bu rakam, bir dayak parakeet kalbin kalp döngüsü sırasında Ca2 + bağlı boya (Rhod-2) yaydığı floresan göstermektedir.

İkinci yöntemde, birleştiricinin çıkışı gerilim akım ve kapasitif geri besleme bir fonksiyonudur (Şekil 2D, 2E ve 2F). Herhangi bir dış aydınlatma ilk ve darbeli LED'den uygulamalı ışık darbeleri ile ikinci: Şekil 2f iki ardışık entegrasyon döngüleri gösterir. Ayrıntılı bir açıklama Şekiller 2G ve 2 içinde sunulmaktadır. Bu yaklaşım, daha zahmetli olmasına rağmen nedeniyle geri kapasitör termal gürültü olmaması daha büyük bir S / N sağlar. enstrüman ikaz ışığı tüm kontrol ve çoğullama üretir ve headstage entegrasyon ve res komutları bir zamanlama aşamasını kapsamaktadıret dönemleri. Bu, genellikle aynı zamanda bir veri bir on-line regresyon hesaplama tarafından entegre çıkış sinyalinin sayısal farklılaşmasını gerçekleştiren bir dijital sinyal işleme devresi ile gerçekleştirilir. bir dirençli geri kullanılması durumunda, bir A / D toplama kartı kullanılabilir.

Son olarak, LFFM tekniği son derece çok yönlüdür ve birden fazla bölgeye kayıt için adapte edilebilir. ışık yolu bir ışın ayırıcı ekleme bize iki fiber optik içine ışık split sağlar. Her optik fiber tel daha sonra eksojen floresan probları bir, bağımsız bir şekilde, tahrik doku ve kayıt emisyon farklı bölgelere yerleştirilebilir. Bu değişiklik fizyolojik değişkenleri nasıl etkilediğini anatomik bölgesel farklılıklar değerlendirmek için bize izin verir. Şekil 3, bu iki fiber optik transmural elektrikli veya hücre içi ölçmek için kullanılan CW uyarma ışık bölmek üzere kullanıldığı bir ışın ayırıcı göstermektedir [Ca2 +] seviyeleri with minör-invaziv. Transmural sinyaller tek endokardiyumda lif ve ventriküler duvar epicardium katmandaki diğer koyarak kaydedilebilir. Bu nedenle, LFFM tekniği farklı bölgelerde hücresel sinyallerin zaman sürecini ölçmek için yeteneği ve bölgesel değişiklikler patolojik durumlar altında meydana test etmek için de kullanılabilir.

Protokol

Bu protokol ve tüm fareler taşıma UC Merced Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (No 2008-201) tarafından onaylandı. parakeets yapılan deneyler Bilimsel Araştırma Venezüella Enstitüsü (Ivic) bilimsel komisyon tarafından kurulan hayvan kullanımı için genel politikalarına göre 1999 yılında yapılmıştır.

1. Langendorff Kurma Hazırlık

  1. 140 NaCl, 5.4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0.33 HPO 4, 10 glukoz, 10 HEPES 2 Na mM aşağıdaki çözünen konsantrasyonlarını ihtiva eden Tyrode çözeltisi hazırlayın. NaOH ile 7.4'e Tyrode çözeltisi pH'sini ayarlamak ve 0.22 um'lik bir filtreden filtre solüsyonu.
  2. 60 mL'lik şırıngalara Tyrode çözeltisi ve 11, 12 Şekil 4'te gösterilen kurulumu yatay Langendorff her boru yerleştirin. tüm hava kabarcıklarını yok etmek için emin olun.
  3. Şekil 4'te gösterildiği gibi, bir batırılmış plastik "hava taş" kullanılarak% 100 O2 ile dengelenmesi Tyrode çözeltisi.
    1. O 2 tanka plastik boru bağlayın.
    2. 60 ml şırınga içinde Tyrode çözeltisi içine 5 "tüp düşürmek için plastik Tee adaptörü ekleyin.
    3. Tyrode çözeltisi içine 2 fokurdayacaktır dışarı O yüzden 5 "borusunun ucuna plastik bir hava taşı takın.
  4. bir kanül olarak kullanılan bir iğne etrafında bir emilemeyen cerrahi sütür yerleştirin. İğne farklı çözümler retro-perfüzyon sağlar, manifold (bakınız Şekil 4) ile birleştirilir. Son olarak, kalbin aort iğne içine kanüle edilecektir.

2. Hayvan Hazırlama ve kalp Diseksiyon

  1. heparin ile fare tartılır ve enjekte (ex. Fare ağırlığı 20 g, 20 adet veya 200 mL enjekte), boyunları kırılarak ötenazi önce 15 dakika. Uyutmak parakeets göre to hayvan kullanımı için IACUC protokolü kılavuzları ve daha sonra servikal dislokasyon ile devam edin.
    NOT: 8 haftalık fareler ya da 20 gr parakeets kullanın.
  2. Euthanization sonra göğüs boşluğunda kalp kaldırmak. Fareler için tarif edildiği gibi aynı şekilde parakeet kalpleri ekstrakte edin.
    1. etanol ile fare göğüs temizleyin.
    2. Diseksiyon makas kullanarak, alt karın bölgesinde bir kesi yapmak ve daha sonra boyun doğru tarafı yukarı kesti.
    3. kesim doku geri çekin ve aşağı pin.
    4. diyaframı kesti. kalbi zarar görmemesi için diyaframın keserken dikkatli olun.
    5. akciğerleri ve çevresindeki doku çıkarın.
    6. sıkarak olmadan kalbini kepçe için cımbız kullanın. mümkün olduğunca uzun süre aorta kesin.
  3. yaklaşık 1 mL Tyrode çözeltisi ile küçük bir tartın teknede kalbi taşıyın.
  4. olmayan bir emilebilir cerrahi sütür kullanarak, üzerinden yatay Langendorff aparat üzerine aorta kravatiğne. İki ince cımbız yardımıyla kalp aort bağlayın. Tyrode çözeltisi içeren 60 ml şırınga ile seri bulunan vanayı açarak retro perfüzyon başlayın.
  5. Kalp 10 dakika süreyle stabilize olmasına izin verin. kan ve boya yüklemeden önce kalbi çevreleyen yağ dokusu temizlemek için bu kez kullanın. cımbız ile kalbin tabanına yakın yağlı doku çekin ve küçük diseksiyon makas kullanarak kesti. Diseksiyon mikroskobu görünümü altında bu yaptığınızdan emin olun.

3. Sitosolik Ca 2 + Ölçümler: Boya Rhod-2AM Hazırlama

  1. boya, 50 ug içeren boya üreticisi tarafından sağlanan özel paket plastik bir şişeye DMSO içinde% 20 Pluronic 20 uL (iyonik olmayan bir yüzey aktif madde) ekleyin.
  2. kabarcıklar kaçınarak, yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
  3. iyonik olmayan yüzey aktif madde ve berrak bir cam şişe içinde özel bir paket plastik şişeden boya ile karışık DMSO aktarın. Tyrode Solu 1 ml ekleyinşeffaf cam şişeye yon.
  4. banyo sonikatör 15-20 dakika süreyle sonikasyon.
  5. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca peristaltik pompalar kullanılarak boya serpmek.
    1. Boya odasında boya yerleştirin.
    2. manifolduna bağlı diğer boru hatları sıkıştırmak için mekanik bir kelepçe kullanın. kelepçe manifoldu üzerine yerleştirilir. Bu 60 ml şırınga bağlı boru içine herhangi bir akışı önlemek olacaktır.
    3. boya dolaşan başlamak için perfüzyon peristaltik pompa açın. Hemen 60 ml şırınga altında 3 yollu vanasını kapatın.
    4. kalbine perfüze edilmiş boya sirküle kalp aşağıdaki emme peristaltik pompaya bağlı olan bir küçük boru yerleştirin.

4. İçi SR Ca 2 + Ölçümler: Boya Mag-Fluo4AM Hazırlama

  1. Rhod-2AM ile aynı şekilde Mag-Fluo4AM hazırlayın. adım adım talimatlar için bölüm 3'e bakınız.
  2. afteboya yükleme r, retro perfüzyon başlamak için Tyrode çözeltisi içeren 60 ml şırınga ile seri bulunan vanayı açın. manifoldu üzerindeki kelepçeyi çıkarmak için emin olun.
  3. Yatay odasına Tyrode çözüm ekleyin ve 37 ° C'ye kadar ısıtın.
  4. 45 dakika Tyrode çözeltisi ile retro-perfuse sitozolik boya kaldırmak için.

5. Membran potansiyeli ölçümü: Boya Di-8-ANEPPS Hazırlama

  1. boya 5 mg içeren boya şişeye% 99 5 ml etanol ekleyin.
  2. Kısım Bir tekrarlayıcı pipet kullanarak 500 ayrı 1 ml plastik şişeleri içine 10 uL.
  3. -20 ° C de hızlı vakum ve mağaza kurutun.
  4. kurutulmuş boya 10 mikrogram ile plastik şişeye 20% 20 uL pluronik DMSO içinde ekleyin.
  5. kabarcıklar kaçınarak, yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
  6. Plastik şişeden taksimatlı bir silindir (10 mL) Pluronic ve boya ile DMSO içeren karışımı aktarın. nihai VO Tyrode çözeltisi ekleyin5 mL lume.
  7. banyo sonikatör 20-25 dakika süreyle sonikasyon.
  8. peristaltik pompalar kullanılarak 30 dakika boyunca kalp içine serpmek. Bölüm 3.5 kademeli talimatlarına bakın.

6. Epikardiyal Sinyalleri Kayıt

  1. boya yükledikten sonra, manifold üstünde kelepçe kaldırarak Tyrode çözeltisi ile kalbi retro serpmek. Tyrode çözeltisi içeren 60 ml şırınga ile seri olarak bulunan vanasını açın. 10 dakika boyunca retro perfuse Tyrode çözüm kalbi stabilize etmek.
  2. Tyrode çözeltisi ile yatay oda doldurun ve 37 ° C banyo sıcaklığının getirmek için Peltier ünitesine açın.
  3. Kalbin yüzeyinde fiber optik yerleştirin.
    1. 2 ml pipet içindeki fiber optik yerleştirin ve sonra bir micromanipulator pipet takın.
    2. Biraz LV yüzeyine karşı fiber optik basın Mikromanipülatör kullanın.
  4. Dışarıdan hea adımlamakBir dalga üreteci tarafından kontrol edilen bir uyarıcı ile rt.
    1. 1 ms genişliğinde bir kare darbe sağlamak için dalga jeneratörü Program.
    2. dışarıdan Senkronize edilecek stimülatörü ayarlayın ve dalga jeneratörü harici girişi bağlayın.
    3. uyarıcısı her çıkışına, sonunda lehimlenmiş bir akupunktur iğnesi ile bir tel bağlayın.
    4. yaklaşık olarak 3 mm birbirinden kalbin üst hem de akupunktur iğneleri yerleştirin.
    5. iğneler dokuda yerleştirilir sonra, elektrik çarpmasını önlemek için stimülatörü çıkışını açmak.
  5. satın alma yazılımında, 10 kHz satın alma frekansını ayarlayın.

7. Endokardial Sinyalleri Kayıt

  1. boya yükledikten sonra kalbi stabilize etmek için 6.1 ve 6.2 adıma bakın.
  2. Fiber optik boyutu hakkında keskin bir 23Ga noktası kullanarak, septum yakın LV kalbin yüzeyinde küçük bir delik yapmak.
  3. mikromanipülatör kullanarak endokarda ilk fiber optik konumlandırılmasına yardımcı olmak için bir intravitreal cerrahi sklerotomi adaptörünü yerleştirin.
  4. Dışarıdan kalbi adımlamak. 6.4 adıma bakın.
  5. satın alma yazılımında, 10 kHz satın alma frekansını ayarlayın.

Sonuçlar

Endokardiyuma ve epikarda AP ve Ca 2 + transientler

ventriküler duvar boyunca sinyalleri karşılaştırmak için, bir fiber optik endokarda konumlandırılmış ve endokard diğer. epicardium gelen biriyle endokarda kaydedilen bir AP morfolojisi karşılaştırılması transmural fonksiyonunu değerlendirmek için en iyi yoldur. vent...

Tartışmalar

Bu yazıda, kardiyak miyositlere ex vivo fonksiyonu değerlendirmek için yerel alan floresan tekniklerini anlatan merkezli. Bir bağlanmış bir ortamda, bu hücrelerin bir çalışma, sadece daha fizyolojik değil, aynı zamanda, organ düzeyinde patolojileri değerlendirmek için son derece uygundur. Eksitasyon-kasılma kaplin (ECC) altında yatan hücresel olaylar hücre içi Ca 2 + dinamiklerini izlemek moleküler probların kullanımı ile tüm organ düzeyinde (Rhod 2 sitozolik Ca 2+,

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Biz sunulan çalışmanın kritik tartışma için Dr. Alicia Mattiazzi teşekkür ederim. Bu çalışma NIH hibe yoluyla (R01 HL-084487) ALE için desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium chlorideSigma7647-14-5
D-(+)-glucoseSigma50-99-7
Potassium chlorideSigma7447-40-7
HEPESSigma7365-45-9
Sodium phosphateSigma10049-21-5
Calcium chloride solutionSigma10043-52-4
Magnesium chloride solutionSigma7786-30-3
Sodium hyrdoxideSigmaS-8045
0.2 μm nylon membrane filterWhatman7402-004
Manifold MPPWarner64-0216 
21G1.5 Precision glide needleB-D305167
Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)AllMech TechLOOK-SP105
Heparin sodium injection 1000USP/mLAllMech TechNDC63323-540-11
DMSO D8779Sigma67-68-5
BlebbistatinSigma856925-71-8
Pluronic F-127 20% solutionBiotium59004
Materflex C/L peristaltic pumpCole-Parmer77122-26
Isostim stimulatorWorld Precision InstrumentsA320RC
Waveform generatorTeledyne LecroyWaveStation 2012
Ultrasonic cleaner FS20Fisher Scientific1533530
Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32"Component SupplyTET-031A
Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32"Component SupplyTET-094A
Adapter luer lock to 3-way valveCole-ParmerEW-31200-80
Tee adapters and plastic fittingsCole-Parmer6365-90
Plastic clampWaterZoo2465
PeltierTE TechnologyTE-127-2.0-2.5
Rhod-2AMThermoFisher ScientificR1245MP
Di-8-ANEPPSThermoFisher ScientificD3167
Mag-Fluo-4AMThermoFisher ScientificM14206
Acupunture needlesLHASATC1.20x13
60 mL BD syringe with luer-lokFisher Scientific14-820-11
LabViewNational Instruments
Speed vacuum Eppendorf VagufugeFisher Scientific07-748-13
Digital signal processing circuit DSP TMS 320Texas Instrument
Longpass Dichroic mirror 567 nmThorLabsDMLP567L
Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard ObjectiveEdmund OpticsStock# 33-437
Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard ObjectiveEdmund OpticsStock# 33-438
Longpass colored glass filter 590 nm ThorLabsFGL590
Green Nd-YAG laser 532 nm, 500 mW
Micromanipulator for laserSiskiyouMX130R
Multimode fiber optic 200 µm NA 0.39ThorLabsFT200UMT
LEDs blueLumiledsL135-B475003500000
LEDs greenLumiledsL135-G525003500000
Cube beam splitter, non-polarizingThorLabsBS007
36" Length, Dovetail Optical RailEdmund Optics54-402
2.5" Width, Dovetail CarrierEdmund Optics54-404
0.75" Travel, micrometer stageEdmund Optics37-983
Dovetail optical rail 3"ThorLabsRLA075/M
Dovetail rail carrier 1"ThorLabsRC1
Avalanche photodiode Helix 902Digi-KeyHELIX-902-200
Objective holder XY Translator ThorLabsST1XY-S
Aluminum breadboard 6" x 6"ThorLabsMB6
Nexus otpical table 4' x 6'ThorLabsT46HK
Stainless steel cap screwsThorLabsHW-KIT5/M
Acrylic  sheetHome Depot/Lowes
Sylgard Silicone elastomer kitDow CorningSylgard 184
Epoxy gel Walmart/Home Depot2-part 5 min clr 1oz
21G1.5 Precision glide needleB-D305167
23G Precision glide needleB-D305145
Mounting base, 25 mm x 75 mm x 10 mmThorLabsBA1/M
Wire shelve posts 36"AleraAALESW59PO36SR
Wire shelvesAleraALESW582424SR
Post and angle clampThorLabsSWC/M-P5
Glass syringe for dye chamberWheatonW851020
Rubber stopperHome Science ToolsCE-STOP01C

Referanslar

  1. Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
  2. Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
  3. Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
  4. Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
  5. Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
  6. Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
  8. Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
  9. Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
  10. Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
  11. Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
  12. Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
  13. Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
  14. Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
  15. Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
  16. Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
  17. Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
  18. Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
  19. Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
  20. Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
  21. Antzelevitch, C., Fish, J. Electrical heterogeneity within the ventricular wall. Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).
  22. Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
  23. Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
  24. Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).
  25. Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H cresel BiyolojiSay 121bozulmam kalpfloresandarbeli yerel alankalsiyumaksiyon potansiyeliRhod 2di 8 ANEPPS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır