导管内送货到兔乳腺

摘要

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

摘要

对于乳腺癌的局部导管的治疗提供了潜在的优势，包括有效递送至肿瘤，并降低全身毒性和副作用^{1，2，3，4，5，6，7。}然而，一些挑战依然存在之前这些处理可以更广泛地应用。在合适的动物模型的发展和导管治疗的有效性促进导管内治疗策略对患者的发展。而小鼠乳腺已被广泛地用作乳腺发育和肿瘤的模型系统中，解剖来自人腺不同。较大的动物模型，如兔，可作为乳腺结构和管内治疗开发一个更好的模型。在Contrast小鼠，在十个由导管树木在空间沿体轴分布，在一个单独的乳头每个终止，兔子乳腺更类似于人类腺，具有多个重叠导管系统该出口通过在一个乳头分开的开口。这里，我们提出了试剂的递送微创方法直接进入兔乳腺导管和用于递送本身具有高分辨率超声波成像的可视化。

引言

治疗剂的导管内输送已经研究了在啮齿动物模型中和在早期的人体试验^{3，4，5，6，11，12。}最近的I期临床试验证明导管内卡铂或女性乳房等待为浸润癌²治疗导管内聚乙二醇化脂质体阿霉素的安全性和可行性。

对导管内输送以前的协议已被开发用于小鼠和大鼠乳腺^{6，7，8，9。}出于研究目的，导管内的肿瘤细胞注射和癌基因的慢病毒载体递送也已在啮齿动物模型中进行的裁判"> ^{13，14，15，16，}但是， 在导管内输送过程的体内模型的理想应允许新的类治疗化合物的发展和促进临床前评估。啮齿动物和人类之间的解剖学差异有复杂的这些翻译学习。

不像小鼠，其中每个管道在一个单独的乳头结束时，人乳腺癌由5至9个独立的导管系统中，每个与奶嘴结束一个单独的开口。兔乳腺怀有四个独立导管系统中，每个分别通过在一个单一的奶头4孔可接触。兔模型更接近人体解剖，并允许导管内给药的研究更相关的情境。

在这里，我们用两种方法来评估导管内交付。的一个共同给予活体染料允许可视化通过皮肤，并提供该方法的一个简单的和快速的确认。对于一些应用，导管的更高分辨率映射可以是优选的。我们在座的管道超声成像协议通过非靶向造影剂的导管内交付。

研究方案

使用动物对象的程序已通过得克萨斯大学奥斯汀分校的机构动物护理和使用委员会。

1.术前准备

1. 记录体重每只兔。如同所有的临床前研究，定期监测动物的重量来评估潜在的毒性。
2. 前麻醉兔子，填充的50mL锥形管与可商购的超声凝胶并在500 xg离心旋转30秒;应在离心结束后的凝胶无可见的气泡。
3. 在剂量为0.75毫克/公斤给药格隆皮下注射，剂量为0.1毫克/千克和乙酰丙嗪肌注。等待15-20分钟的镇静，同时监测生命体征和行为才能生效。
   注:格隆溴铵是防止心动过缓和减少呼吸道和胃肠道分泌物的抗胆碱能剂。乙酰丙嗪是作为一个premedicati镇静剂对麻醉。
4. 施用35毫克/千克氯胺酮和5mg / kg的甲苯噻嗪的皮下作为麻醉剂。但是，随着操作者变得更有经验，并且可以更迅速地完成导管内输送，降低药物剂量以15mg / kg的氯胺酮和3mg / kg的甲苯噻嗪皮下;这会缩短麻醉时间，并为动物从麻醉中恢复所需的时间。
5. 检查并记录心脏率，SPO _2，温度，呼吸频率和粘液膜的颜色，每15分钟。敷眼润滑剂双眼。
   注:只有谁曾接受适当的培训，并已通过其机构的IACUC应该管理或监督人员的麻醉。使用兽医麻醉监视器可以在获取生命体征和推荐帮助。兽医的麻醉监测，但是，并不能取代需要手动检查动物每隔15分钟。请参阅制造商的说明˚F或正确使用兽医显示器。
6. 验证麻醉用温柔的脚趾捏发作;兔子应该在继续之前无响应。
7. 仔细剃兔子的尾腹部周围的第三和第四对腹股沟奶嘴的面积。
8. 与大多数除去毛发，施加过度的计数器脱毛膏到剃区域。删除使用用温水浸湿水的湿纸巾申请后，奶油10分钟。
   注:兔子的皮肤是非常脆弱性/敏感性。脱毛膏应使用不超过10分钟。实际上，这是更安全的在5分钟以尝试"测试点"，如果测试点表示需要一段较长的时间仅在再离开。
9. 用酒精擦拭浸泡的纱布垫清洁注射部位的区域。
10. 放置在其背部的兔子在具有循环温水毯和吸收垫衬一个V形槽。

2.镨造影剂的eparation

1. 根据制造商的说明重组的非靶向对照试剂。移液器上下轻轻混合。
   注意:在这个协议中所使用的造影剂是在室温下搅拌4稳定 - 重构后6小时。轻轻摇动每个检索之间的小瓶。
   注意:被注入的，将取决于管道的数目所需溶液的体积。兔子具有每奶头4导管开口，和0.2毫升的溶液是足以填满一个成年新西兰白兔（Oryctolaguscuniculus）之一导管树。因此，为0.8毫升总体积可以被传递给一个乳腺。

3.乳腺导管内交货

1. 找到合适的奶嘴被注入;推荐腹股沟奶嘴的3 ^次和^第 4 ^次对，如当动物被定位在其背部它们容易可视化。
2. 无菌的0.9％生理盐水的负载0.2毫升1毫升鲁尔锁结核菌素注射器用22克针。妥善处置了22克针的一次生理盐水是在注射器，并用无菌25号针头更换。轻轻地用一个纱布垫85％异丙醇的区域。
3. 用针上并平行于动物的身体的注射器的斜角，插入针的斜角到乳头的侧面和缓缓注入0.1-0.2毫升盐水;这将允许对导管开口的更好的可视化。
4. 负载0.2毫升注射溶液到1毫升鲁尔锁结核菌素注射器。
5. 用拇指和食指轻轻按住乳头，将其抬起稍微将它定位为导管内注射;可穿戴眼放大镜可在可视化导管开口帮助。
6. 在保持乳头的位置抬起，仔细导管插入的使用兴趣将25g钝尖的针管道。
7. 插管后，轻轻一拧就不客气-T的集线器鲁尔锁注射器IP输液针，直到它被锁定就位。
8. 提起乳头并注入溶液慢慢地减少因快速移动的管道内流体的潜在损害;在任何时候注入解决方案时，应该有阻力。

4.超声成像

1. 应用离心超声凝胶的一个自由量的感兴趣的区域的皮肤上。确保有在凝胶中无气泡，因为这些将损害图像质量。
2. 成像深度设置为6毫米。放置在与凝胶接触的21-MHz的换能器和扫描的B模式感兴趣的区域。观察包括导管开放和整个管道的扫描区域的造影剂。
   注意:这些设置已针对与特定光声超声机使用而开发的。请参阅材料表了解更多详情。可能需要调整的发射功率和其它成像系统的成像深度以优化乳腺可视化。
3. 从动物的皮肤用纱布垫除去超声波凝胶。

5.术后护理

1. 观察注射部位:应该没有创伤乳头区域或周围组织的迹象，并在包围乳头区域肿胀可能表示一个乳房脂肪垫注射，而不是一个成功的导管内注射。
2. 将兔子在胸骨位置。如果需要的话，得到0.2毫克/公斤的育亨宾静脉内边缘耳静脉;这将扭转赛拉嗪的影响，并允许动物从麻醉中恢复得更快。
3. 监控兔子整个恢复期每15分钟，直到动物警觉，反应灵敏，并保持胸骨位置。
   注:此过程不应导致组织损伤或肿胀。如果观察到发红或肿胀，管理一个剂量的美洛昔康0.1-0.2毫克/公斤PO一旦动物警觉，并能服用药物口服。为进一步指导联系该机构的兽医人员。

结果

这里，我们表明，对比试剂兔的乳腺导管的导管内输送而不创伤可以实现对组织（ 图2）。家兔，四个单独的导管系统会聚在同一乳头，并且因此可以被访问和使用这种方法单独地成像。个别导管开口容易显现;注意箭头标记相邻于图2B中的空心管的第二导管开口。

与线性成像模式不相关的对比试剂的?...

讨论

可用于超声对比试剂和许多其他的水溶液，包括重要的染料和治疗剂导管内输送到兔的乳腺的此方法。以前的研究已经表明激素^17，18，19的导管内交付。在啮齿动物模型中，核酸⁸的导管内输送，化学治疗^6,7和纳米颗粒的载体^8，20<...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MicroMarker non-targeted contrast reagent	VisualSonics	VS-11694
Luer Lock 1mL Syringes	BD	309628
Glycopyrrolate 0.2mg/mL	Wedgewood Compounding Pharmacy	GLYCOP-INJ013VC	6 month shelf life, supply may be limited.
Atropine Sulfate 0.5 mg/mL	Animal Health International	15320764	If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate.
Ketamine HCL 100mg/mL	Animal Health International	21250699	http://www.animalhealthinternational.com/
Acepromazine 10mg/mL	Animal Health International	17640541
Xylazine 20mg/mL	Animal Health International	20101547
Yohimbine 0.2mg/mL	Animal Health International	14588965
Hair Removing Cream	Veet		Sensitive skin solution. Available through local retailers.
Blunt tip infusion needles	Sai Infusion Technology	B14-50	http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles
Veterinary Pulse Oximeter	EdanUSA	VE-H100B	http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html
Warm Water Pump	Gaymar	TP700
Warm Water Blanket	Animal Health International	21232696	Maxi-Therm Lite Warming Pads
Ultrasound system	VisualSonics	Vevo 2100