토끼 유선으로 관내 배달

요약

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

초록

유방암 췌관 국소 치료는 종양에 대한 효율적인 전달 및 감소 된 독성 및 부작용이 ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7을} 포함한 잠재적 인 이점을 제공한다. 이러한 치료가 더 널리 적용 할 수 있습니다 전에 그러나, 몇 가지 과제가 남아있다. 적절한 동물 모델의 개발과 췌관 치료제의 유효성 검사는 환자 췌관 치료 전략의 개발을 용이하게한다. 마우스 유방 선 널리 유선 종양의 발달 및 모델 시스템으로 사용되었지만, 해부학 인간 동맥 구별된다. 더 큰 동물 모델은 같은 토끼로, 유선 구조 및 췌관 치료 개발을위한 더 나은 모델이 될 수 있습니다. C에서마우스에 ontrast,하는 열 유관 나무 공간적으로 분리 된 유두의 각 종단은 토끼 유방 동맥은 더 밀접하게 한 젖꼭지에 별도의 구멍을 통해 그 출구 여러 중복 유관 시스템과, 인간의 동맥과 유사한 신체의 축을 따라 배포됩니다. 여기서는 직접 유선 토끼 덕트로 고해상도 초음파 영상과 함께 전달 자체의 시각화를위한 시약의 전달을위한 최소 침습적 방법을 제시한다.

서문

치료제의 관내 전달은 설치류 모델에서 초기 및 인간 실험 ^{3, 4, 5, 6, 11, 12에서} 검토되고있다. 공부의 최근 단계는 췌관 카보 플 라틴 또는 침습성 암 ^(2)의 치료를 위해 유방 절제술을 기다리고 여성의 췌관 페 길화 된 리포좀 독소루비신의 안전과 가능성을 보여 주었다.

관내 전달을 위해 이전 프로토콜은 마우스와 랫트 젖샘 ^{6, 7, 8, 9에} 대해 개발되어왔다. 연구 목적, 관내 종양 세포를 주사하고 암 유전자의 렌티 바이러스 벡터 전달에도 설치류 모델에서 수행 된REF "> ^{13, 14, 15, 16.} 그러나 관내 전달 프로세스의 생체 내 모델에서 이상적 치료 화합물의 신규 클래스의 개발을 허용하고 임상 평가를 용이하게한다. 설치류와 인간 사이의 해부학 적 차이는 이들의 번역을 복잡했다 연구.

마우스와는 달리, 각각의 덕트는 별도의 젖꼭지에서 종료하는, 인간의 가슴은 5 ~ 9 독립적 인 유관 시스템, 유두에서 끝나는 별도의 개방 각으로 구성되어 있습니다. 토끼 유방 땀샘은 네 개의 독립 유관 시스템, 하나의 젖꼭지에 네 개의 구멍 중 하나를 통해 각각 개별적으로 접근 항구. 토끼 모델은 더 밀접하게 일치 인체 해부학 및 더 중요한 상황에서 관내 약물 전달 연구를 허용한다.

여기, 우리는 관내 배달을 평가하기 위해이 기술을 사용합니다. (A)의 공동 투여중요한 색소는 피부로 시각화를 허용하고있어서 간단하고 신속하게 확인을 제공한다. 일부 애플리케이션의 경우, 덕트 고해상도 매핑은 바람직 할 수있다. 우리는 비 대상 대조 시약 관내 전달을 통해 여기 덕트의 초음파 영상을위한 프로토콜을 제시한다.

프로토콜

동물의 주제를 사용하는 절차는 텍사스 오스틴 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 수술 전 준비

1. 각각의 토끼의 체중을 기록한다. 모든 임상 시험과 같이, 잠재적 인 독성을 평가하기 위해 정기적으로 동물의 무게를 모니터링한다.
2. 전에 토끼를 마취로, 시중에서 판매하는 초음파 젤 (30)의 500 XG에 스핀 50 ML 원뿔 관을 채우기; 원심 분리 완료시 겔에 가시적 인 거품이 없어야합니다.
3. 0.75 ㎎ / ㎏의 투여 량으로 근육 내 아세 프로 마진, 0.1 ㎎ / ㎏의 용량으로 피하 글리코을 관리하고. 생체 신호와 동작을 모니터링하면서 적용하려면 진정을 위해 15 ~ 20 분을 기다립니다.
   참고 : 글리코은 서맥을 방지하고 호흡과 GI 분비물을 감소시키는 항 콜린성 에이전트입니다. 아세 프로 마진은 premedicati 역할을하는 진정제입니다마취에.
4. 케타민 35 ㎎ / ㎏과 kg의 자일 라진 피하 마취로 5 mg을 /를 관리 할 수 ​​있습니다. 그러나 운전자가 경험하게되고 케타민 3 밀리그램의 / kg 15 mg의 약물 투여 량을 감소, 더 빠르게 췌관 전달을 수행 할 수 / 자일 라진 피하의 kg; 이것은 마취 시간 및 마취에서 회복하는 동물에 필요한 시간을 단축한다.
5. 확인하고 심장 박동, SPO _2, 온도, 호흡, 및 점액 막 색 매 15 분을 기록. 두 눈에 눈 윤활제를 적용합니다.
   참고 : 적절한 훈련을받은 및 관리 또는 마취를 모니터링해야 그 기관의 IACUC에 의해 승인 된 인원 만. 수의사 마취 모니터의 사용은 생체 신호를 수집하고 권장에 도움이 될 수 있습니다. 수의학 마취 모니터 그러나, 수동으로 동물에게 15 분마다 체크를 할 필요를 대체하지 않는다. f를 제조업체의 지침을 참조하십시오또는 수의학 모니터의 적절한 사용.
6. 부드러운 발가락 핀치에 의해 마취의 발병을 확인; 토끼는 계속하기 전에 비 응답해야합니다.
7. 조심 사타구니 유두의 제 3의 형태 및 제 4 쌍의 주변에 토끼의 꼬리 복부를 면도.
8. 제거 된 머리의 대부분으로, 면도 영역에 오버 - 더 - 카운터 제모 크림을 적용합니다. 따뜻한 물에 젖은 축축한 종이 타월을 사용하는 응용 프로그램 후 크림 10 분을 제거합니다.
   참고 : 토끼 피부가 민감한 / 매우 깨지기입니다. 제모 크림은 더 이상 10 분 동안 사용되어야한다. 실제로, 5 분으로 "테스트 지점"을 시도하고 테스트 스폿이 기간이 필요한 더 긴 시간을 나타내는 경우에만 이상에두고 안전하다.
9. 주사 부위를 청소하기 위해 알코올을 적신 거즈 패드 영역을 닦습니다.
10. 순환되는 온수 담요와 흡수 패드 늘어서 V 자형 골에서의 배부에 토끼를 놓습니다.

2. 홍보조영제의 eparation

1. 제조업체의 지시에 따라 타겟팅되지 않은 대조 시약을 재구성한다. 최대 피펫 아래로 부드럽게 혼합.
   주 :이 프로토콜에서 사용되는 조영제 4 실온에서 안정 - 재구성 후 6 시간. 조심스럽게 각 검색 사이의 유리 병 바위.
   주 : 덕트의 수에 의존 할 필요 용액의 부피가 주입된다. 솔루션은 성인 뉴질랜드 화이트 토끼 (Oryctolaguscuniculus) 중 하나 도관 트리를 채우기에 충분하다의 토끼는 유두 당 4 유관 구멍, 0.2 mL로있다. 이에 따라, 0.8 mL의 총 부피는 하나의 유선으로 전달 될 수있다.

3. 췌관 배달

1. 주입 할 수있는 적절한 유두를 찾습니다; 동물이 그것의 배부에 위치 할 때 쉽게 가시화 될 때 사타구니 유두의 3 ^번째 및 4 ^번째 쌍은, 사용하는 것이 좋습니다.
2. 로 멸균 0.9 % 식염수를 0.2 mL의 부하22 G 바늘 1 mL의 루어 잠금 투베르쿨린 주사기. 제대로 식염수를 주사기에 한 번 22 G 바늘 폐기 및 멸균 25 게이지 바늘로 교체합니다. 부드럽게 거즈 패드에 85 % 이소 프로필 알코올로 영역을 닦습니다.
3. 바늘 위로 동물의 몸에 주사기 병렬의 경사에 의해, 유두의 측면에 바늘의 베벨이 삽입 천천히 식염수 0.1-0.2 mL의 주입; 이것은 유관 개구의 더 나은 시각화 수 있습니다.
4. 로드 1 mL의 루어 잠금 투베르쿨린 주사기로 주입 용액 0.2 mL를.
5. 엄지와 검지 손가락으로 부드럽게 유두를 잡고 관내 주입을 위해 위치를 약간 들어 올려; 착용 안구 루페는 도관 개구부를 시각화에 도움이된다.
6. 유두의 상승 위치를 유지하면서 조심스럽게 25 G 뭉툭한 팁 바늘을 사용하여 관심있는 덕트를 cannulate.
7. 삽관 후, 부드럽게 무딘-t의 중심에있는 루어 락 주사기를 비틀제자리에 고정 될 때까지 IP를 주입 바늘.
8. 유두를 들어 올리고 빠르게 덕트 내에서의 유체 이동에 의한 손상을 최소화하기 위해 천천히 용액을 주입; 용액을 주입 할 때 짧은 시간에 저항이 있어야합니다.

4. 초음파 이미징

1. 관심 영역의 피부에 원심 분리 초음파 젤의 자유로운 금액을 적용합니다. 이러한 이미지 품질을 손상되므로, 겔에 기포가 없도록.
2. 6mm에 이미징 깊이를 설정합니다. 겔과 접촉하는 21 MHz의 진동자를 배치하고 B 모드에서 관심 영역을 스캔. 도관 개구 덕트에 걸쳐 포함하는 검사 영역의 조영제를 관찰한다.
   주의 : 이러한 설정은 특정 음향 초음파 장치와 함께 사용하기 위해 개발되었다. 자세한 내용은 재료의 표를 참조하십시오. 이는 유방을 최적화하기 위해 송신 전력 및 다른 이미징 시스템의 촬상 깊이를 조정하는 것이 필요할 수있다그랜드 시각화.
3. 거즈 패드 동물의 피부에서 초음파 젤을 제거합니다.

5. 수술 후 케어

1. 유두 영역이나 주변 조직에 외상 흔적이 없어야하고, 유두 주변 영역에서 팽창하는 것으로 유방 지방 패드에 주입보다는 성공적인 췌관 주입 나타냄 주입 부위를 관찰한다.
2. 흉골 위치에 토끼를 놓습니다. 필요한 경우, 정맥 내 귀 가장자리 정맥 요힘빈 0.2 ㎎ / ㎏을 제공; 이 자일 라진의 효과를 반전하고, 동물이 마취로부터 더 빨리 복구하는 것을 허용 할 것이다.
3. 동물이 응답하는 경보이며, 흉골 위치에 유지 될 때까지 토끼에게 회복 기간 동안 15 분마다 모니터.
   참고 :이 절차는 조직 손상이나 붓기가 발생하지 않아야합니다. 적색 또는 관찰 붓기 경우 동물이 경고와 수되면, 멜 록시 캄 0.1 ~ 0.2 ㎎ / ㎏ PO의 복용량을 관리구두 약을 복용합니다. 추가 지침에 대한 기관의 수의학 직원에게 문의하십시오.

결과

여기서는 토끼 유방 덕트 대조적 시약의 관내 전달은 조직 (도 2)에 충격없이 달성 될 수 있다는 것을 보여준다. 토끼에서, 네 개의 별도의 유관 시스템은 하나의 젖꼭지에 수렴 따라서 액세스 할 수 있으며,이 방법을 사용하여 개별적으로 몇 군데. 개인 유관 구멍이 쉽게 나타나는; 도 2b에서 유관 덕트에 인접한 제 2 도관 개구를 표시 화살촉을 확?...

토론

토끼 유방 선으로 관내 전달하는이 방법은 중요한 염료 및 치료를 포함하여, 초음파 대조 시약 및 기타 수용액에 사용될 수있다. 이전의 연구는 호르몬 ^{17, 18, 19의} 췌관 배달을 증명하고있다. 설치류 모델 핵산 ^(8)의 관내 전달, 화학 요법 제 ^{6, 7,} 나노 캐리어

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MicroMarker non-targeted contrast reagent	VisualSonics	VS-11694
Luer Lock 1 mL Syringes	BD	309628
Glycopyrrolate 0.2 mg/mL	Wedgewood Compounding Pharmacy	GLYCOP-INJ013VC	6 month shelf life, supply may be limited.
Atropine Sulfate 0.5 mg/mL	Animal Health International	15320764	If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate.
Ketamine HCL 100 mg/mL	Animal Health International	21250699	http://www.animalhealthinternational.com/
Acepromazine 10 mg/mL	Animal Health International	17640541
Xylazine 20 mg/mL	Animal Health International	20101547
Yohimbine 0.2 mg/mL	Animal Health International	14588965
Hair Removing Cream	Veet		Sensitive skin solution. Available through local retailers.
Blunt tip infusion needles	Sai Infusion Technology	B14-50	http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles
Veterinary Pulse Oximeter	EdanUSA	VE-H100B	http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html
Warm Water Pump	Gaymar	TP700
Warm Water Blanket	Animal Health International	21232696	Maxi-Therm Lite Warming Pads
Ultrasound system	VisualSonics	Vevo 2100