Внутрипротокового Доставка в Кролика МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

Аннотация

Локализованные внутрипротокового способы лечения рака молочной железы предлагают потенциальные преимущества, в том числе эффективной доставки к опухоли и снижению системной токсичности и побочных эффектов , ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^7. Тем не менее, некоторые проблемы остаются, прежде чем эти методы лечения могут быть применены более широко. Разработка и утверждение внутрипротокового терапии в соответствующей животной модели способствовать развитию внутрипротокового терапевтических стратегий для пациентов. В то время как молочной железы мыши, широко используется в качестве модельной системы молочных желез развития и онкогенеза, анатомия отличается от человеческой железы. Больший модель на животных, таких как кролики, может служить в качестве лучшей модели для структуры молочной железы и внутрипротокового терапевтического развития. В Contrast мышам, в которых десять протоковых деревьев пространственно распределены вдоль оси тела, каждый оконечный в отдельном соске, кролик молочной железы больше напоминает человеческую железу, с несколькими перекрывающимися протоковой системы которые выходят через отдельные отверстия в одном соске. Здесь мы приводим минимально инвазивные методы доставки реагентов непосредственно в кроличьей молочных желез и проток для визуализации самой доставки с ультразвукового изображения с высокой разрешающей способностью.

Введение

Внутрипротоковой доставки терапевтических агентов была изучена в моделях на грызунах и в ранней стадии испытаний на людях ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^11,} ^12. Недавнее исследование фазы I показали безопасность и целесообразность внутрипротокового карбоплатин или внутрипротокового пегилированного липосомального доксорубицина у женщин , ожидающих мастэктомии для лечения инвазивного рака ^2.

Предыдущие протоколы для внутрипротокового поставки были разработаны для мышей и крыс молочных желез ^{^6,} ^{^7,} ^{^8,} ^9. Для исследовательских целей, внутрипротокового инъекции опухолевых клеток и лентивирусов доставки вектора онкогенов также были выполнены в моделях на грызунахисх "> ^13, ^{^14,} ^{^15,} ^16. Тем не менее, идеал в естественных условиях модели внутрипротокового процесса доставки должен разрешить разработку новых классов терапевтических соединений и облегчают доклинические оценку. Анатомические различия между грызунами и людьми усложнили перевод этих исследования.

В отличие от мышей, в котором каждый канал заканчивается в отдельном соске, грудь человек состоит из 5-ти до 9 независимых протоковой систем, каждая из которых имеет отдельное отверстие, заканчивающийся в соске. Кролик молочных желез питают четыре независимых протоков системы, причем каждая по отдельности доступны через один из четырех отверстий в одном соске. Модель кролика более близко соответствует анатомии человека и позволяет изучать внутрипротокового доставки лекарственных средств в более соответствующем контексте.

Здесь мы используем два метода для оценки внутрипротоковая доставки. Совместное введениевитальным красителем позволяет визуализировать через кожу и обеспечивает простое и быстрое подтверждение метода. Для некоторых применений может быть предпочтительным более высокое разрешение отображение каналов. Мы представляем здесь протокол для ультразвуковой визуализации протоков через внутрипротокового доставки контрастного реагента нецелевого.

протокол

Процедуры с использованием предметов животного происхождения были утверждены Институциональный животных по уходу и использованию комитетом Университета штата Техас в Остине по.

1. предоперационной подготовки

Регистрируют вес тела каждого кролика. Как и во всех доклинических исследований, мониторинг веса животных регулярно для оценки потенциальной токсичности.
До обезболивающее кролика, залейте 50 мл коническую трубку с коммерчески доступного геля ультразвука и спина при 500 мкг в течение 30 с; не должно быть никаких видимых пузырьков в геле после завершения центрифугирования.
Администрирование Гликопирролат подкожно в дозе 0,1 мг / кг и Ацепромазин внутримышечно в дозе 0,75 мг / кг. Подождите 15-20 мин для седативного вступили в силу во время мониторинга жизненно важные признаки и поведение.
Примечание: Гликопирролат является анти-холинергические агент, который предотвращает брадикардию и уменьшает секрецию респираторных и GI. Ацепромазин является седативным, который служит в качестве premedicatiна для анестезии.
Администрирование 35 мг / кг кетамина и 5 мг / кг ксилазина подкожно в качестве анестезирующего средства. Тем не менее, поскольку оператор становится более опытным и может выполнить внутрипротоковая доставку более быстро, уменьшить дозировку препарата до 15 мг / кг кетамина и 3 мг / кг ксилазина подкожно; Это позволит сократить время анестезии и время, необходимое для животного, чтобы отойти от анестезии.
Проверить и документировать частоту сердечных сокращений, SPO _2, температуру, частоту дыхания и цвет слизистой оболочки каждые 15 мин. Нанесите глаз смазку на оба глаза.
Примечание: только те сотрудники, прошедшие соответствующую подготовку и были одобрены IACUC их учреждения должны управлять или контролировать анестезии. Использование ветеринарного монитора анестезии может помочь в приобретении жизненно важных признаков и рекомендуется. Ветеринарный монитор анестезии, однако, не заменяет необходимости вручную проверить животное каждые 15 мин. См инструкции изготовителя Fили надлежащее использование ветеринарного монитора.
Проверьте наступление анестезии нежным носочной щепоткой; кролик должен быть нечувствительной перед продолжением.
Тщательно брить хвостового живот кролика в области вокруг третьей и четвертой пар паховых сосков.
С большинством волос удаляется, нанесите более-внебиржевом удаление волос крем на бритой области. Снять крем 10 мин после нанесения с помощью влажных бумажных полотенец, смоченных теплой водой.
Примечание: Кролик кожа очень хрупкой / чувствительной. Крем для удаления волос следует использовать в течение не более 10 мин. На самом деле, это безопаснее, чтобы попробовать "тест-пятно" на 5 минут и только оставить на дольше, если тест пятно указывает на более длительное время, необходимый период.
Протрите область с алкоголем пропитанной марлевые тампоны, чтобы очистить место инъекции.
Поместите кролика на его спинке в V-образный желоб, обшитой с рециркуляцией теплым одеялом воды и впитывающей подушечки.

2. Preparation контрастного вещества

Развести реагент нецелевой контрастности в соответствии с инструкциями изготовителя. Пипетировать вверх и вниз, осторожно перемешать.
Примечание: Контрастное вещество, используемое в данном протоколе стабилен при комнатной температуре в течение 4 - 6 ч после восстановления. Слегка покачивая флакон между каждой извлечения.
Примечание: Объем раствора, необходимого, будет зависеть от количества каналов, которые будут введены. Кролик имеет 4 протоков отверстий на соске и 0,2 мл раствора достаточно , чтобы заполнить один протоковой дерево взрослого Новой Зеландии белого кролика (Oryctolaguscuniculus). Таким образом, общий объем 0,8 мл, может быть доставлен в одну молочную железу.

3. внутрипротокового Доставка

Найдите соответствующие сосков для инъекций; 3 - ^й и 4 - ^й пары паховых сосков рекомендуется, так как они легко визуализировать , когда животное расположено на его спинке.
Нагрузка 0,2 мл стерильного 0,9% физиологического раствора в1 мл Luer-замок туберкулин шприц с иглой 22 G. Утилизировать 22 G иглы, как только физиологический раствор в шприц и заменить его со стерильным 25-го калибра иглы. Аккуратно протрите область с 85% изопропилового спирта на марлевую салфетку.
С скосом иглу и шприц параллельно телу животного, вставьте скос иглы в сторону соска и медленно вводят 0,1-0,2 мл физиологического раствора; это позволит лучше визуализации протоковой отверстий.
Нагрузка 0,2 мл раствора для инъекций в 1 мл Луера туберкулина шприца.
Держите сосок осторожно с большим и указательным пальцами и слегка приподнимите его, чтобы позиционировать его для внутрипротокового инъекции; носимых глазное лупой может помочь в визуализации протоков отверстия.
При сохранении поднятого положения соской, тщательно вводить иглу в канал интереса с использованием 25 G тупым кончиком иглы.
После пункции, аккуратно скрутить шприц Луера на ступице с тупыми тIP вливание иглы, пока не будет зафиксирована на месте.
Поднимите сосок и вводят раствор медленно, чтобы свести к минимуму возможный ущерб от быстро движущейся жидкости внутри канала; в кратчайшие сроки должно ли быть сопротивление при введении раствора.

4. Ультразвуковое исследование

Нанесите либеральное количество геля ультразвукового центрифугирования к коже интересующей области. Убедитесь в том, что нет пузырьков в геле, так как это поставит под угрозу качество изображения.
Установите глубину изображения до 6 мм. Установите датчик на 21 МГц в контакте с гелем и отсканировать интересующую область в B-режиме. Обратите внимание на контрастную среду в проверяемом регионе, включая открытие протоковой и по всему трубопроводу.
Примечание: Эти параметры были разработаны для использования с конкретной фотоакустическом ультразвуковой машины. Обратитесь к таблице материалов для более подробной информации. Это может быть необходимо, чтобы отрегулировать мощность передачи и глубины визуализации других систем обработки изображений для оптимизации молочных железжелезы визуализации.
Удалить ультразвуковой гель из кожи животного с марлевым тампоном.

5. Послеоперационный

Обратите внимание на место инъекции: не должно быть никаких признаков травмы в области сосков или окружающей ткани, и отек в области, окружающей сосок, вероятно, указывает на молочную инъекцию жировой ткани, а не успешный внутрипротоковая инъекции.
Поместите кролика в грудины положении. При необходимости, дают 0,2 мг / кг внутривенно йохимбина в краевую ушную вену; это будет обратный эффект ксилазином и позволить животному быстрее восстановиться после анестезии.
Следить за кролика каждые 15 мин в течение всего восстановительного периода, пока животное не является аварийным, отзывчивый, и поддерживает позицию грудины.
Примечание: Эта процедура не должна приводить к повреждению ткани или набухания. Если покраснение или припухлость наблюдаются, вводить дозу мелоксикама 0,1-0,2 мг / кг перорально один раз животное является аварийным и в состояниипринимать лекарства перорально. Контакты ветеринарный сотрудников медицинского учреждения для дальнейших указаний.

Результаты

Здесь мы покажем , что внутрипротоковой поставка контрастных реагентов к молочных протоков кролика может быть достигнуто без травмы ткани (рисунок 2). У кроликов, четыре отдельных протоковой системы сходятся в одном соске и, таким образом, могут быть доступны ...

Обсуждение

Этот метод внутрипротокового доставки на кролика молочной железы может быть использован для ультразвуковых контрастных реагентов и многих других водных растворах, в том числе жизненно важных красителей и терапевтических средств. Предыдущие исследования продемонстрировали внутрип?...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

The authors acknowledge support from a Translational Breast Cancer Research Grant (14-60-26-BROC to AB) from the Breast Cancer Research Foundation and the American Association for Cancer Research.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MicroMarker non-targeted contrast reagent	VisualSonics	VS-11694
Luer Lock 1 mL Syringes	BD	309628
Glycopyrrolate 0.2 mg/mL	Wedgewood Compounding Pharmacy	GLYCOP-INJ013VC	6 month shelf life, supply may be limited.
Atropine Sulfate 0.5 mg/mL	Animal Health International	15320764	If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate.
Ketamine HCL 100 mg/mL	Animal Health International	21250699	http://www.animalhealthinternational.com/
Acepromazine 10 mg/mL	Animal Health International	17640541
Xylazine 20 mg/mL	Animal Health International	20101547
Yohimbine 0.2 mg/mL	Animal Health International	14588965
Hair Removing Cream	Veet		Sensitive skin solution. Available through local retailers.
Blunt tip infusion needles	Sai Infusion Technology	B14-50	http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles
Veterinary Pulse Oximeter	EdanUSA	VE-H100B	http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html
Warm Water Pump	Gaymar	TP700
Warm Water Blanket	Animal Health International	21232696	Maxi-Therm Lite Warming Pads
Ultrasound system	VisualSonics	Vevo 2100