Entrega Intraductal ao Coelho glândula mamária

Resumo

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

Resumo

Intraductais tratamentos localizados para o cancro da mama oferecem vantagens potenciais, incluindo a entrega eficiente para o tumor e reduziu a toxicidade sistémica e efeitos adversos ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.} No entanto, vários desafios permanecem antes que esses tratamentos podem ser aplicados de forma mais ampla. O desenvolvimento e validação de terapêuticas intraductais em um modelo animal apropriado facilitar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas intraductais para os pacientes. Enquanto a glândula mamaria do rato tem sido amplamente utilizada como um sistema modelo de desenvolvimento mamário e a tumorigénese, a anatomia é distinta da glândula humano. Um modelo animal maior, tal como o coelho, pode servir como modelo para uma melhor estrutura de glândula mamaria e no desenvolvimento terapêutico intraductal. em cOntrast para ratos, em que dez árvores ductal são espacialmente distribuídos ao longo do eixo do corpo, cada uma terminando em uma teta separada, a glândula mamária de coelho mais se assemelha a glândula humana, com vários sistemas sobrepostos ductal que a saída através de aberturas separadas em uma teta. Aqui, apresentamos métodos minimamente invasivos para a entrega de reagentes diretamente no ducto mamário coelho e para visualização do próprio parto com a ultra-sonografia de alta resolução.

Introdução

A entrega intraductal de agentes terapêuticos tem sido estudada em modelos de roedores e em início de carreira testes em humanos ^{3, 4, 5, 6, 11, 12.} A Fase I recente estudo demonstrou a segurança ea viabilidade de carboplatina intraductal ou intraductal doxorrubicina lipossomal peguilada em mulheres que aguardam mastectomia para o tratamento de câncer invasivo ^2.

Protocolos anteriores para entrega intraductal foram desenvolvidos para rato e mamárias de ratos glândulas ^{6, 7, 8, 9.} Para fins de investigação, as injecções de células de tumor intraductal e a entrega de vector lentiviral de oncogenes também foram realizados em modelos de roedoresref "> ^{13, 14, 15, 16.} No entanto, um ideal em modelo vivo do processo de entrega intraductal deve permitir o desenvolvimento de novas classes de compostos terapêuticos e facilitar a avaliação pré-clínica. diferenças anatômicas entre roedores e humanos têm complicado a tradução destes estudos.

Ao contrário dos ratos, em que cada conduta termina a uma tetina separada, da mama humano consiste de 5 a 9 ductais sistemas independentes, cada um com uma abertura separada terminando na tetina. Coelho glândulas mamárias abrigar quatro sistemas ductais independentes, cada um separadamente, acessível através de um de quatro orifícios em uma única tetina. Um modelo de coelho corresponda melhor a anatomia humana e permite o estudo da entrega da droga intraductal em um contexto mais relevante.

Aqui, usamos duas técnicas para avaliar a prestação intraductal. A co-administração de umcorante vital permite a visualização através da pele e fornece uma confirmação simples e rápida do método. Para algumas aplicações, o mapeamento de resolução mais elevado dos ductos podem ser preferidos. Nós apresentamos aqui um protocolo para ultra-sonografia das condutas através da entrega intraductal de um reagente não-alvo contraste.

Protocolo

Procedimentos usando indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade do Texas em Austin.

1. Pré-operatório Preparação

1. Registe o peso do corpo de cada coelho. Tal como acontece com todos os estudos pré-clínicos, monitorar os pesos dos animais regularmente para avaliar a toxicidade potencial.
2. Antes de se anestesiar o coelho, encher um tubo de 50 mL cónico com gel de ultra-sons comercialmente disponível e de centrifugação a 500 xg durante 30 s; não deve haver bolhas visíveis no gel após a conclusão da centrifugação.
3. Administrar glicopirrolato por via subcutânea numa dose de 0,1 mg / kg e acepromazina por via intramuscular numa dose de 0,75 mg / kg. Aguarde 15-20 minutos para o sedativo para entrar em vigor durante o acompanhamento de sinais e comportamentos vitais.
   NOTA: O glicopirrolato é um agente anti-colinérgico que impede bradicardia e reduz respiratórias e secreções gastrointestinais. Acepromazina é um sedativo que serve como um premedicatipor anestesia.
4. Administrar 35 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina por via subcutânea como um anestésico. No entanto, como o operador torna-se mais experiente e pode realizar a entrega intraductal mais rapidamente, diminuir as doses de droga a 15 mg / kg de cetamina e 3 mg / kg de xilazina por via subcutânea; isto irá diminuir o tempo de anestesia e o tempo necessário para o animal a recuperar da anestesia.
5. Verificar e documentar a frequência cardíaca, SPO _2, temperatura, frequência respiratória, e cor membrana mucosa a cada 15 minutos. Aplique lubrificante olho em ambos os olhos.
   NOTA: Apenas pessoal que tenha recebido uma formação adequada e tenham sido aprovados pelo IACUC da sua instituição deve administrar ou controlar a anestesia. A utilização de um monitor de anestesia veterinária pode auxiliar na aquisição de sinais vitais, é recomendada. O monitor de anestesia veterinária, no entanto, não substitui a necessidade de verificar manualmente o animal a cada 15 minutos. Veja as instruções do fabricante fou o uso adequado de um monitor de veterinária.
6. Verifique se o início da anestesia por uma pitada toe suave; o coelho deve ser não-responsivo antes de continuar.
7. Cuidadosamente raspar o abdome caudal do coelho na área em torno do terceiro e quarto pares de tetas inguinais.
8. Com a maioria dos cabelos removidos, aplicar um creme de depilação over-the-counter à área rapada. Retire o creme de 10 min após a aplicação usar toalhas de papel húmidas molhadas com água morna.
   NOTA: pele de coelho é muito frágil / sensível. O creme de depilação deve ser usado para não mais do que 10 min. De facto, é mais seguro para tentar um "ponto de teste" em 5 min e apenas deixar no local já não se teste indica um tempo mais longo é necessário período.
9. Limpe a área com compressas de gaze embebido em álcool para limpar o local da injeção.
10. Coloque o coelho no seu dorso em uma calha em forma de v forrada com um cobertor água morna recirculação e uma almofada absorvente.

2. Preparation do agente de contraste

1. Reconstituir o reagente não-alvo de contraste de acordo com as instruções do fabricante. Pipeta cima e para baixo suavemente para misturar.
   NOTA: O agente de contraste utilizado na presente protocolo é estável à temperatura ambiente durante 4-6 h depois da reconstituição. Agite suavemente o frasco entre cada recuperação.
   NOTA: O volume da solução requerida irá depender do número de condutas a ser injectada. O coelho tem aberturas 4 ductais por tetina, e 0,2 mL de solução é suficiente para preencher uma árvore ductal de um adulto coelho branco da Nova Zelândia (Oryctolaguscuniculus). Assim, um volume total de 0,8 mL pode ser entregue a uma glândula mamaria.

3. Entrega Intraductal

1. Localize as tetas apropriadas a serem injetados; os ^3º e ^4º pares de tetas inguinais são recomendados, pois eles são facilmente visualizados quando o animal é posicionado sobre seu dorso.
2. Carga 0,2 ml de solução salina estéril 0,9% emuma seringa de tuberculina de 1 ml de Luer-lock com uma agulha 22 G. Descarte a agulha G 22 uma vez que a solução salina é na seringa e substituí-lo com uma agulha de calibre 25 estéril. Limpe cuidadosamente a área com 85% de álcool isopropílico em uma gaze.
3. Com o bisel da agulha para cima e a seringa paralela ao corpo do animal, inserir o bisel da agulha para o lado da tetina e injectar lentamente 0,1-0,2 mL de solução salina; isso vai permitir uma melhor visualização das aberturas ductal.
4. Carregar 0,2 ml de solução de injecção para uma seringa de tuberculina de 1 ml de bloqueio Luer.
5. Segure a tetina suavemente com o polegar eo dedo indicador e levante-o ligeiramente para posicioná-la para a injeção intraductal; uma lupa de ocular wearable pode ajudar a visualizar as aberturas ductal.
6. Enquanto se mantém a posição elevada do teto, canular cuidadosamente a conduta de interesse usando uma agulha de ponta romba 25 G.
7. Após punção, gire suavemente a seringa Luer-lock no cubo da franco-tagulha da infusão ip até travar no lugar.
8. Levantar a tetina e injectar a solução lentamente para minimizar o dano potencial causado pelo movimento rápido do fluido no interior da conduta; em nenhum momento deve haver resistência ao injetar a solução.

4. Ecografia

1. Aplique uma quantidade generosa de gel de ultra-som centrifugado para a pele da área de interesse. Certifique-se de que não existem bolhas no gel, como estes irão comprometer a qualidade da imagem.
2. Defina a profundidade da imagem a 6 mm. Posicionar o transdutor de 21 MHz em contacto com o gel e digitalizar a área de interesse em modo-B. Observar o meio de contraste na região digitalizada, inclusive a abertura ductal e ao longo da conduta.
   NOTA: Estas definições foram desenvolvidos para uso com uma máquina de ultra-som fotoacústica específico. Consulte a tabela de materiais para mais detalhes. Pode ser necessário ajustar a potência de transmissão e a profundidade da imagem de outros sistemas de imagem para optimizar mamáriavisualização glândula.
3. Remover o gel de ultra-som da pele do animal com uma almofada de gaze.

5. Cuidados no pós-operatório

1. Observar o local da injecção: não deve haver sinais de trauma para a região da tetina ou para o tecido circundante, e inchaço na área circundante da tetina provavelmente indica uma injecção de almofada de gordura mamaria em vez de uma injecção intraductal bem sucedida.
2. Coloque o coelho numa posição esternal. Se necessário, dar 0,2 mg / kg de ioimbina por via intravenosa na veia marginal da orelha; isto irá reverter o efeito da xilazina e permitir que o animal a recuperar mais rapidamente da anestesia.
3. Monitorar o coelho a cada 15 min durante todo o período de recuperação até que o animal está alerta, ágil e mantém uma posição esternal.
   NOTA: Este procedimento não deve resultar em danos nos tecidos ou inchaço. Se vermelhidão ou inchaço são observados, administrar uma dose de meloxicam de 0,1-0,2 mg / kg, PO, uma vez que o animal é alerta e capazde tomar a medicação por via oral. Entre em contato com o pessoal veterinário da instituição para obter mais orientações.

Resultados

Aqui, mostra-se que a entrega de reagentes intraductal contraste com as condutas mamarias de um coelho pode ser alcançado sem trauma para o tecido (Figura 2). Em coelhos, quatro sistemas ductais separadas convergem para uma tetina e, assim, podem ser acedidos individualmente e fotografada utilizando este método. aberturas ductal individuais são facilmente visualizado; Observe a marcação de uma segunda abertura ductal adjacente à conduta canulada na Figura 2...

Discussão

Este método de entrega intraductal para a glândula mamaria de coelho pode ser utilizada para reagentes de contraste para ultrassons e muitas outras soluções aquosas, incluindo corantes vitais e terapêutica. Estudos anteriores demonstraram a entrega intraductal de hormônios ^{17, 18, 19.} Em modelos de roedores, a entrega intraductal de ácidos nucleicos ^8, quimioterápicos ^6,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MicroMarker non-targeted contrast reagent	VisualSonics	VS-11694
Luer Lock 1mL Syringes	BD	309628
Glycopyrrolate 0.2mg/mL	Wedgewood Compounding Pharmacy	GLYCOP-INJ013VC	6 month shelf life, supply may be limited.
Atropine Sulfate 0.5 mg/mL	Animal Health International	15320764	If glycopyrrolate is unavailable. Not to be combined with glycopyrrolate.
Ketamine HCL 100mg/mL	Animal Health International	21250699	http://www.animalhealthinternational.com/
Acepromazine 10mg/mL	Animal Health International	17640541
Xylazine 20mg/mL	Animal Health International	20101547
Yohimbine 0.2mg/mL	Animal Health International	14588965
Hair Removing Cream	Veet		Sensitive skin solution. Available through local retailers.
Blunt tip infusion needles	Sai Infusion Technology	B14-50	http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles
Veterinary Pulse Oximeter	EdanUSA	VE-H100B	http://www.edanusa.com/Product/VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html
Warm Water Pump	Gaymar	TP700
Warm Water Blanket	Animal Health International	21232696	Maxi-Therm Lite Warming Pads
Ultrasound system	VisualSonics	Vevo 2100