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摘要

为一个新的离子浓度极化（ICP）平台的协议，可以停止ICP区的传播，不管操作条件进行说明。这一独特的平台能力，在于所使用的合并离子耗竭和充实，这是的ICP现象的两个极性。

摘要

离子浓度极化（ICP）的现象是最普遍的方法来预浓缩低丰度的生物样品之一。该ICP诱导带电生物分子（即离子耗尽区）无创性区域和目标可以在此区域的边界上预浓缩。尽管高富集表演使用ICP，它是很难找到的非传播离子耗尽区中的操作条件。为了克服这个狭窄的操作窗口，我们最近开发了spatiotemporally固定富集的新平台。不像前述仅使用离子耗尽的方法，该平台还使用ICP（ 即，离子富集）的极性相反，停止离子耗尽区的传播。通过与耗尽区的富集区面临的两区合并在一起，并停止。在本文中，我们描述了详细的实验协议来建立这个spatiotemporally定义ICP platfORM和它们与常规设备的比较表征新平台的富集动态。定性离子浓度分布和电流 - 时间响应成功捕获合并的ICP和单机ICP之间的不同的动态。在与传统的一个可以仅〜5伏固定富集的位置，新的平台可以在操作条件的宽范围的特定位置产生一个目标冷凝插头:电压（0.5-100 V）中，离子强度（1-100毫摩尔）和pH（3.7-10.3）。

引言

离子浓度极化（ICP）是指在一个选择性渗透膜离子富集和离子耗尽期间发生，导致与离子浓度梯度1,2额外电位降的现象。该浓度梯度是线性的，并作为一个较高电压被施加（欧姆制度），直到在膜上的离子浓度变得更陡接近零（限制性制度）。在此扩散限制条件，梯度（和相应的离子通量）已被公知的最大化/饱和1。超出了这个常规理解，当电压（或电流）进一步增大时，一个overlimiting电流观察到的，与平坦耗尽区和非常尖锐的浓度梯度在区域边界1,3。平坦区具有一个非常低的离子浓度，但表面导电，电osmoti Ç渗流（EOF），和/或电渗透不稳定促进离子通量和诱导overlimiting电流的3，4，5。有趣的是，平耗尽区用作静电屏障，该滤波器滤除6，7，8，9和/或预浓缩目标10，11。由于存在不足量的离子以筛选带电粒子的表面电荷（对于满意的电中性），所述颗粒不能穿过该耗尽区，因此，在其边界排队。该非线性ICP效应是在不同类型的膜10，11，12，13的一个通用的现象，> 14和几何形状6，15，16，17，18，19，20，21;这就是为什么研究人员已经能够开发各类过滤6，7，8，9 富集采用非线性ICP 10，11台设备。

即使有这样的高度的灵活性和健壮性，它仍然是澄清的非线性ICP设备的操作条件的实用的挑战。比较方案的非线性区快速通过阳离子交换膜，这导致阴离子朝向阳极移动的位移去除阳离子。作为一个结果，平耗尽区传播快，这使人想起休克传播22。摩尼等。称这种动态的去离子（或耗竭）冲击23。到在指定的检测位置预浓缩的目标，防止离子耗尽区的扩展是必要的，例如，通过施加EOF或压力驱动流对区扩张24。 Zangle 等。 22澄清ICP传播的标准中的一维模型，它高度依赖于电泳迁移17，离子强度18，pH值25，等等。这表明，适当的操作条件将根据样品条件被改变。

在这里，我们提出详细的设计和实验协议，一个spatiotemp内预浓缩目标的新的ICP平台口服定义的26位。离子耗尽区的扩展是由离子富集区阻断，在一个指定的位置离开静止富集塞，不论工作时间，施加电压，离子强度和pH值。该详细视频协议是为了表明，以阳离子交换膜整合到微流体装置，并表明相比于以往的新ICP平台的富集性能的最简单的方法。

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研究方案

1.阳离子交换膜制造集成微流控芯片

  1. 主人硅的制备
    1. 设计2种硅主人:一种用于图案化的阳离子交换树脂和其他建设有聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道。
      注:几何细节将在步骤1.3.1和1.4.1的描述。
    2. 通过使用常规的光刻和深反应离子蚀刻27制造硅主人。
    3. 在真空罐30分钟Silanize的微图案硅主人与三氯硅烷（〜30μL）。
      注意:三氯氢硅是发火液体是易燃，有急性毒性（吸入，口服）。
  2. PDMS模具的研制
    1. 在一个10混合与固化剂的有机硅弹性体基体:1的比例和放置杯与此未固化的PDMS（30-40毫升为一个4英寸的硅晶片上复制微结构）在真空罐30分钟以除去气泡。
      注:聚硅氧烷基中含有的硅氧烷低聚物与乙烯基和基于铂的催化剂终止。固化剂含有交联具有三个与硅氢化键28的低聚物。
    2. 倒在硅主人未固化的PDMS，用鼓风机除去气泡，并在80℃固化的PDMS用于在对流烘箱2小时。
    3. 从硅主人分离固化的PDMS和适当形状用刀子的PDMS（平方的形状，如在图2a-b所示，ⅳ）。
  3. 图案化该阳离子交换膜
    1. 削减一半的PDMS模具的垂直于两个平行的微通道，并在配备2.0毫米的活检穿孔的PDMS通道的两端打孔。
      注:将PDMS模具用于图案阳离子选择性膜具有两个参数等位基因微通道（宽:100微米;高度:50微米;道间距离:100微米; 图1a）。模具的原始形状可通过镜像沿着切割线切片的模具是可想而知的。 L形的微通道推荐用于冲压的两个孔不重叠。
    2. 清洁载玻片和PDMS模具用胶带和鼓风机，把模具上的玻璃载片，以创建它们之间的可逆附着。
    3. 根据微流图形化技术29，释放〜10微升在通道开口端的阳离子交换树脂已在步骤切片1.3.1（ 图1b）。放置在冲压孔的注射器头并拉动柱塞（ 图1b中的黑色箭头）;温和的负压将拉动阳离子交换树脂，该树脂将填补两个通道。
      注:建议的微通道的高度是大于1581峰; m，由于树脂的粘度高，需要高的压力来填充通道。另一方面，最好是，该高度不超过100微米，由于图案化的离子选择性膜将变得厚于1微米;这种厚的膜可以创建在膜和PDMS通道13之间的间隙。
    4. 分离与PDMS模具不接触有图案的树脂，并放置在加热器的载玻片在95℃下5分钟，以蒸发在树脂中的溶剂。
      注:图案化膜的厚度通常比<1微米以下。模具被轻轻铰接模具的开放式侧分离的（虚线和图1b中的箭头）。最好是填充树脂后，拆下模不到1分钟。如果模具分离的几分钟后，可以得到更厚的膜，但它们将有一个凹形由于毛细作用。
    5. 剥离不必要的用刀片图案化膜的一部分，使得两个分离的线图案（ 图1c）。
      注:此处使用的阳离子交换材料具有全氟化基团，这意味着图案不牢固地结合到玻璃上。因此，简单的旱冰方法可以很容易地除去该膜的不必要的部分。
  4. 所述微通道和膜图形化衬底的集成
    1. 冲在微通道的端部的两个孔，另外两个孔，其中该膜的图案将位于接合的PDMS通道到在步骤1.3制造的膜图形化衬底之后。
      注意:将PDMS微通道具有一个信道（宽度:50-100微米;高:10微米），但它被结合到相邻的信道（ 图1d）的端部。
    2. 在100瓦和50毫乇粘结的PDMS微通道的膜图案化衬底氧等离子体处理后，立即对40秒。
      注意:垂直放置在图案化膜的微通道的中间。

2. ICP富集

  1. 为实验准备
    1. 制备各种测试方案，包括1-100毫米氯化钾，1mM的氯化钠（pH约7），1毫摩尔NaCl和0.2mM的盐酸（pH值〜3.7），1毫摩尔NaCl和0.2mM的氢氧化钠（pH值的混合物的混合物〜 10.3），和1x磷酸盐缓冲的盐水。
    2. 带负电的荧光染料（〜1.55微米）添加到试验溶液。
      注:加入的染料的浓度应比该盐离子（<10微米）的低得多，以使带电的染料不到的电流30，31作出贡献。
    3. 装载在通道中的一个储存器的样品溶液，并应用负压至另一贮存器，以填补与溶液中的信道。由R流体动力连接两个水库eleasing一个大墨滴，以消除沿通道（ 图2a）中的压力梯度。
    4. 填充两个水库，其被连接到阳离子交换模式，使用注射器或移液管，以补偿在油藏的ICP效果缓冲溶液（1M，氯化钾或1M NaCl）中。
    5. 放置导线在水库，跨越两个图案化的膜（在左侧储存器和阴极右侧阳极），并将它们与一个源测量单元（ 图2a）进行连接。
  2. 的ICP现象和ICP富集可视化
    1. 在加载一个倒置落射荧光显微镜的ICP设备。施加电压（0.5100 V）和测量与源测量单元中的电流响应。
    2. 捕获荧光图像与电荷耦合器件照相机和分析利用成像软件32的荧光强度。

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结果

膜集成微流体预浓缩的概略的制造步骤示于图1。的制造的详细描述的协议中给出。在设计和spatiotemporally限定预浓缩26的设备中的图像进行了对比与那些常规的预浓缩11（ 图2）的。在spatiotemporally定义预浓缩的ICP现象的电流-电压-时间响应和荧光强度分布（ 图3-4）而言进行了研究。类似于用单膜预浓?...

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讨论

我们所描述的制造协议和spatiotemporally限定预浓缩的在一个范围内施加电压（0.5-100 V）离子强度（1-100毫米）的性能，和pH值（3.7-10.3），实现了10,000倍在10分钟内的染料与蛋白质的富集。像以前的ICP设备的富集性能变得更高更好的电压和更低的离子强度。我们可以考虑在此一附加参数在两个阳离子交换膜之间的距离。如果我们增加膜间的距离，电场施加相同的电压下降低，从而导致在预浓缩速度

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披露声明

The authors have nothing to disclose.

致谢

This work was supported by the internal fund of the Korea Institute of Science and Technology (2E26180) and by the Next Generation Biomedical Device Platform program, funded by the National Research Foundation of Korea (NRF-2015M3A9E202888).

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Sylgard 184 Silicone Elastomer kitDow Corning
TrichlorosilaneSigma Aldrich175552Highly toxic
Nafion perfluorinated resin, 20 wt%Sigma Aldrich527122
Sodium chlorideSigma Aldrich71394
Potassium chlorideSigma Aldrich60121
Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl esterInvitrogenA20000
Isothiocyanate-conjugated albuminSigma AldrichA9771
Phosphate buffer saline, 1xWengeneLB004-02
Tween 20Sigma AldrichP1379
Epifluorescence microscopeOlympusIX-71
Charged-coupled device cameraHamamtsu Co.ImageEM X2
Source measurement unitKeithley Instruments2635A
Covance-MPFemto Science

参考文献

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