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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo per una nuova piattaforma concentrazione di ioni di polarizzazione (ICP) che può fermare la propagazione della zona ICP, indipendentemente dalle condizioni di funzionamento è descritta. Questa capacità unica della piattaforma risiede nell'utilizzo di fondere mancanza di ioni e l'arricchimento, che sono due polarità del fenomeno ICP.

Abstract

Il fenomeno concentrazione di ioni di polarizzazione (ICP) è uno dei metodi più prevalenti di preconcentrare campioni biologici bassa abbondanza. L'ICP induce una regione non invasivo per biomolecole cariche (cioè la zona mancanza di ioni), e bersagli può essere preconcentrato su questa regione di confine. Nonostante le prestazioni elevate preconcentrazione con ICP, è difficile trovare le condizioni operative delle zone non-moltiplicazione esaurimento di ioni. Per superare questa finestra di funzionamento stretto, abbiamo recentemente sviluppato una nuova piattaforma per preconcentrazione spatiotemporally fisso. Diversamente precedenti metodi che utilizzano solo mancanza di ioni, questa piattaforma utilizza anche la polarità opposta della ICP (cioè, arricchimento ion) per fermare la propagazione della zona di svuotamento ione. Confrontando la zona arricchimento con la zona di svuotamento, le due zone fondono e si fermano. In questo articolo, si descrive un piano sperimentale dettagliato per costruire questo piattaf ICP spatiotemporally definitoorm e caratterizzare la dinamica preconcentrazione della nuova piattaforma confrontandoli con quelli del dispositivo convenzionale. profili di concentrazione di ioni qualitative e le risposte attuali a tempo catturano con successo le diverse dinamiche tra l'ICP fusione e l'ICP stand-alone. In contrasto a quella convenzionale che può fissare la posizione preconcentrazione a soli ~ 5 V, la nuova piattaforma può produrre un plug target-condensato in un luogo specifico nelle ampie gamme di condizioni operative: tensione (0,5-100 V), forza ionica (1-100 mM) e pH (3,7-10,3).

Introduzione

Ion polarizzazione di concentrazione (ICP) si riferisce a un fenomeno che si verifica durante l'arricchimento ionica e mancanza di ioni su una membrana permselective, determinando un calo potenziale supplementare con gradienti di concentrazione di ioni 1, 2. Questo gradiente di concentrazione è lineare, e diventa più pronunciata, una tensione elevata è applicata (regime ohmico) finché la concentrazione di ioni sulla membrana si avvicina a zero (regime di limitazione). In questa condizione di diffusione limitata, il gradiente (e il corrispondente flusso di ioni) è stato conosciuto per essere massimizzata / saturo 1. Oltre questa comprensione convenzionale, quando la tensione (o corrente) è ulteriormente aumentata, una corrente overlimiting si osserva, con zone deplezione piatte e gradienti di concentrazione molto netti alla zona di confine 1, 3. La zona pianeggiante ha una concentrazione molto bassa di ioni, ma la superficie di conduzione, elettro-osmoti flusso c (EOF), e / o l'instabilità elettro-osmotico promuovere flusso di ioni e inducono una overlimiting corrente 3, 4, 5. È interessante notare che la zona di svuotamento piatta serve come una barriera elettrostatica, che filtra 6, 7, 8, 9 e / o preconcentrates riguarda il 10, 11. Poiché non vi è una quantità insufficiente di ioni per schermare le cariche superficiali di particelle cariche (per elettroneutralità soddisfacente), le particelle non possono passare attraverso questa zona di svuotamento e quindi allineano al suo confine. Questo effetto non lineare ICP è un fenomeno generico in vari tipi di membrane 10, 11, 12, 13,> 14 e geometrie 6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21; per questo motivo i ricercatori sono stati in grado di sviluppare vari tipi di filtrazione 6, 7, 8, 9 e preconcentrazione 10, 11 dispositivi che utilizzano il non lineare ICP.

Anche con tale alta flessibilità e robustezza, è ancora una sfida pratica chiarire le condizioni operative per i dispositivi non lineari ICP. Il regime non lineare del ICP rimuove rapidamente cationi attraverso una membrana a scambio cationico, che provoca lo spostamento di anioni muovono verso l'anodo. Come unDi conseguenza, la zona di impoverimento piatta propaga rapidamente, che ricorda di scosse propagazione 22. Mani et al. chiamato questa dinamica la dissalazione (o esaurimento) scioccare 23. Per preconcentrare bersagli in una posizione di rilevamento designato, impedendo l'espansione della zona di svuotamento ione è necessario, ad esempio, applicando EOF o flusso di pressione guidato contro l'espansione zona 24. Zangle et al. 22 chiarito i criteri per ICP propagazione in un modello unidimensionale, e dipende molto mobilità elettroforetica 17, forza ionica 18, pH 25, e così via. Ciò indica che le condizioni operative adeguate saranno modificati in base alle condizioni del campione.

Qui, vi presentiamo progettazione dettagliata e protocolli sperimentali per una nuova piattaforma ICP che preconcentrates obiettivi all'interno di un spatiotempper via orale posizione 26 definita. L'espansione della zona di svuotamento ione è bloccata dalla zona arricchimento ione, lasciando una spina preconcentrazione stazionaria in una posizione assegnata, indipendentemente dal tempo di funzionamento, la tensione applicata, forza ionica e pH. Questo protocollo video dettagliato destinato a mostrare il metodo più semplice per integrare membrane a scambio di cationi in dispositivi microfluidici e per dimostrare le prestazioni preconcentrazione della nuova piattaforma ICP rispetto a quella convenzionale.

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Protocollo

1. Realizzazione di scambio cationico a membrana integrato chip microfluidici

  1. Preparazione di maestri di silicio
    1. Disegno due tipi di maestri silicio: una per patterning una resina a scambio cationico e l'altro per la costruzione di un microcanali con polidimetilsilossano (PDMS).
      NOTA: La geometria dettaglio verrà descritto nei passi 1.3.1 e 1.4.1.
    2. Realizzare i padroni di silicio utilizzando uno fotolitografia convenzionale o profonda ioni reattivi incisione 27.
    3. Silanizzazione maestri silicio micropatterned con triclorosilano (~ 30 mL) in un vaso vuoto per 30 min.
      ATTENZIONE: triclorosilano è un liquido piroforico che è infiammabile e ha una tossicità acuta (inalazione, ingestione orale).
  2. Preparazioni di stampi PDMS
    1. Mescolare una base di elastomero di silicone con un agente indurente in un rapporto di 10: 1 e posizionare la tazza con questo non polimerizzato PDMS(30-40 ml per replicare microstrutture su un 4-in wafer di silicio) in un vaso vuoto per 30 minuti per rimuovere le bolle.
      NOTA: La base di silicone contiene oligomeri silossanici terminanti con gruppi vinilici e di un catalizzatore a base di platino. L'agente indurente contiene reticolazione oligomeri che hanno tre legami silicio-idruro 28.
    2. Versare il PDMS TDS sui padroni di silicio, rimuovere le bolle con un ventilatore, e curare il PDMS a 80 ° C per 2 ore in un forno a convezione.
    3. Staccare i PDMS curate dai maestri silicio e correttamente modellare le PDMS con un coltello (forme squadrate, come mostrato in Figura 2a-b, iv).
  3. Patterning le membrane a scambio cationico
    1. Tagliare metà dello stampo PDMS perpendicolarmente ai due microcanali paralleli e perforare alle estremità dei PDMS canali con un punzone biopsia 2,0-mm.
      NOTA: Lo stampo PDMS per patterning la membrana selettiva cazione ha due parmicrocanali parallela i (larghezza: 100 m; altezza: 50 micron; tra i canali distanza: 100 micron; Figura 1a). L'originale forma dello stampo può essere immaginato rispecchiando stampo tranciato lungo la linea di taglio. microcanali a forma di L sono raccomandate per la punzonatura dei due fori senza sovrapposizioni.
    2. Pulire un vetrino e lo stampo PDMS con nastro adesivo e un ventilatore e mettere lo stampo sul vetrino per creare attaccamento reversibili tra di loro.
    3. Secondo la tecnica microflusso patterning 29, rilascio ~ 10 ml di una resina a scambio cationico in corrispondenza dell'estremità aperta del canale che è stata tagliata in fase 1.3.1 (Figura 1b). Mettere la testa della siringa sui fori e tirare lo stantuffo (frecce nere in figura 1b); una leggera pressione negativa tirerà la resina a scambio cationico, e la resina riempirà i due canali.
      NOTA: Si raccomanda che l'altezza del microcanale è maggiore di 1581; m, poiché l'elevata viscosità della resina richiede alta pressione per riempire i canali. D'altra parte, è preferibile che l'altezza non supera i 100 micron, in quanto la membrana selettiva ione modellata diventerà più spessa di 1 micron; una membrana tale spessore può creare un gap tra la membrana e il canale PDMS 13.
    4. Staccare stampo PDMS senza toccare la resina modellata e posizionare il vetrino sul riscaldatore a 95 ° C per 5 minuti per evaporare il solvente nella resina.
      NOTA: Lo spessore della membrana modellato è solitamente inferiore a <1 um. Lo stampo viene delicatamente rimosso dalla incernieramento dello stampo per il lato aperto (linea tratteggiata e freccia nella Figura 1b). E 'meglio staccare lo stampo inferiore 1 min dopo il riempimento della resina. Se lo stampo viene rimosso dopo pochi minuti, membrane più spesse possono essere ottenuti, ma avrebbero una forma concava per effetto capillare.
    5. Staccare il superfluoparte della membrana modellato con una lametta, facendo due separati formazioni pattern (figura 1c).
      NOTA: Il materiale di scambio cationico usato qui è perfluorurato gruppi, cioè il modello non è fortemente legato al vetro. Pertanto, il metodo palettatura semplice può facilmente rimuovere la parte non necessaria della membrana.
  4. Integrazione del microcanale e il substrato membrana modellato
    1. Punch due fori alle estremità dei microcanali e altri due fori in cui saranno collocati i modelli di membrana dopo l'incollaggio del canale PDMS al substrato membrana modellato fabbricato in fase 1.3.
      Nota: Il microcanali PDMS presenta un canale (larghezza: 50-100 micron; altezza: 10 micron), ma è legato alle estremità del vicino canale (Figura 1d).
    2. Obbligazionario microcanali PDMS al substrato membrana modellato immediatamente dopo il trattamento al plasma di ossigeno per 40 s a 100 W e 50 mTorr.
      NOTA: Posizionare la membrana modellato perpendicolarmente al centro della microcanali.

2. ICP preconcentrazione

  1. Preparazione per l'esperimento
    1. Preparare varie soluzioni di prova, compresi 1-100 mM KCl, 1 mM NaCl (pH ~ 7), la miscela di 1 mM NaCl e 0,2 mM HCl (pH ~ 3.7), la miscela di 1 mM NaCl e 0,2 mM NaOH (pH ~ 10.3), e 1x PBS.
    2. Aggiungere un colorante fluorescente carica negativa (~ 1,55 micron) per le soluzioni di prova.
      NOTA: La concentrazione del colorante aggiunto deve essere molto inferiore a quello degli ioni di sale (<10 micron) in modo che i coloranti applicati non contribuiscono ad una corrente elettrica 30, 31.
    3. Caricare la soluzione campione in un serbatoio del canale e applicare una pressione negativa al altro serbatoio per riempire il canale con la soluzione. Collegare i due serbatoi idrodinamico con releasing una grande goccia per eliminare il gradiente di pressione lungo il canale (Figura 2a).
    4. Riempire i due serbatoi, che sono collegati ai modelli di scambio di cationi, con soluzioni tampone (1 M KCl oppure 1 M NaCl) utilizzando una siringa o una pipetta per compensare l'effetto ICP nei serbatoi.
    5. Posizionare i fili ai serbatoi, attraverso le due membrane modellata (anodo sul serbatoio sinistro e catodo a destra), e collegarli in un'unità di misura sorgente (Figura 2a).
  2. Visualizzazione del fenomeno ICP e ICP preconcentrazione
    1. Caricare il dispositivo ICP su un microscopio a epifluorescenza invertito. Applicare una tensione (0,5100 V) e misurare la risposta corrente in un'unità di misura fonte.
    2. Catturare immagini a fluorescenza con una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica e analizzare l'intensità di fluorescenza utilizzando software di imaging 32.

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Risultati

Le fasi di fabbricazione schematiche di una preconcentratore microfluidica membrana integrato sono mostrati in Figura 1. Una descrizione dettagliata della fabbricazione è dato nel protocollo. I disegni e le immagini di dispositivo della preconcentratore spatiotemporally definito 26 sono contrapposte a quelle di un convenzionale preconcentratore 11 (Figura 2). Il fenomeno ICP nel preconcentratore spatiotemp...

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Discussione

Abbiamo descritto il protocollo di fabbricazione e le prestazioni di un preconcentratore spatiotemporally definita in un intervallo di tensione applicata (0,5-100 V), forza ionica (1-100 mM) e pH (3,7-10,3), ottenendo un 10.000 volte preconcentrazione di coloranti e proteine ​​entro 10 minuti. Come come dispositivi ICP precedenti, le prestazioni preconcentrazione diventa meglio a tensione più alta e in basso a forza ionica. Un ulteriore parametro che possiamo considerare qui è la distanza tra due membrane a scambi...

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

This work was supported by the internal fund of the Korea Institute of Science and Technology (2E26180) and by the Next Generation Biomedical Device Platform program, funded by the National Research Foundation of Korea (NRF-2015M3A9E202888).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Sylgard 184 Silicone Elastomer kitDow Corning
TrichlorosilaneSigma Aldrich175552Highly toxic
Nafion perfluorinated resin, 20 wt%Sigma Aldrich527122
Sodium chlorideSigma Aldrich71394
Potassium chlorideSigma Aldrich60121
Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl esterInvitrogenA20000
Isothiocyanate-conjugated albuminSigma AldrichA9771
Phosphate buffer saline, 1xWengeneLB004-02
Tween 20Sigma AldrichP1379
Epifluorescence microscopeOlympusIX-71
Charged-coupled device cameraHamamtsu Co.ImageEM X2
Source measurement unitKeithley Instruments2635A
Covance-MPFemto Science

Riferimenti

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