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요약

작동 조건에 관계없이 상기 ICP 대역의 전파를 정지 할 수있는 신규 한 이온 농도 분극 (ICP) 플랫폼에 대한 프로토콜을 설명한다. 플랫폼의 독특한 능력은 ICP 현상이 극성은 이온 고갈과 농축, 병합의 사용에있다.

초록

이온 농도 분극 (ICP) 현상은 미량의 생체 시료를 preconcentrate하는 가장 지배적 인 우세한 방법 중 하나입니다. 유도 결합 플라스마 충전 생체 분자 (즉, 이온 고갈 영역)에 대한 비 침습적 영역을 유도하고, 대상은이 지역 경계에 농축 정도 할 수 있습니다. ICP로 농축 높은 성능에도 불구하고, 비 증식 이온 공핍 영역의 동작 조건을 검색하는 것이 곤란하다. 이 좁은 운영 창을 극복하기 위해, 우리는 최근 시공간으로 고정 농축을위한 새로운 플랫폼을 개발했다. 단 이온 고갈 사용 방법 이전과는 달리,이 플랫폼은 이온 공핍 영역의 전파를 중지 ICP (즉, 이온 농축)의 반대 극성을 이용한다. 공핍 영역이있는 농축 영역을 마주하여 두 영역이 함께 병합하고 멈춘다. 본 논문에서는이 시공간으로 정의 ICP의 platf을 구축 할 수있는 자세한 실험 프로토콜을 설명ORM 종래 장치들과 그들을 비교함으로써 새로운 플랫폼의 농축 동력학을 특성화. 질적 이온의 농도 프로파일 및 현재 시간 응답이 성공적으로 병합 ICP 및 독립형 ICP의 다른 다이나믹 캡처. 만 ~ 5 V로 농축 위치를 고정 할 수있는 통상적 인 것과 대조적으로, 새로운 플랫폼은 동작 조건의 넓은 범위 내의 특정 위치에서 목표 응축 플러그를 생성 할 수있다 : 전압 (0.5 내지 V), 이온 강도 (1-100 mM)을하여 pH (3.7-10.3).

서문

이온 농도 분극 (ICP)의 이온 농도 기울기 1, 2 부가 전위 강하의 결과로 이온 투과성 막에 농축 이온 고갈 중에 발생하는 현상을 말한다. 이 농도 구배는 직선이며, 더 높은 전압이 막에 이온 농도까지 (오믹 체제)인가로 급격하게 제로 (제한 체제)에 접근한다. 확산이 제한된 상태에서, 기울기 (및 대응하는 이온 플럭스) / 최대화 한 포화되는 것으로 알려져있다. 전압 (또는 전류) 더 증가 할 때, 종래의 이해를 넘어, overlimiting 전류가 존 경계 1,3- 평평한 공핍 영역과 매우 날카로운 농도 기울기로 관측되었다. 평면 영역은 매우 낮은 이온 농도를 갖고 있지만 표면 전도 전자 osmoti C 흐름 (EOF) 및 / 또는 전기 삼투 불안정 이온 플럭스를 촉진하고 overlimiting 전류 3, 4, 5를 유도한다. 6, 7, 8, 9 및 / 또는 preconcentrates 걸러 정전 장벽, 10, 11을 대상으로 흥미롭게 평탄 공핍 영역이 작용한다. (전기적 중성을 만족 용) 대전 입자의 표면 전하를 선별하는 이온의 양이 부족하기 때문에, 입자가이 공핍 영역을 통과하기 때문에 그 경계에서 줄 수 없다. 이 비선형 ICP 효과는, 막 10, 11, 12, 13, 다양한 종류의 일반적인 현상> 14 기하학 6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21; 연구자 여과 6, 7, 8의 다양한 형태를 개발할 수 있었던 이유는, 9이며 상기 비선형 ICP를 이용하여 10, 11, 농축 장치.

심지어 높은 유연성 및 견고성 여전히 비선형 ICP 장치에 대한 운전 조건을 명확히하기위한 실용적인 도전이다. 유도 결합 플라스마의 비선형 체제 신속 음극쪽으로 이동하는 음이온의 변위를 야기하는 양이온 교환 막을 통해 양이온을 제거한다. 로그 결과, 평탄 공핍 영역은 충격 전파 22 연상하는 빨리 전파한다. 마니 등. 이 역동적 인 탈 이온화 (또는 고갈) (23)를 충격했다. 이온 공핍 영역의 확장을 방지 지정된 위치에서 촬상 대상 preconcentrate 것은 예를 들면, 확장 영역 (24)에 대해 EOF 또는 압력 구동 흐름을 적용하여 필요하다. Zangle 등은. 22은 1 차원 모델에서 ICP 전파 기준을 명확히하고, 고도로 전기 영동 이동도 17, 이온 강도 (18) 등의 pH 25, 및에 의존한다. 이것은 적절한 작동 조건 샘플 조건에 따라 변경 될 것을 나타냅니다.

여기, 우리는 spatiotemp 내 목표를 preconcentrates 신규 ICP 플랫폼을위한 상세 설계 및 실험 프로토콜을 제시구두 위치 (26)을 정의했다. 이온 공핍 영역의 확장이없이 작동 시간의 지정된 위치에 고정 농축 플러그두고 이온 풍부 영역에 의해인가 전압, 이온 강도 및 pH가 차단된다. 상세한 영상 프로토콜은 미세 유체 소자로 양이온 교환막를 통합하고, 종래에 비해 새로운 ICP 플랫폼 농축 성능을 입증하기 위해 단순한 방법을 도시하기위한 것이다.

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프로토콜

양이온 교환 1. 제작 미세 유체 칩을 멤브레인 통합

  1. 실리콘 마스터의 준비
    1. 디자인 실리콘 마스터 두 종류 : 양이온 교환 수지와 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)와 마이크로 채널을 구축하기위한 다른 하나의 패턴.
      주 : 세부 형상은 단계 1.3.1 및 1.4.1에 대해 설명한다.
    2. 종래의 포토 리소그래피 (27)을 에칭 깊은 반응성 이온을 사용하여 실리콘 마스터를 제작.
    3. 30 분 동안 진공 항아리에 트리클로로 실란 (~ 30 μL)와 미세 패턴 실리콘 주인을 silanization합니다.
      주의 : 트리클로로 실란은 가연성이며 급성 독성 (흡입, 경구 섭취)을 가진 자연 발화성 액체이다.
  2. PDMS 금형의 제조
    1. 10에서 경화제와 실리콘 엘라스토머 기재 믹스 : 1의 비율이 미 경화 PDMS로 컵을 배치(30 ~ 40 mL의 실리콘 4의 웨이퍼에 미세 복제에 대한) 30 분 동안 진공 항아리에 거품을 제거합니다.
      주 : 실리콘베이스는 비닐 그룹과 백금 계 촉매로 종료 실록산 올리고머가 포함되어 있습니다. 경화제는 세 가지 실리콘 - 수소 결합 (28)이 올리고머 가교가 포함되어 있습니다.
    2. 실리콘 마스터의 비경 PDMS를 부어 송풍기 거품을 제거하고, 대류 오븐에서 2 시간 동안 80 ° C에서 PDMS 치료.
    3. 칼과 PDMS 모양을 제대로 실리콘 마스터에서 경화 된 PDMS를 분리하고 (그림 2a와 b에 나타낸 바와 같이, 제곱 모양을 ⅳ).
  3. 양이온 교환 막을 패터닝
    1. 상기 두 개의 병렬 미세 채널에 수직 PDMS 몰드의 절반을 절단하여 2.0 mm 생검 펀치로 PDMS 채널의 단부에 구멍을 펀치.
      참고 : 양이온 선택적 막을 패터닝을위한 PDMS 금형은 두 파가하기 병렬 마이크로 채널 (폭 : 100 μm의; 높이 : 50 μm의, 채널 간 거리 : 100 μm의, 그림 1a). 금형의 원래 형상은 절단 선을 따라 주형 분리 미러링 상상 될 수있다. L 모양의 마이크로 채널은 중복없이 두 개의 구멍을 펀칭 권장합니다.
    2. 유리 슬라이드와 테이프로 PDMS 금형 및 송풍기를 청소하고 그들 사이의 가역적 인 첨부 파일을 생성하기 위해 유리 슬라이드에 금형을 넣어.
    3. 마이크로 플로우 패터닝 기술 (29)에 따르면, 단계 분리 된 채널의 개방 단부에서의 양이온 교환 수지 1.3.1 릴리스 ~ 10 μL (도 1B). 펀치 구멍에 주사기 머리를 놓고 플런저 (그림 1b에서 검은 색 화살표)를 당겨; 부드러운 부압 양이온 교환 수지를 끌어, 수지는 두 채널을 채울 것이다.
      주 : 마이크로 채널의 높이보다 큰 15 것을 권장합니다81; m, 수지의 점도가 채널을 채우기 위해 고압을 필요로하기 때문이다. 한편, 패터닝 된 이온 선택성 막보다 두껍게 1 ㎛가되기 때문에 높이가 100 μm의 초과하지 않도록 더 나은; 이러한 두꺼운 막은 막과 PDMS 채널 (13) 사이에 갭을 생성 할 수있다.
    4. 패터닝 된 수지를 건드리지 않고 PDMS 몰드를 분리하고 수지에서 용매를 증발시켜 5 분 동안 95 ℃에서 가열에 유리 슬라이드를 배치했다.
      주 : 상기 패터닝 된 막의 두께는, <1 ㎛보다 일반적으로 작다. 금형 부드럽게 개방형 측에 금형 힌지에 의해 분리 된 (점선와 그림 1b에 화살표)된다. 이 수지를 충전 한 후 금형 미만의 1 분을 분리하는 것이 가장 좋습니다. 몰드 몇 분 후에 분리되는 경우, 두꺼운 막을 얻을 수 있지만 인해 모세관 효과에 오목한 형상을 가질 것이다.
    5. 불필요한 떼어면도날을 가진 패터닝 된 막의 부분을 구분 라인 패턴 (도 1C)를 만드는.
      주 : 여기에 사용 된 양이온 교환 물질은 강, 유리에 접착되지 않는 패턴을 의미하는 그룹 퍼 플루오르있다. 따라서, 간단한 방법 블레이 딩 용이 막의 불필요한 부분을 제거 할 수있다.
  4. 마이크로 멤브레인 패터닝 된 기판의 통합
    1. 마이크로 채널의 말단에 두 개의 구멍을 막 패턴을 단계 130에서 제작 한 막 - 패터닝 된 기판 상에 PDMS 채널 접합 후에 위치 할 다른 두 개의 구멍 펀치.
      주 : PDMS 마이크로 채널이 하나의 채널을 갖는다 (: 50-100 μm의, 높이 : 폭 10 μm의), 그러나 그것은 이웃하는 채널 (도 1D)의 단부에 결합된다.
    2. W (100)와 50 mTorr로 40 초 동안 즉시 산소 플라즈마 처리 후의 박막 패터닝 기판에 PDMS 마이크로 채널 접합.
      주 : 마이크로의 중앙에 수직으로 패턴 막을 놓습니다.

2. ICP 예비 농도

  1. 실험을위한 준비
    1. 1-100 밀리미터의 KCl, 1 mM의 NaCl을 포함하여 여러 시험 용액을 제조 (PH ~ 7), 1 mM의 염화나트륨 및 0.2 mM의 염산 (약 pH 3.7), 1 mM의 염화나트륨 및 0.2 mM의 수산화 나트륨 (PH의 혼합물의 혼합물을 ~ 10.3), 및 1X 인산염 완충 식염수.
    2. 테스트 솔루션에 음으로 하전 된 형광 염료 (~ 1.55 μM)를 추가합니다.
      주 : 염료 충전 전류 (30), (31)에 기여하지 않도록 첨가 된 염료의 농도는 염 이온 (<10 μM)보다 훨씬 낮아야한다.
    3. 상기 채널 중 하나를 저장조의 샘플 용액로드 및 용액과 채널을 채우는 다른 저장조에 부압을 적용한다. 연구에 의해 유체 역학적으로 두 개의 저수지를 연결큰 방울을 eleasing 것은 채널 (도 2a)을 따라 압력 구배를 제거한다.
    4. 저수지의 ICP 효과를 보상하기 위해 주사기 또는 피펫을 사용하여 완충 용액 (1 M KCl을, 1 M의 NaCl)에, 양이온 교환 패턴에 연결되어있는 두 개의 저장조를 채운다.
    5. 두 패턴 화 막 (오른쪽 왼쪽 저장조 캐소드에서 애노드)를 통해 상기 저장소에서 와이어를 배치하고, 소스 측정 유닛 (도 2a)로 연결한다.
  2. 유도 결합 플라스마 현상과 ICP의 농축의 시각화
    1. 반전 표면 형광 현미경에 ICP 장치를로드합니다. 전압 (0.5100 V)를 적용하고, 소스 측정 유닛과 전류 반응을 측정한다.
    2. 전하 결합 소자 카메라로 형광 이미지를 캡처 및 이미징 소프트웨어 (32)를 사용하여 형광 강도를 분석한다.

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결과

멤브레인 통합 마이크로 유체 예비 집 신기의 개략적 인 제조 단계는도 1에 도시된다. 제조에 대한 상세한 설명은 프로토콜에 주어진다. 디자인과 시공간으로 정의 된 예비 집 신기 (26)의 장치 이미지는 종래의 예비 집 신기 (11) (그림 2)의 것과 대조된다. 시공간 정의 된 예비 집 신기의 ICP 현상은 전류 - 전압 응...

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토론

우리는 10,000 배 달성 제조 프로토콜과인가 전압 (0.5 내지 V), 이온 강도 (1-100 mM)을 범위의 시공간 정의 된 예비 집 신기의 성능과의 pH (3.7-10.3)를 설명했다 10 분 내에서 염료 및 단백질의 농축. 이전 ICP 장치 등으로, 농축 성능은 높은 전압에서 더 낮은 이온 강도로된다. 우리가 여기에서 고려할 수있는 하나의 추가 매개 변수는이 양이온 교환막 사이의 거리입니다. 우리는 층간 막 거리를 증가 시키?...

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공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

This work was supported by the internal fund of the Korea Institute of Science and Technology (2E26180) and by the Next Generation Biomedical Device Platform program, funded by the National Research Foundation of Korea (NRF-2015M3A9E202888).

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Sylgard 184 Silicone Elastomer kitDow Corning
TrichlorosilaneSigma Aldrich175552Highly toxic
Nafion perfluorinated resin, 20 wt%Sigma Aldrich527122
Sodium chlorideSigma Aldrich71394
Potassium chlorideSigma Aldrich60121
Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl esterInvitrogenA20000
Isothiocyanate-conjugated albuminSigma AldrichA9771
Phosphate buffer saline, 1xWengeneLB004-02
Tween 20Sigma AldrichP1379
Epifluorescence microscopeOlympusIX-71
Charged-coupled device cameraHamamtsu Co.ImageEM X2
Source measurement unitKeithley Instruments2635A
Covance-MPFemto Science

참고문헌

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